Summary
Vi presenterar ett protokoll för hur man samlar in och bearbeta elektron Cryo-tomogram av hela mitokondrier. Tekniken ger detaljerade insikter i struktur, funktion och organisation av stora membranproteinkomplex i inhemska biologiska membran.
Abstract
Elektron Cryo-tomografi är ett kraftfullt verktyg i strukturbiologi, med förmåga att visualisera den tredimensionella strukturen av biologiska prover, såsom celler, organeller, membran blåsor eller virus på molekylär detalj. För att uppnå detta är det vattenhaltiga provet snabbt förglasat i flytande etan, som bevarar den i en nära-to-native, frysta hydrerad tillstånd. I elektronmikroskop, är tilt-serien spelas in vid vätsketemperatur kväve, som 3D tomogram rekonstrueras. Förhållandet signal-till-brus av tomografiska volymen är i sig låg. Igenkännbara, återkommande fördelar som finns med subtomogram medelvärdes, genom vilken enskilda subvolymer skärs ut, i linje och i genomsnitt för att minska bullret. På detta sätt, 3D-kartor med en upplösning av 2 nm eller bättre kan uppnås. En passning av tillgängliga högupplösta strukturer för att 3D-volymen producerar sedan atommodeller proteinkomplex i sin ursprungliga miljö. Här visar vi hur vi använder elektron Cryo-tomography att studera in situ organisera stora membranproteinkomplex i mitokondrier. Vi finner att ATP-syntaser är organiserade i rader av dimerer längs starkt krökta spetsarna hos det inre membranet crista, medan komplex I är slumpvis fördelad i membranregioner på endera sidan av raderna. Genom subtomogram medelvärdes fick vi en struktur av mitokondriell ATP-syntas dimer i crista membranet.
Introduction
Mitokondrierna är power-husen i cellen. Genom att omvandla en elektrokemisk protongradient över det inre mitokondriemembranet i kemisk bindning energi, producerar den mitokondriella ATP-syntas mesta av ATP som driver cellulära processer. För att förstå mekanismerna bakom mitokondriell energiomvandling, måste vi bestämma strukturen av ATP-syntas på plats, och för att ta reda på hur det är organiserat och distribueras i det inre mitokondriemembranet. Även högupplösta strukturer flesta mitokondriella ATP-syntas komponenter 1-3 och lågupplösta kartor över hela komplexet 4 finns tillgängliga, är det viktigt att fastställa strukturen och konforma av arbets enzymet i membranet. Fördelningen av ATP-syntas i den inre mitokondriemembranet har i stor utsträckning antas vara slumpmässigt, men en tidig hitta 5 och våra egna initiala resultat 6 indikerade att detta inte tHan fallet. Efterföljande studier från vår grupp och andra 7 har bekräftat att ATP-syntas är ordnade i långa rader av dimerer längs tätt böjda åsar av det inre mitokondriemembranet crista 8, medan protonpumparna i elektrontransportkedjan tycks vara belägen på endera sidan av raderna 9. Detta arrangemang har stor betydelse för mekanismerna för mitokondriell energiomvandling.
Tekniken som vi har använt för att fastställa detta arrangemang är elektron Cryo-tomografi (kryo-ET). Cryo-ET är för närvarande den enda metod som ger exakta tredimensionella (3D) volymer av celler, cellulära fack eller organeller på molekylär upplösning. Cryo-ET är särskilt lämplig för att studera stora komplex i biologiska membran, eftersom membranen visas med bra kontrast och är lätta att spåra i 3D tomografiska volymer.
