Summary
우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.
Abstract
전자 크라이 단층 촬영 분자 세부에서 세포 소기관, 막 소포, 또는 바이러스와 같은 생물학적 샘플의 입체 구조를 시각화 할 수있는 구조 생물학에 강력한 도구이다. 이를 위해 수성 샘플은 빠르게 확대에 네이티브, 냉동 수화 상태를 유지 액체 에탄에서 유리화된다. 전자 현미경에서, 틸트 시리즈는 3D 단층 촬영이 재구성되는 액체 질소 온도에서 기록된다. 단층 볼륨의 신호 대 잡음비는 본질적으로 낮다. 인식 할 수있는, 반복 기능은 개별 서브 볼륨은 잘라 정렬 및 소음을 줄이기 위해 평균을하는 subtomogram 평균화에 의해 강화된다. 이러한 방식으로, 3D를 얻을 수 나노 미터 또는 그 이상의 해상도로 매핑한다. 3D 볼륨 이용할 고해상도 구조 착용감은 그 나라의 환경에서 단백질 복합체의 원자 모델을 생성한다. 여기에서 우리는 우리가 전자 크라이 tomograp를 사용하는 방법을 보여줍니다숨바꼭질은 미토콘드리아에서 큰 막 단백질 복합체의 현장에서 조직을 연구한다. 우리는 단지 I 임의로 행 양쪽 멤브레인 영역에 분포되어있는 반면 ATP 합성 효소는, 막 내부의 높은 cristae 곡선을 따라 정점 다이머의 행이 구성되는 것을 알. subtomogram 평균으로 우리는 cristae 막 내 미토콘드리아 ATP 합성 효소 이량 체의 구조를 획득했습니다.
Introduction
미토콘드리아는 세포의 전원 주택. 화학 결합 에너지로 미토콘드리아 내막에 걸쳐 전기 양성자 구배를 변환함으로써, 미토콘드리아 ATP 합성 효소는 세포 프로세스를 구동하는 ATP의 대부분을 생산하고 있습니다. 미토콘드리아 에너지 변환 뒤에 메커니즘을 이해하기 위해, 우리는 시츄 ATP 합성 효소의 구조를 결정하고, 그 배치 및 미토콘드리아 내막에 분포되는 방법을 알 필요가있다. 전체 복합체 (4)의 미토콘드리아 ATP 합성 효소 성분 1-3 및 저해상도 맵 대부분의 고해상도 구조를 사용할 수 있지만, 막에 작용 효소의 구조와 형태를 설정하는 것이 중요하다. 미토콘드리아 내막에서 ATP 합성 효소의 분포는 광범위하게 랜덤 인 것으로 가정하지만, 6이 톤되지 않은 것으로 나타났다 (5) 및 자체의 초기 결과를 발견 한 초기그는 케이스. 전자 수송 체인의 프로톤 펌프 양쪽에 위치하도록 표시하는 동안 후속 우리 그룹에서의 연구와 다른 7 ATP 합성 효소는 미토콘드리아 내막의 cristae 8 밀접 만곡 능선을 따라 이량 체의 긴 행으로 배열되어 있음을 확인했다 행 9. 이 배열은 미토콘드리아의 에너지 전환의 메커니즘에 대한 중요한 의미를 가지고있다.
우리는이 배열을 결정하는 데 사용한 기술은 전자 크라이 단층 촬영 (크라이 동부 표준시)입니다. 곳을 알아내는-ET는 현재 분자 해상도에서 세포, 세포 구획 또는 세포 내 소기관의 정확한 3 차원 (3D) 볼륨을 제공하는 유일한 방법입니다. 막이 좋은 대조와 함께 표시 및 3D 단층 촬영 볼륨에 손쉽게 추적 할 수 있기 때문에 곳을 알아내는-ET는 생체막 큰 단지를 공부에 특히 적합하다.
