Summary
Aqui nós descrevemos um método para a medição rápida e precisa do desempenho de vôo em Drosophila, permitindo seleção de alto rendimento.
Abstract
Drosophila provou ser um sistema modelo útil para a análise de comportamento, incluindo o vôo. O testador vôo caindo envolvido inicial voa em uma revestido a óleo cilindro graduado; altura de desembarque prevista uma medida de desempenho de vôo, avaliando como moscas longe vai cair antes de produzir o suficiente impulso para fazer contato com a parede do cilindro. Aqui nós descrevemos uma versão atualizada do testador de vôo com quatro grandes melhorias. Primeiro, nós adicionamos um "tubo de queda" para garantir que todas as moscas entrar no cilindro de vôo a uma velocidade semelhante entre ensaios, eliminando a variabilidade entre os usuários. Em segundo lugar, substituiu o revestimento de óleo com folhas de plástico removíveis revestidas em Emaranhado-Trap, um adesivo projetado para capturar insetos vivos. Em terceiro lugar, nós usamos um cilindro de mais tempo para permitir a discriminação mais precisa da capacidade de vôo. Em quarto lugar, usamos uma câmera digital e software de imagem para automatizar a marcação de desempenho de vôo. Estas melhorias permitem o rapid, avaliação quantitativa do comportamento de vôo, útil para grandes conjuntos de dados e telas genéticos de larga escala.
Introduction
Drosophila tem sido utilizado para estudar a base genética de comportamento 1, e os investigadores desenvolveram um número de maneiras para analisar vários tipos de comportamento 2-6. As moscas têm sido particularmente úteis no fornecimento de modelos úteis de distúrbios neuromusculares 7. Um ensaio comum usado para estudar o comportamento locomotor é o desempenho de vôo. O testador vôo original é útil para identificar vôo mutantes defectivos e para a avaliação quantitativa da capacidade voo 1, mas tem várias deficiências que limitam a sua aplicação para as telas de alto rendimento: o uso de cilindros revestidos de petróleo é confuso e complicado, algumas funções, como o comprimento do cilindro e introdução de moscas para dentro do tubo com força variável reduzir a precisão quantitativa e é difícil de recuperar moscas vivo do testador. Para superar essas limitações, nós modificamos o testador vôo para incluir uma série de melhorias. Nós adicionamos uma "gota tuser "a introdução de moscas para eliminar a variabilidade entre experiências e os utilizadores. Usamos folhas de acrílico removível revestido com um adesivo que permite uma mais fácil limpeza e recuperação de moscas individuais. Temos aumentado o comprimento do tubo de voo para melhorar a exactidão quantitativa e fiabilidade. Finalmente , usamos uma câmera digital e software de imagem para calcular as alturas de pouso de moscas. Acreditamos que essas melhorias serão úteis para qualquer laboratório interessado na realização de telas genéticos de larga escala por defeitos no desempenho de vôo.
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Protocol
1. Montar vôo Tester
- Cilindro vôo seguro para Anel Suporte 1 usando grampos cadeia. (Deixe cerca de 3 cm por baixo do cilindro para pesar prato.)
(Nota: O cilindro de vôo que usamos é de 90 cm de comprimento, com um diâmetro de 13,5 cm.) - Insira pesar a cápsula com uma fina camada de óleo mineral por baixo do cilindro de voo.
- Funil Segura para Anel Fique 2, utilizando uma braçadeira de anel e grampo garra. Ajustar a altura do funil de modo a que a parte inferior do funil é alinhada com a parte superior do cilindro de voo. (Nota: o diâmetro da ponta do funil deve ser menor do que o diâmetro exterior dos tubos de ensaio colocados nos tubos de descarga de modo a que os frascos não vai cair.)
- Inserção do tubo de queda para o topo do funil e fixá-lo usando uma braçadeira garra.
(Nota: Nós usamos um tubo de queda que é de 25 cm de comprimento Dropping voar contendo frascos dessa altura permite ejeção consistente de todas as moscas com força uniforme O diâmetro interno do tubo de queda deve ser sligh..tly maior do que o diâmetro externo do frasco para permitir que o frasco de cair livremente.) - Folha de corte (s) de poliacrilamida para o tamanho adequado. (Nota: Para ajudar na colocação e remoção da folha, a largura deve ser ligeiramente menor do que a circunferência interna do cilindro de voo).