Andra metoder för att studera 3D-strukturen av celler eller organelles ger inte molekylär detalj. Super-upplösning Ijusmikroskopi 10, 11 är utmärkt att avslöja positionen eller avstånden mellan Ijusemitterande etiketter fästa till proteiner av intresse med en precision på tiotals nm, men det avslöjar inte strukturen av proteinet självt, även vid låg upplösning . Transmissionselektronmikroskopi av seriella sektioner 12 eller blockera ansikte avbildning med svepelektronmikroskop 13 av plastinbäddade biologiska prover ger lågupplösta vyer av cellulära volymer men heller inte avslöja molekylär detalj. Atomkraftsmikroskopi 14 kan i princip leverera molekylär eller till och med atomär upplösning, men bara på ytan av föremål på ett atomärt plant, fast underlag. Slutligen 16 är det osannolikt att avslöja strukturen hos stora, komplexa, aperiodiska föremål såsom hela celler eller organeller vid m röntgentomografi 15 eller spridning av intensiva röntgenpulserna från frielektronlasrarolecular upplösning inom överskådlig framtid. Således närvarande finns det inget alternativ till Cryo-ET för studier av 3D-strukturen av celler eller organeller i nanometerupplösning.
Cryo-ET är metoden för att undersöka strukturen och konforma av membranassocierade proteinaggregat, inklusive den nukleära por komplex 17, influensa spik komplex 18, och flagmotorproteiner 22, 23 men också organisationen av hela bakterieceller 19 och inmatning av patogena virus såsom HIV in till celler 20-23. Cryo-ET är ovärderlig för att visualisera trådformiga proteiner och deras interaktioner i cellen, inklusive aktinfilament 24 eller axonemes 25. Upplösningen kan ökas till 2 nm eller bättre genom subtomogram genomsnitt 26, vari subvolymer upprepade, regelbundna drag skärs ut ur en tomografisk volym och i genomsnitt genom en enda partikel bild probetningstekniker.
Cryo-ET innebär förvärv av en serie av projektionsbilder av en tunn exemplar (<250 nm) som tas på olika lutningsvinklar i ett transmissionselektronmikroskop (TEM). Provet måste vara tunn, så att elektroner, som interagerar starkt med materia, är utspridda högst en gång. Multipel spridning gör de resulterande bilderna svårtolkade och minskar kontrasten. Bilder av den valda provområdet är inriktade i förhållande till varje annan och projiceras in i en 3D-rymd genom ett lämpligt datorprogram, alstra en 3D-volym av provet. Anpassningen av bilderna underlättas av guld referensmarkörer, som blandas med provet innan frysning. Helst 10 eller mer jämnt fördelade referensmarkörer bör finnas i varje bild för att uppnå en god anpassning.
För att observera molekylära detaljer, proverna dopp frysta i flytande etan, som bevarar deras naturliga hydratiserade tillståndet. Frysning i flytandeetan är så snabb (~ 10 5 ° C / s) 27 att vatten inte kristalliserar men finns kvar i en keramisk, glasliknande tillstånd. Iskristallbildning skadar känsliga biologiska strukturer. Som biologiska prover lider av strålningsskador, det finns en gräns för det totala antalet spridningsevenemang exemplaret kan tolerera. Bilderna alltså förvärvas i lågdos-läge: Ett område av intresse identifieras vid låg förstoring (1,500X) med ett elektron dos under 1 e - / nm 2 (sökläge). Bilden fokuseras sedan på en större förstoring, utanför intresseområdet (fokusläge). Först när en bild förvärvas, är det intressanta området bestrålas med en högre elektron dos (exponeringsläge).
Här presenterar vi en översikt över hur man samlar in och bearbeta elektron Cryo-tomogram, med hjälp av ATP-syntas dimerer i den inre mitokondriemembranet som exempel. Följande protokoll beskriver hur man förbereder mitokondrier för Cryo-ET, hur man ställer inoch samla in en lutning serie med en specifik total elektrondosen, och hur man bearbetar lutnings serien för att få en 3D-volym av det intressanta området. En översikt av förfarandet illustreras i fig 1.
Protocol
1. Beredning av mitokondrier från celler eller vävnader genom differentiell centrifugering
Detta avsnitt beskriver ett allmänt förfarande för isolering av intakta mitokondrier från olika eukaryota organismer. Den exakta buffertkomponenter och centrifuge hastigheter måste optimeras för varje vävnad / arter studeras.