다른 방법은 세포 또는 organell의 3 차원 구조를 연구하기 위해ES는 분자 세부 사항을 제공하지 않습니다. 수퍼 - 해상도 광 현미경 (10), (11)는 위치 나 내지 수십 정밀도 관심 단백질에 부착 된 발광 라벨 사이의 거리를 드러내는에서 최상의이지만, 심지어 낮은 해상도, 단백질 자체의 구조를 공개하지 않는다 . 플라스틱 내장 된 생물학적 시료의 전자 현미경 (13)를 스캔하여 시리얼 섹션 12 블록 얼굴 영상의 투과 전자 현미경은 세포 볼륨의 저해상도 뷰를 제공하지만 이와 같이 분자 세부 사항을 공개하지 않습니다. 원자력 현미경 (14)는 원칙적으로, 분자 또는 원자 분해능을 제공하지만, 유일한 원자 적으로 평평한, 고체 지지체 상에 물체의 표면에있다. 마지막으로, X-선 단층 촬영 (15) 또는 자유 전자 레이저로부터의 강한 X 선 펄스의 산란은 16 m 등의 전체 세포 또는 세포 내 소기관으로 크고 복잡한 오브젝트의 비 주기적 구조를 공개하지 않을 것이다가까운 미래에 olecular 해상도입니다. 따라서 현재 나노 미터 해상도로 세포 나 세포 소기관의 3D 구조의 연구에-ET를 알아내는 할 대안이 없다.
극저온 ET는 핵공 복합체 17 인플루엔자 스파이크 18 복합체를 포함한 막 - 관련 단백질 어셈블리의 구조 및 형태를 조사하기위한 선택의 방법 및 편모 모터 단백질 (22), (23)뿐만 아니라 전체의 균체 19의 조직이다 세포 20-23에 이러한 HIV와 같은 병원성 바이러스 및 항목. 곳을 알아내는-ET는 액틴 필라멘트 (24) 또는 axonemes (25)를 포함하여 사상 단백질과 세포의 상호 작용을 시각화 헤아릴 수 없다. 해상도는 반복, 일반 기능의 서브 볼륨이 단일 입자 이미지 프로에 의해 단층 볼륨에서 잘라 평균을함으로써 subtomogram는, 26의 평균을 2 나노 미터 또는 그 이상으로 향상 될 수있다프로세싱 기술.
극저온 ET는 투과형 전자 현미경 (TEM)에 다른 경사 각도에서 찍은 얇은 시험편 (<250 ㎚)의 투영 이미지의 시리즈의 획득을 포함한다. 물질과 강하게 상호 작용하는 전자, 한 번만 더 흩어져되지 않도록 표본은 얇은해야합니다. 다중 산란 해석 결과 이미지가 어렵와 대비를 줄일 수 있습니다. 시험편 선택된 영역의 이미지는 각각 서로에 대해 정렬 및 시험편의 3D 볼륨을 생성하는 적절한 컴퓨터 프로그램에 의해 3 차원 공간에 투영한다. 이미지의 배향은 동결에 앞서 샘플과 혼합 금 기준 마커에 의해 도움을 받는다. 이상적으로는 10 개 이상의 균일하게 분포 된 기준 마커는 좋은 정렬하기 위해 각 이미지에 존재해야한다.
분자 세부 사항을 준수하기 위해, 샘플 플 런지 냉동 그 나라의 수화 상태를 유지 액체 에탄,에 있습니다. 액체 동결에탄이 너무 빨리 (5 ~ 10 ° C / 초) 물이 결정화하지만, 유리화, 유리 같은 상태로 유지되지 않습니다 27. 얼음 결정 형성 손해에게 중요한 생물학적 구조. 생물학적 시료는 방사선 손상으로 고통 같이, 시험편 견딜 수 산란 이벤트의 총 수에 한계가있다. 이미지 따라서 저용량 모드에서 획득됩니다 관심의 영역은 한 전자 아래의 전자 량 낮은 배율 (1,500X)에서 확인됩니다 - / 나노 미터 (검색 모드). 화상이어서 관심 (포커스 모드)의 면적 떨어져 높은 배율로 집중된다. 화상이 획득되는 경우에만, 관심 영역은 높은 전자 선량 (노광 모드)로 조사된다.
여기서는 예로서 미토콘드리아 내막에서 ATP 합성 효소를 사용하여 이량 체, 수집 및 처리 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 개요를 제시한다. 다음 프로토콜은 크라이 ET에 대한 미토콘드리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다, 어떻게 설정하는및 특정 전체 전자 선량 방법 및 관심 영역의 3D 용적을 구하는 일련의 경사를 함께 처리하는 일련의 경사를 수집. 절차의 개요가도 1에 도시되어있다.
Protocol
차등 원심 분리하여 세포 나 조직에서 미토콘드리아의 1 준비
이 섹션에서는 다양한 진핵 생물에서 그대로 미토콘드리아의 분리에 대한 일반적인 절차를 설명합니다. 버퍼 구성 요소 및 원심 분리 속도 정확한 각 조직에 최적화 될 필요가 / 종 공부했다.