- Aplique uma fina camada de Emaranhado-Trap para a folha. Deixe descansar por 1 hora antes de usar. (Nota: Deixe espaço suficiente na parte superior e inferior da folha (aproximadamente 3 cm) não revestido para agarrar a folha para a inserção / remoção.)
- Insira a folha de poliacrilamida no cilindro de vôo.
- Monte a pista câmera usando suportes de pinho. (Nota: garantir que o fundo da pista pode suportar a câmera sem bloquear a lente Consulte a Figura 1B.).
- Adicionar rolhas e parafuso no lugar. (Nota: coloque as rolhas em locais que permitam a câmera para ver toda a folha de plástico no modo panorâmico.)
2. Execute Experiment
- <li> Colete frascos de moscas a serem testadas. Para melhores resultados, usar não mais do que 20 moscas / frasco.
- Bata suavemente voa para baixo do frasco, retire e insira em tubo de queda e liberar frasco.
(Nota: O frasco cai no tubo de queda até atingir a abertura funil estreito Quando o frasco atinge o funil, as moscas são ejetados para dentro do cilindro de vôo.). - Levante o tubo de queda para remover o frasco vazio.
(Nota: Vários frascos de moscas do mesmo grupo de teste pode ser analisada em uma única folha de poliacrilamida Nós achamos que até 200 moscas (10 frascos de 20 moscas cada) pode ser testada e fotografada prontamente em uma única folha.. - Retire a folha de plástico e coloque-o sobre uma superfície branca plana.
(Nota: cartolina branca pode ser usado se bancadas são de cor escura.) - Monte a pista câmera sobre a folha de plástico. A câmara deverá ser suficientemente elevado acima da folha ter tanto a parte superior e inferior da folha, no campo de visão.
- Deslize a câmera junto ªe pista, mantendo o botão "capturar" a adquirir uma imagem panorâmica.
- O número de moscas que aterram no óleo podem ser contados manualmente para cada julgamento.
- Repita os passos de 2,2-2,7 para todas as condições de um determinado experimento. As moscas podem ser removidas da folha entre cada ensaio. Alternativamente, pode ser usado várias folhas, com uma nova folha para cada julgamento.
3. Coleta de Dados
- Abrir arquivos de imagem usando o software ImageJ.
- Corte imagens se necessário incluir apenas a área da superfície de aterragem. (Esta é a área revestida em emaranhado-Trap.)
- Converter imagens de 8-bit em tons de cinza.
- Criar um "Threshold" para filtrar o fundo branco.
(Imagem → Ajustar → Threshold). - Defina os parâmetros para identificar cada mosca utilizando o menu "analisar partículas".
(Analisar → Analisar Partículas) Definir os parâmetros utilizados para identificar uma partícula. Com a nossa criada, nós achamos que utilizar umárea de 5-90 pixels 2 e uma circularidade de 0,4-1,0 irá identificar com precisão todas as amostras. - Medir a localização de cada mosca utilizando a lista gerada de coordenadas de cada partícula. A coordenada x em pixels pode ser convertida para centímetros para calcular a altura da aterragem.
- Importe a tabela em uma planilha eletrônica (como o Microsoft Excel).
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Representative Results
Figura 1A mostra um esquema da montagem testador vôo atualizado. Figura 1B ilustra o projeto de trilha permitem a câmera para tirar uma imagem panorâmica sem bloquear o campo de visão. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2, em que o desempenho de voo de moscas mutantes Slowpoke, que têm um voo conhecidos defeito 8-10, são comparados com o tipo selvagem Canton-S voa. Controle voa consistentemente pousar perto do topo do cilindro, com muito pouca difusão entre os indivíduos e uma altura média de desembarque de 73 ± 2,0 cm. Em contraste, as moscas malandrinho exibir um spread muito mais variado de pouso e terra significativamente mais baixa, com média de 44 ± 4,1 cm. Todas as moscas foram 3 dias de idade, criados à temperatura ambiente (23 ° C).