- Bryt celler i isotonisk buffert (t.ex., 250 mM sackaros, 10 mM HEPES pH 7,4) med användning av en glas-pärlkvarn (svampmycel) 28, enzymatisk digerering av cellväggen (Saccharomyces cerevisiae) 29, en kullagerförsedd homogeniseringsanordning (enda -cell eukaryoter / kultur celler / nematoder) 30 eller en mixer (djur eller växtvävnader) 31.
- Avlägsna cellrester genom filtrering genom muslin följt av låghastighetscentrifugering (2000 xg, 4 ° C, 10 min).
- Samla supernatanten och pellet mitokondrier genom höghastighetscentrifugering (9.000 xg, 4 ° C, 10 min).
- Vid behov använd en isoton täthet steggradient för ytterligare rening av det mitokondriella fraktionen 32.
2 Beredning av mitokondrier för Electron Cryo-tomografi
I följande avsnitt beskrivs hur du får frysta hydrerad prover för Cryo-ET. OBS: Metoden innebär användning av extremt kall flytande kväve och etan, vilket kan orsaka allvarliga brännskador på huden. Skyddsglasögon och Cryo-handskar måste användas. Flytande etan, som också är brandfarlig, måste hanteras i ett dragskåp.
- Resuspendera pellet mitokondrier i 250 mM trehalos, 10 mM HEPES-buffert vid pH 7,4 till en koncentration av ca 5 mg / ml totalt protein.
- Glow-urladdnings holey kol EM nät, kol sidan upp, i en vakuumanordning enligt tillverkarens instruktioner.
- Liquefy några milliliter av etan genom att rikta en ström av etan gas på den inre sidan av en flytande kväve svaled aluminium behållare.
- Blanda protein A-konjugerad guld fiducial fjädring 1: 1 med mitokondriell fjädring och omedelbart gälla 3 l till en glödurladdning EM rutnät hölls i pincett.
- Placera pincetten i en förglasning enhet, t.ex. en hemmagjord giljotinen. Blot bort överflödig vätska med en kil av filterpapper (~ 5 sek eller tills flytande stopp spridnings) och omedelbart störtar rutnätet i flytande etan genom att släppa avtryckaren.
- Överför nätet från flytande etan i flytande kväve. Under överföringen, avlägsna överflödigt etan från nätet med filterpapper. Placera spetsen på ett kilformigt stycke filterpapper in i det flytande etan. När vätske etan stiger försiktigt dra gallret upp filterpapper men håll det under vätske fronten. Flytande etan avlägsnas från nätet med kapillärkraft och när all vätska etan har tagits bort, omgående överlåta nätet i flytande kväve.
- Placera förglasat gallret i en grid förvaringslåda, ennd förvara i flytande kväve för senare användning så är lämpligt.
3 Registrering av Tomografiutrustning Tilt Series
Följande avsnitt beskriver hur du ställer in och samla en tomografisk lutning serie en mitokondrien med Polara elektronmikroskop utrustat med en efterkolonnenergi filter och CCD-kamera. Liknande protokoll används med alla elektron Cryo-mikroskop utrustade med CCD eller direkt elektrondetektorkameror.
- Rikta in mikroskop
- Sätt i testprov t.ex. grafit och guld öar på holey kolfilmen.
- Välj sökläge i mikroskopets lågdos systemet.
- Ta prov till eucentric höjd. Detta är poängen med minimal xy rörelse när luta provhållare. Centrera en intressant plats vid 0 ° lutning, luta scenen till 20 ° och centrera punkten genom att ändra z-höjd. Återgå till 0 ° och upprepa tills lateral förskjutning minimeras.
- Väljexponeringsläge. Välj önskad förstoring för att samla ett tomogram (t.ex. 25,000X på detektorn ≈ 0,6 nm provpixelstorlek).