- 등장 성 완충액으로 세포를 분해 (예를 들어, 250 mM의 수 크로스, 10 mM의 HEPES pH를 7.4), 유리 비드 밀을 사용하여 (진균 균사체) 28, 효소 칸막이 벽 (사카로 미세스 세 레비 시아) 29, 볼베어링 균질의 소화 (단일 -cell 진핵 세포 / 세포를 배양 / 선충) 30 또는 믹서 (동물 또는 식물 조직) 31.
- 저속 원심 분리 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분) 다음 모슬린을 통해 여과에 의해 세포 파편을 제거합니다.
- 9000 XG, 4 ° C (고속 원심 분리하여 상층 액과 펠릿 미토콘드리아를 수집, 10 분).
- 필요한 경우, 미토콘드리아 부분 (32)의 추가 정제 등장 밀도 단계 그라데이션을 사용합니다.
전자 곳을 알아내는-단층 촬영 미토콘드리아의 2 준비
다음 섹션에서는 극저온 ET에 대한 동결 수화 샘플을 구하는 방법에 대해 설명합니다. 참고 :이 방법은 피부에 심한 화상을 입을 수 있습니다 매우 차가운 액체 질소 및 에탄의 사용을 포함한다. 안전 고글과 냉동 보호 장갑을 착용해야합니다. 또한 가연성 액체 에탄, 흄 후드에서 처리해야합니다.
- 250 mM의 트레 할로 오스, 약 5 ㎎ / ㎖의 총 단백질 농도에 pH가 7.4에서 10 mM의 HEPES 버퍼에 펠렛을 재현 탁 미토콘드리아.
- 글로우 방전 구멍 투성이의 탄소 EM 그리드, 제조업체의 지침에 따라 진공 장치 탄소 사이드.
- 액체 질소 냉각의 내측 상 에탄 가스의 스트림을 지향함으로써 에탄의 몇 밀리미터를 액화에드 알루미늄 컨테이너입니다.
- 미토콘드리아 현탁액으로 한 즉시 핀셋에서 개최 글로우 방전 EM 그리드에 3 μl를 적용 단백질 공역 금 기점 정지 1을 섞는다.
- 유리화 장치, 예를 들면, 집에서 만든 단두대에 핀셋을 놓습니다. 여과지의 웨지 (~ 5 초 또는 액체 정지 확산 될 때까지) 즉시 트리거를 해제하여 액체 에탄으로 격자를 뛰어 물기를시킨다.
- 액체 질소로 액체 에탄에서 그리드를 전송합니다. 전송하는 동안 필터 종이 그리드에서 초과 에탄을 제거합니다. 액체 에탄에 여과지의 쐐기 형 부분의 선단부를 배치했다. 액체 에탄 상승으로 조심스럽게 여과지까지 그리드를 끌어하지만 액체 앞에 아래에 보관하십시오. 액체 에탄은 모세관 작용에 의해 격자로부터 제거되고 모든 에탄 액체가 제거 된 후, 액체 질소로 즉시 눈금을 전송한다.
- , 그리드 스토리지 상자에 유리화 그리드를 배치차 적절한 나중에 사용하기 위해 액체 질소에서 보관하십시오.
단층 촬영 틸트 시리즈의 3 녹화
다음 섹션은 설정 및 사후 열 에너지 필터와 CCD 카메라가 장착 Polara 전자 현미경 미토콘드리아의 단층 틸트 시리즈를 수집하는 방법을 설명합니다. 비슷한 프로토콜은 CCD 또는 직접 전자 감지기 카메라가 장착 모든 전자 크라이 현미경에 사용됩니다.
- 현미경을 맞 춥니 다
- 테스트를 삽입 시편 예를 들면, 흑연, 구멍 투성이의 탄소 필름에 골드 섬.
- 현미경의 저용량 시스템에서 선택 검색 모드.
- eucentric 높이로 샘플을 가져와. 시편 홀더를 틸팅 할 때 최소한의 XY 운동의 포인트이다. , 0 ° 기울기에 관심 지점을 중앙에 20 °로 무대를 기울 Z-높이를 변경하여 포인트를 다시 중심에. 0 °로 돌아가서 측면 오프셋 (offset)이 최소화 될 때까지 반복합니다.