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Figura 1. Diagramas de vôo Tester, Camera, e Track. (A) Ilustração do estabelecido para o testador de vôo atualizado. Anel Suporte 1 mantém o cilindro vôo 90 cm de altura; Anel Fique 2 mantém o funil eo "tubo de queda" 10 centímetros de comprimento. (B) Diagrama de câmera ea trilha usada para produzir uma imagem panorâmica. A câmera deve ser apoiada pela pista sem obstruir a vista da lente. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Os resultados representativos de um experimento de vôo amostra. Comparação da capacidade de vôo de três dias de idade Cacontrole nton-S voa para Slowpoke mutantes (slo TS1). (A) Tela de captura para as moscas slowpoke e controle exibindo as alturas de pouso de moscas individuais. Cada círculo azul representa o local de uma mosca individual. Estas alturas de aterragem são usados para calcular a altura média de aterragem (B), bem como a distribuição geral (C) para cada genótipo. Moscas machos e fêmeas foram agrupados em cada amostra. As barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Usando os métodos descritos aqui, temos sido capazes de avaliar rapidamente o desempenho de vôo de um grande número de mutantes de Drosophila, proporcionando maior eficiência do que era possível anteriormente. Para nossos experimentos, nós rotineiramente separar machos e fêmeas e criá-los em baixa densidade (menos de 20 moscas / frasco) para limitar a agressão que possa danificar asas. Outra consideração importante é controlar adequadamente as diferenças de desempenho de vôo, devido a diferenças de fundo genético. Nós também achamos que ajuda a permitir que as moscas de um mínimo de 24 horas para se recuperar da anestesia com dióxido de carbono antes do teste de vôo. Alternativamente, as moscas podem ser anestesiados por exposição a temperatura fria (4 ° C) para permitir a recuperação mais rápida, sem potencialmente influenciar o comportamento.
O passo limitante da taxa no presente protocolo é removendo as moscas da folha de plástico entre os ensaios. Um método para aumentar a eficiência é a utilização de um grande número of folhas simultaneamente, deixando de lado as folhas à medida que são utilizados e limpeza-los todos de uma vez após a coleta de dados. As moscas que caem para o fundo necessita de ser contado manualmente, uma vez que não irá ser incluída na folha. Ainda assim, isso é fácil em comparação com o cálculo manualmente altura da aterragem. A necessidade de reaplicar Emaranhado-Trap para cada folha pode variar dependendo da espessura do revestimento é. Em nossa experiência, uma folha indivíduo vai durar um mês antes é necessário um novo revestimento.
Uma vantagem adicional de utilizar Emaranhado-Trap sobre o óleo mineral é a capacidade de recuperar as moscas ao vivo a partir da folha. Uma vez que as moscas simplesmente aderir à superfície do emaranhado-Trap em vez de tornar-se imerso, moscas individuais podem ser facilmente removidas. moscas "Flightless" que caem para a parte inferior também podem ser recuperados através da substituição do tabuleiro de óleo mineral com um frasco vazio.
Nós acreditamos que a medição automatizada de comportamento de vôo descrito aqui fornece um númemero de vantagens em relação aos métodos anteriores, o que permite um maior nível de rendimento, reprodutibilidade e precisão para telas genéticos. Scoring automatizado também tem sido utilizada para aumentar o rendimento para os ensaios de comportamento, tais como o ensaio de anel 11. Além disso, a medição direta da altura pouso proporciona uma maior sensibilidade do que uma simples medição de aprovação / reprovação (% panfletos, etc.), O que nos permite detectar diferenças mais sutis no desempenho de vôo.
O ensaio descrito aqui pode ser complementada por outras análises posteriores que medem aspectos mais complexos do comportamento de vôo, incluindo o controle visual da velocidade de vôo de 12 e as respostas de vôo livre ao movimento 13. Embora estes testes são mais demorada e não passíveis de telas genéticos de larga escala, eles podem ajudar a fornecer mais informações sobre a função de um determinado gene em uma resposta locomotor.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede F32 NS078958 (DTB) e R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
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