- Välj en liten kondensator öppning (50-70 mm) och väljer en plats storlek och ljusintensitet så att balken är bara bredare än bildenheten och ger en pixel läsning av 60 e - / pixel (CCD) eller 14 e - / pixel / sek (direkt elektrondetektor, räknar läge).
- Center kondensor bländare.
- Hitta Gaussian fokus t.ex. punkt minimal kontrast. Återställ mikroskop defocus läsning och korrekta vridningspunkter och rotationscentrum enligt tillverkarens anvisningar.
- Slå in önskad minskad fokus för inspelning tomogram. OBS: Högt defocus (8 ^ m) ökar kontrasten utan reducerar upplösning, medan låga defocus (2-4 um) ökar upplösningen på bekostnad av kontrast.
- Över ett tomt hål, generera en ny förstärkning referens och rikta energin filter enligt tillverkarensinstruktioner.
- Rikta sök-och exponeringslägena. I exponeringsläge, centrera en intressant och växla söka läge. Välj förstoring 1,500X (0,033 nm / pixel prov på detektorn) och minskad fokus på 100 m (för ökad kontrast). Ta sevärdhet tillbaka till centrum med hjälp av bildväxlings spolar.
- I sökläget justera punktstorlek och ljusintensitet så att balken är bara bredare än bildenheten och ger en pixel läsning av ~ 20 e - / pixel (CCD) eller ~ 8 e - / pixel / sek (direkt elektrondetektor, räkna läge).
- Hitta en bra Specimen Area
- Sätt gallret med frysta hydrerad mitokondrier i elektronmikroskop vid temperatur flytande kväve (se EM tillverkarens anvisningar).
- I sökläge, söka på nätet för områden med lämplig istjocklek och prov kvalitet. Ta en 6 sek ökning bild av lovande områden för att avgöra lämpligheten för tomogram samling. Both den inre och yttre mitokondriemembranet skall vara synliga på denna förstoring.
- Inspelning av en Tomografiutrustning Tilt Series
- När en bra provområde hittas, luta scenen ± 60 ° för att bestämma den maximala lutningsintervall som är tillgänglig utan hinder av exponeringen eller fokusområde genom gallerstänger eller is klumpar.
- På en närliggande ice-fyllda hål av liknande utseende, ändra till exponeringsläge och justera ljusintensitet eller bildinsamlingstiden så varje inspelad bild har en elektron dos på 30-50 e - / pixel för CCD: er eller 6-8 e - / pixel / s direkta elektrondetektorer, räknar läge.
- Beräkna kvoten dosfördelning (I 0 / I 60) genom att dividera den genomsnittliga elektronräkning för en 1 sek bilden förvärvas vid 0 ° med den hos en 60 ° bilden. Detta förhållande beskrivs den ökade exponeringen tid som krävs för att upprätthålla en konstant elektronräkning per bild med ökande lutningsvinkel (exponeringstid = 1 / cos (α) n där (I 0 / I 60) = 2 n). Förhållandet fungerar också som en bra indikation på istjocklek. Bra tomogram av mitokondrier vanligtvis registreras med en I 0 / I 60 = 2,3-2,6.
- Över ett tomt hål, skaffa en 1 sek bild i exponeringsläge och notera elektronräkning per Å 2. Med hänsyn till den dos fördelningsförhållandet, beräkna det totala antalet bilder som går att lagra för en viss total elektron dosen (t.ex. <40 e - / Å 2 för strukturbestämning & ~ 160 e - / Å 2 för morfologi).
- Bestäm lämplig lutningsintervallet för tomogram samling genom att den totala lutningsintervall (t.ex. 120 ° för ± 60 °) av det totala antalet bilder som beräknats i 3.3.4.