- 선택노출 모드. 단층 화상을 수집하기 위해 원하는 배율을 선택 (예를 들어, 픽셀 크기 견본 ≈ 0.6 nm의 검출기에 25,000X).
- 작은 응축기 구경 (50-70mm)를 선택하고, 상기 빔은 촬상 소자보다 단지 넓은 60 (E)의 픽셀 판독 제공되도록 스폿 크기와 빔의 강도를 선택 - / 픽셀 (CCD) 또는 (14) 전자 - / 픽셀 / 초 (직접 전자 검출기, 계산 모드).
- 센터 콘덴서 구경.
- 가우스 초점 예를 들어, 최소한의 대비 점을 찾을 수 있습니다. 리셋 현미경 디 포커스 읽기와 올바른 피벗 포인트 및 제조업체의 지침에 따라 회전 중심.
- 단층를 기록 원하는 디 포커스에 전화를 겁니다. 참고 : 로우 디 포커스 (2-4 μm의)는 명암의 비용으로 해상도를 증가하는 반면 높은 디 포커스 (8 μm의)는 명암을 증가 시키지만 해상도를 줄일 수 있습니다.
- 빈 구멍이 지남에 따라 제조사의 이득을 새로운 레퍼런스를 생성 및 에너지 필터를 정렬지침.
- 검색과 노출 모드를 맞 춥니 다. 노광 모드에서, 관심있는 지점을 중심으로하고 검색 모드로 전환. 선택 1,500X의 배율 (감지기 시편의 0.033 μm의 / 픽셀) 및 (증가 대비) 100 μm 인 디 포커스. 이미지 시프트 코일을 사용하여 중앙에 관심을 다시 지점을 만듭니다.
- / 픽셀 (CCD) 또는 ~ 8 E - - 빔 촬상 장치보다 단지 넓은 20 E ~의 화소 판독 제공되도록 탐색 모드에서, 스폿 크기와 빔의 강도를 조정 / 픽셀 / 초 (직접 전자 검출기, ) 모드를 계산합니다.
- 좋은 표본 지역 찾기
- 액체 질소 온도에서의 전자 현미경에 냉동 수화 미토콘드리아와 그리드를 삽입 (EM 제조업체의 지침 참조).
- 탐색 모드에서, 적절한 얼음 두께 및 품질의 시험편 개 그리드 검색. 단층 수집에 대한 적합성을 결정하기 위해 유망 지역의 6 초 검색 이미지를 가져 가라. 봇시간은 내부 및 외부 미토콘드리아 막이 배율로 볼 수 있어야합니다.
- 단층 촬영 틸트 시리즈의 기록
- 좋은 표본 영역이 발견되면 60 °가 노출 장애물없이 사용할 수있는 최대 틸트 범위를 결정하거나 그리드 막대 또는 얼음 덩어리로 영역을 초점을 ±, 무대를 기울입니다.
- /의 CCD 또는 6-8 전자에 대한 픽셀 - - 유사한 모양의 근처의 얼음이 가득한 홀에서 각각의 촬영 된 이미지는 30 ~ 50 전자의 전자 량을 가지고있는 빔 강도 또는 영상 획득 시간을 노출 모드로 변경 및 조정 / 픽셀 / 계산 모드, 직접 전자 감지기를에요.
- 60 ° 이미지의 그와 0 °에서 획득 한 초 이미지의 평균 전자 수를 나누어 선량 분포 비율 (I 0 / I 60)를 계산합니다. 이 비율 (노출 시간 = 1 / C 경사각이 증가함에 따라 이미지 당 일정한 수의 전자를 유지하는 데 필요한 노출 시간의 증가를 설명운영 체제 (α) N 위치 (I 0 / I 60) = 2 n)을 포함 할 수있다. 비도 얼음 두께의 좋은 지표 역할을한다. 미토콘드리아의 좋은 단층 촬영은 일반적으로 I 0 / I 60 = 2.3-2.6로 기록됩니다.
- 빈 구멍을 통해, 노출 모드에서 1 초 이미지를 획득하고이 당 전자의 수를 확인합니다. 고려 선량 분포 비 복용 특정 전체 전자 선량에 대해 기록 할 수있는 이미지의 총 수를 계산한다 (예를 들면, <40 전자 - 구조 결정 용 / A 2 ~ 160 전자 - 모폴로지 대 / 2).
- 전체 기울기 범위를 분할함으로써 단층 컬렉션에 대한 적절한 경사 구간을 결정한다 (예를 들어, ± 60 °, 120 °) 3.3.4에서 계산 된 이미지의 전체 개수에 의해.
- 설정하고 적절한 자동 데이터 수집 소프트웨어 3를 사용하여 위의 결정 매개 변수를 사용하여 단층을 기록3, 34. 틸트 시리즈는 일반적으로 ± 20 °에서 시작하여 증가하는 전자 투여에 의해 파괴되어 낮은 기울기 이미지의 정보 내용을 극대화하기 위해 높은 경사에 도달하기 전에 공 °를 통해 이동합니다.
(4) 작성 및 단층 촬영 볼륨의 분할
이 섹션에서는 미토콘드리아의 단층 볼륨이 기울기 시리즈와 볼륨이 일반적으로보기에 존재하는 방법에서 생성되는 방법에 대해 설명합니다.
- 해당 디렉토리에 단층 일련의 경사를 저장합니다. 이미지 스택을 생성하고 MRC 스택에 .dm3, .dm4 또는이 .tif 파일을 변환 등 dm2mrc 또는 tif2mrc (IMOD 패키지)와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 적절한 파일 형식을 변환합니다. MRC 스택은 IMOD (35) 단층 재건이 필요합니다. 기타 패키지는 다른 형식이 필요합니다.
- (이미지를 정렬하고 IMOD 자습서에 설명 된 단계를 수행하여 단층을 생성
- IMOD 배포 비선형 이방성 확산 필터를 이용하여 단층 화상의 콘트라스트를 향상시킨다. 이 필터는 멤브레인 및 ATP 합성 효소로 막 관련된 입자에 적합합니다.
- 시각화를 들어, 수동으로 세그먼트 단층 촬영, 예를 들어 아미라를 상업적으로 이용 가능한 프로그램을 사용. 내부 또는 외부 막에 해당하는 복셀을 할당하고 표면을 생성합니다. AMIRA 36 EM 패키지 플러그인에 식자 옵션을 사용하여 ATP 신타 입자의 위치를 표시한다.
5 Subtomogram의 ATP 합성 효소 이량 체의 평균화 및 X-레이 구조의 피팅
다음 섹션에서는 ATP 합성 효소 이량 체의 subtomogram 평균을 얻을 수있는 방법에 대해 설명합니다.
- 이러한 '부위와 같은 입력 및 적절한 소프트웨어 패키지로서 표시된 입자를 사용전자 단층 촬영 '프로그램에 대한 icle 평가, subtomogram 평균을 계산합니다.
- 해상도 추정치를 들어, 푸리에 쉘의 상관 관계 (37)에 의해이 독립적으로 결정 subtomogram 평균을 비교합니다.
- 강체 의해 subtomogram 평균적으로 가능한 독 알려진 X-선 구조는 수동 또는 피팅 프로그램 키메라 38에서와 같이 자동 순차 도킹 루틴을 사용하는 경우.
Representative Results
미토콘드리아의 전자 크라이 단층 촬영 명확하게 (그림 2) 세포 기관의 3 차원 형태를 알 수있다. 단층 막의 부피 수동 세분화 미토콘드리아에 cristae의 구조를 도시한다. 특정 단백질 성분이없는 다른 효모 녹아웃 균주로부터 미토콘드리아 촬상함으로써 cristae 형태에서 이들 단백질의 효과를 평가하여있다. 3는 ATP 합성 효소 서브 유닛 전자 결여 효모 균주로부터 미토콘드리아를 보여준다. ATP 합성 효소 복합체의이 구성 요소는 미토콘드리아 ATP 합성 효소의 이합체가 필요합니다. 이 균주에서 미토콘드리아 (그림 2) 야생형 미토콘드리아의 정상적인 층상 cristae 부족 대신 내막 구획의 번호가 포함되어 있습니다. 이러한 구획 cristae 중 하나없는 또는 작은 풍선 모양의 막 함입 (그림 3)이 포함되어 있습니다.
톰에서프로그램 RL FR RR FL이 경우 ATP 합성 효소 이량 체에서 좋은 대조, 큰 미토콘드리아 단백질 복합체로, 쉽게 볼 수 있습니다 (그림 4, 영화 1). (; 동영상이도 5) 착물의 구조는 subtomogram 평균화함으로써 2-3 nm의 해상도에서 결정될 수있다. (; 영화 3도 6) 평균 볼륨은 막에서 서로에 대해 그리고 다른 단백질 복합체 개별 복합체의 구성을 평가하기 위해 단층 화상에 다시 배치 될 수있다.