- Ställ in och spela in ett tomogram med de parametrar som anges ovan med lämplig automatisk datainsamling programvara 33, 34. Tilt-serien är vanligtvis började vid ± 20 ° och gå igenom 0 ° innan den når höga lutningar för att maximera innehållet informations av låg tilt bilder som förstörs genom att öka elektrondosen.
4 Skapande och segmentering av tomografiska Volymer
Detta avsnitt beskriver hur tomografiska volymer av mitokondrier genereras från serie lutning och hur volymerna finns för allmän visning.
- Spara tomografiska tilt-serien till en lämplig katalog. Generera en bildstapel och konvertera till ett lämpligt filformat med öppen källkod, t.ex. dm2mrc eller tif2mrc (IMOD paketet), som omvandlar .dm3, .dm4 eller .tif filer till MRC stackar. MRC stackar krävs för tomografisk rekonstruktion med IMOD 35. Andra paket kräver olika format.
- Rikta in bilderna och generera en tomogram genom att följa stegen som beskrivs i IMOD tutorial (
- Förbättra kontrasten i tomogram med den icke-linjära anisotropa diffusion filter distribueras med IMOD. Detta filter fungerar bra för membran och membran-associerade partiklar, såsom ATP-syntas.
- För visualisering, manuellt segmentera tomogram med hjälp av kommersiellt tillgängliga program t.ex. Amira. Tilldela voxels motsvarande den inre eller yttre membranet och skapar en yta. Använda alternativet klickern i EM-paketet plugin för Amira 36 markera platsen för ATP-syntas partiklar.
5. Subtomogram medelvärde av ATP-syntas dimerer och Montering av röntgenstrukturer
I följande avsnitt beskrivs hur subtomogram medelvärden av ATP-syntas dimerer kan erhållas.
- Genom att använda de markerade partiklarna som input och en lämplig mjukvara såsom "Partkel Uppskattningen för Electron Tomography programmet, beräkna en subtomogram genomsnittet.
- För beslut uppskattning, jämföra två oberoende bestämda subtomogram genomsnitt av Fourier skal korrelation 37.
- Om tillgängliga, hamn kända röntgenstrukturer till subtomogram genomsnittet av stel kropp montering, antingen manuellt eller med hjälp av automatiska sekventiella dockningsrutiner som de i programmet Chimera 38.
Representative Results
Elektron Cryo-tomogram av mitokondrier avslöjar tydligt 3D morfologi organell (Figur 2). Manuell segmentering av membranen i en tomografisk volym illustrerar strukturen av crista i en mitokondrien. Genom att avbilda mitokondrier från olika jäst knockout stammar som saknar vissa proteinkomponenter, kan effekten av dessa proteiner på crista morfologi genom bedömas. Figur 3 visar en mitokondrien från en jäststam som saknar ATP-syntas subenhet e. Denna komponent av den ATP-syntas komplexet krävs för dimerisering av den mitokondriella ATP-syntas. Mitokondrier från denna stam saknar normala lamellära crista av vildtyp mitokondrier (figur 2) och i stället innehålla ett antal inre membranfack. Dessa fack är antingen saknar crista eller innehåller små ballongformad membran invaginationer (Figur 3).
I tomograms med bra kontrast, stora mitokondriella proteinkomplex, i detta fall ATP-syntas dimerer, är väl synlig (figur 4; Movie 1). Strukturerna för komplexen kan bestämmas vid 2-3 nm resolution med subtomogram medelvärdes (Figur 5, Film 2). De genomsnittliga volymerna kan placeras tillbaka i tomogram för att bedöma att organisera enskilda komplex i förhållande till varandra och till andra proteinkomplex i membranet (Figur 6; Movie 3).
Figur 1 Flödes diagram som visar de olika stadierna av elektron Cryo-tomografi. Klicka här för att se en större bild.
Figur 2 Morfologi av en mitokondrier från vildtyp S. Cerevisiae. Central skiva genom en tomografisk volym av en vildtyp S. cerevisiae mitokondrien (vänster) och motsvarande yta-renderade volym (höger). Den segmenterade volymen av det yttre membranet visas i grått och volymerna av den inre gränsen och crista membran i ljusblått. Anpassad från Davies et al 8. Klicka här för att se en större bild.