전자 극저온 단층 촬영의 단계를 보여주는 1 플로우 차트를 그림. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
야생형 S. cerevisiae의에서 미토콘드리아의 그림 2 형태론. 야생형 S.의 단층 볼륨을 통해 중앙 슬라이스 cerevisiae의 미토콘드리아 (왼쪽)과 대응하는 표면 렌더링 볼륨 (오른쪽). 외막의 분할 된 볼륨은 회색으로 표시 및 내부 경계의 볼륨과 하늘색으로 막을 cristae됩니다. 데이비스 외 8에서 적응. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
S에서 3 미토콘드리아 그림. cerevisiae의 변형에 필요한 소단위 부족ATP 합성 효소 이합체. 단층 볼륨 (왼쪽)와 S에서 미토콘드리아의 표면 렌더링 볼륨 (오른쪽)를 동반를 통해 조각. ATP 합성 효소 이합체에 필요한 단백질 서브 유닛 전자 부족한 cerevisiae의 부담을. 도 2와 비교하면, 변이주로부터 미토콘드리아는 야생형 미토콘드리아의 정상적인 라멜라 cristae 없다. 대신, 미토콘드리아없이 cristae 또는 풍선 모양의 cristae 중 많은 내막 함이 있습니다. 따라서 전자 극저온 단층 촬영 유전자 삭제로 인해 막 형태의 변화를 강조한다. 데이비스 외 8에서 적응. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Figur곰팡이 P.의 전자 4 미토콘드리아 anserina. 사상균 P.에서 미토콘드리아의 단층 볼륨 (왼쪽)과 (오른쪽) 첨부 표면 렌더링 볼륨을 통해 썰어 anserina. 이 단층에서, 10 nm의 입자 (노란색 화살촉)의 열이 내부 멤브레인 cristae 매우 굽은 막 리지 위에 위치 (동영상 1 참조). 이 입자는 subtomogram 평균에 의해 ATP 합성 효소의 이합체로 확인되었다. 데이비스 외 9.에서 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
미토콘드리아 ATP 합성 효소도 5의 구조 및 조직. 측 S.로부터 ATP 신타 이량의 전자 밀도를 나타내는 평면도 C erevisiae 장착 원자 모델 (왼쪽)와 subtomogram 평균에 의해 결정으로. 열 (오른쪽)에서 ATP 신타 다이머의 조직을 도시 미토콘드리아 내막 소포. 그림 중에 계산 된 평균 좌표를 이용하여, 막 소포의 볼륨으로 분할 된 ATP 합성 효소의 이량 subtomogram 평균 위치에 의해 생성되었다. 데이비스 외 8에서 적응. 원자 모델 : F 1 / 로터 링 [PDB : 2WPD] 39 (파란색과 보라색); 단백질 성 부여 OSCP oligomycin [PDB : 2BO5] 40 (녹색); 주변 스토킹 단편 [PDB : 2CLY]에서 N-말단 잔기 일 [PDB : 2WSS]이 (노랑, 빨강) (동영상 2 참조). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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P.에서 그림 6 고립 crista 소포 anserina 미토콘드리아. 조각 P.에서 crista 소포의 단층 볼륨 (왼쪽)과 (오른쪽) 첨부 표면 렌더링 볼륨에서 anserina. 막에서 튀어 나온 단백질 밀도를 명확하게 볼 수 있습니다. subtomogram 평균에 의해 확인 된 노란 화살촉으로 표시 밀도, ATP 합성 효소 이량 체입니다. 녹색 화살촉 NADH 탈수소 효소로 항체 라벨에 의해 식별 밀도를 가리 (1 복잡 한 세부 사항은 9 참조를 위해). 단백질 농도의 분할 (참고 행 양쪽 멤브레인 영역에서 고도로 만곡 cristae 능선을 따라 행을 형성하는 (빨간색과 노란색) ATP 신타 다이머 및 NADH 탈수소 효소 복합체 (녹색)로, cristae의 조직을 보여준다 영화 3). 데이비스 등 구에서.28 / 51228fig7highres.jpg "대상 ="_ 빈 "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
P.의 영화 1 전자 크라이 단층 촬영 anserina 미토콘드리아는. 영화는 사상균 P.에서 미토콘드리아의 촬영 단층 볼륨을 통해 연속적인 조각을 보여줍니다 anserina. ATP 합성 효소의 행 노란색 화살촉으로 표시됩니다. 표면 렌더링 분할 볼륨 cristae 3 차원 구조에 관련된 ATP 신타 제 (노란색 분야)의 위치를 나타낸다. 외부 막, 회색; 내측 경계 막, 투명 블루; 막 불투명 파란색 cristae. 데이비스 등 구에서. 또한 그림 4를 참조하십시오. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
S에서 미토콘드리아 ATP 합성 효소 이량 체의 영화 2 Subtomogram 평균. 장착 원자 모델로 미세스 세 레비 시아. 평균이었다121 서브 볼륨 계산. 밀도는 세 윤곽 수준에 표시됩니다 : 1 초이 - 메시, 2 초 - 밝은 회색 -3 - 어두운 회색. 원자 모델은 키메라에서 순차 착용감 루틴을 사용하여 밀도에 끼워졌다. 원자 모델 : F 1 / 로터 링 [PDB : 2WPD] 39 (파란색과 보라색); 단백질 성 부여 OSCP oligomycin [PDB : 2BO5] 40 (녹색); 주변 스토킹 단편 [PDB : 2CLY]에서 N-말단 잔기 일 [PDB : 2WSS]. 2 (노랑, 빨강) 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
데이비스 외 8에서 적응. 또한 그림 5를 참조하십시오.
P.에서 영화 3 절연 cristae 소포 anserina 미토콘드리아. 연속 슬라이스 단층 촬영을 통해 볼륨이 분할 된 표면 렌더링 볼륨 다음에 표시됩니다. membran에서 튀어 나온 단백질 밀도전자 명확하게 볼 수 있습니다. 빨간색과 노란색 밀도는 ATP 합성 효소 이량 체입니다. 그린 밀도 항체 표지에 의해 결정되는 NADH 탈수소 효소 (복합체 I)을한다. 데이비스 등 구에서. 또한 그림 6을 참조하십시오. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 미토콘드리아의 subtomogram 평균화 ET-크라이을 위해 소개하고 있지만, 본질적으로 동일한 절차가 다른 세포 구획 또는 막에 적용될 수있다. 최적의 데이터를 얻으려면, 절차를 수행하는 동안 중요한 단계는 샘플 준비, 플 런지 냉동 처리 및 데이터 수집 전략이다. 성공을 위해 매우 중요합니다 샘플 품질, 좋은 이미지 대비를위한 가장 중요하다 적당한 얼음 두께를 보장하기 위해 최적화 된 동결 프로토콜에 따라 달라집니다. 최적의 데이터 수집 전략은 악기와 샘플에 따라 달라집니다. 최적화 할 파라미터는 이미지 당 전자 용량, 틸트 방식과 디 포커스를 포함한다. 좋은 샘플 좋은 단층 화상을 취득하는 모든 추가 처리 단계를 용이하고 양호한 최종 결과를 보장한다.
곳을 알아내는-ET subtomogram 평균 원자 모델 피팅과 결합 단백질 복합체 번째로 배열하는 방법의 세부 사항을 제공합니다EIR 원시 세포 환경을 제공합니다. 기술은 호흡 쇄 supercomplexes (1.7 MDA), ATP 신타 다이머 (2 × 500 kDa의), 또는 핵 세공 착체 (~ 120 MDA) 8, 9, 17와 같은 큰 세포막 단백질 복합체의 구조를 조사하고 동등하게 적합하다. 이량 행이 분리에 필요한 단계 인 세제 추출에 의해 방해되기 때문 열로 ATP 신타 다이머의 조직은, 예컨대 X-선 결정학, NMR 또는 단일 입자 극저온-EM 등의 고해상도 방법에 의해 관측 될 수 없다 및 세포막 단백질 복합체의 정제.
cristae 능선을 따라 이량 체의 행 ATP 합성 효소의 배열은 모든 종에서 미토콘드리아의 보편적 인 구성 원리이다. 전자 수송 체인의 양성자 펌핑 착체, 특히 복잡 I (NADH 탈수소 효소)는, 어느 한쪽의 행 (8)의 막 부분에 위치9. 호흡 사슬의이 조직은 미토콘드리아 생물 에너지 학에 지대한 영향을 미친다. 이량 행 의한 이량 특정 단백질 서브 유닛의 부재로 형성 할 수없는 경우도 3 (41)에 도시 된 효모 돌연변이 관찰로서, 세포는 더 이상 발생 시간 및 감소 된 세포의 적합성을 나타낸다. 미토콘드리아 질환에 대한 관심과 함께, 상세한 미토콘드리아 미세 구조와 기능에 적용되는 분자 기준의 이해는 매우 중요하다. 전자 크라이 단층은 나노 미터 규모의 막 단백질의 고해상도 방법에 의해 결정 구조 및 분포와 이들 단백질의 배열 사이의 링크를 제공한다. 이것은 크라이 ET에게 건강과 질환에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 만든다.
극저온 ET에 또한 기술 개발 및 개선 PROTEI의 위치를 식별하기 위해 단백질 표지 전략을 포함거대 분자 복합체의 N 서브 유닛 또는 셀에 작은 이하 별개의 단백질의 위치 (<0.5 MDA)가 있습니다. 또한, 단일 입자 분석 또는 나선형으로 재구성 subtomogram 평균화 결합 하이브리드 EM 처리 방법은, 최근 단백질 구조를 결정한 42, 8 ~ 43이다. 이러한 처리 방법은 현재 잘 얼음에서 분리 또는 나선형 어셈블리를 형성하고 현재 미토콘드리아와 같은 붐비는 셀룰러 환경에서 적용되지 않고 세포막을 cristae 아르 정제 된 단백질 제한됩니다. 데이터 수집을 위해, 새로운 컴퓨팅 및 하드웨어 도구, 자동화 된 단층 취득을 가능하게 이미지의 명암 대비가 증가하고 총 필요한 전자 투여 량을 줄이기 위해 개발되고있다. 극저온에서 ET 만 근본적인 한계는 전자선에 의해 시료에 방사선 손상이다. 이것은 매우 낮은 전자 선량 불량 신호 t 결과 단층 틸트 각 시리즈의 이미지를 촬영하는데 사용될 수 있음을 의미오 - 노이즈 궁극적으로 달성 해상도를 제한하는 비율. 년 전보다 발표 된 새로운 직접 전자 감지기는 현재 단일 입자 냉동-EM 44, 45의 분야에 혁명을 일으키고있다. 이 새로운 검출기는 낮은 전자 투여 량 높은 콘트라스트와 더 나은 해상도를 제공합니다. 전자 크라이 단층 촬영의 경우, 이것은 과도한 방사선 손상 (하나의 CCD 이미지 5 직접적인 전자 검출기 이미지를 전자 량에 상당)에 대한 우려없이 수집 할 수있는 더 작은 스텝 크기 또는 이중 축 단층 촬영과 그 기울기 시리즈를 의미한다. 이들 검출기에 의해 생성 된 데이터의 방대한 양이 극복되어야 할 것이다 데이터 처리, 저장 및 가공에 자신의 과제를 생성한다.
또한, 상 콘트라스트를 향상시키기 위해 광학 현미경에서 일상적으로 사용되는 것과 유사한 원리에서 작동 위상 판은, 현재 투과형 전자 현미경 (46), (4)를 위해 개발되고있다7. 이것은 단층 촬영 포커스에 가까운 수거하고 따라서 더 높은 해상도로, 동시에 낮은 해상도를 유지하면서 것은 배향 단층과 볼륨의 해석에 필요한 기능을 할 수 있도록한다. 함께 찍은, 이러한 기술 발전이 크게 크라이 ET에 의해 해결 될 수있다 생물 질문의 범위를 확장됩니다.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 막스 플랑크 협회 (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, 그리고 WK), 도이치 Forschungsgemeinschaft (WK)와 박사 EMBO 장기 자금 지원 우수 프랑크푸르트 "Macromolecular의 단지"의 클러스터에 의해 지원되었다 원정대 (VAMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
| Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
| Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
| Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
| Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
| Consumables | |||
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
| Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
| EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
| Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
| Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
| Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
| Blender | Waring | 8011S | |
| Glass bead mill - bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
| Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
| Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
| Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
| Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
| Direct electron detector | Gatan | K2 summit | 4k x 4k pixels, counted mode |
| Charge coupled device (CCD) | Gatan | US4000 | 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector) |
| Energy filter | Gatan or Jeol | ||
| Software | |||
| Image acquisition software | Gatan | ||
| Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
| Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
| Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
| Tomogram visualization software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
| Visualization software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
| Structure visualization software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ | |
References
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