Figur 3 Mitochondrion från en S. Cerevisiae stam som saknar en underenhet som krävs förATP-syntas dimerisering. Skär igenom tomografisk volym (vänster) och medföljande utanpå renderade volym (höger) av en mitokondrier från en S. Cerevisiae stam som saknar proteinsubenheten e krävs för ATP-syntas dimerisering. Vid jämförelse med fig 2, mitokondrien från mutantstammen saknar den normala lamellära crista av vildtyp mitokondrier. Istället har mitokondrien många inre membran fack med antingen ingen crista eller ballongformade crista. Således elektron Cryo-tomografi belyser förändringar i membran morfologi grund gen strykningar. Anpassad från Davies et al 8. Klicka här för att se en större bild.
Figure 4 Mitochondrion från svampen P. anserina. Skär igenom tomografisk volym (vänster) och medföljande utanpå renderade volym (höger) av en mitokondrie från fintrådiga svampen P. anserina. I detta tomogram är rader av 10 nm partiklar (gula pilspetsar) placerad ovanför mycket böjda membran åsar i det inre membranet crista (se film 1). Dessa partiklar identifierades som ATP-syntas dimerer efter subtomogram medelvärdes. Från Davies m fl 9. Klicka här för att se en större bild.
Figur 5 Struktur och organisation av mitokondriell ATP-syntas. Från sidan och uppifrån visar elektrontätheten i en ATP-syntas dimer från S. c erevisiae bestämt med subtomogram medelvärdes med monterade atommodeller (till vänster). Mitochondrial inner membranvesikel visar organisation ATP-syntas dimerer i rader (höger). Figuren skapades genom att placera subtomogram genomsnittet av ATP-syntas dimer i den segmenterade volymen av membranvesikel, med hjälp av koordinaterna beräknas under genomsnittet. Anpassad från Davies et al 8. Atomic modeller: F 1 / rotor-ringen [PDB: 2WPD] 39 (blå och lila); oligomycin känsliga ger protein-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (grön); perifera stjälk fragment [PDB: 2CLY] 1 med N-terminala rester från [PDB: 2WSS] 2 (gul och röd) (se film 2). Klicka här för att se en större bild.
_upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 6. Isolerad crista vesikel från ett P. anserina mitokondrien. Skivor från en tomografisk volym (vänster) och medföljande utanpå renderade volym (till höger) i en crista vesikel från P. anserina. Protein densiteter som skjuter ut från membranet är tydligt synliga. Densitet anges med gula pilspetsar är ATP-syntas dimerer, identifierad genom subtomogram medelvärdes. Gröna pilspetsar pekar på densiteter identifierats av märkning antikropp som NADH dehydrogenas (komplex 1, för detaljer se 9). Segmentering av proteintäthet avslöjar sin organisation i crista, med ATP-syntas dimers (röd och gul) bildar rader längs de mycket böjda crista åsar och NADH dehydrogenas komplex (grön) i membranregioner på vardera sidan av raderna (se Film 3). Från Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Film 1 Elektron Cryo-tomogram av P. anserina mitokondrien. Filmen visar på varandra följande skivor genom en tomografisk volym som tas av en mitokondrie från fintrådiga svampen P. anserina. Rader av ATP-syntas är markerade med gula pilar. Ytan-renderade, segmenterad volym visar var ATP-syntas (gula sfärer) i förhållande till 3D crista strukturen. Yttre membran, grått; inre gränsmembran, transparent blå; crista membran, ogenomskinlig blå. Från Davies et al 9. Se även figur 4. Klicka här för att se video.
Film 2 Subtomogram genomsnitt av mitokondriella ATP-syntas dimer från S. Cerevisiae med monterade atommodeller. Medelvärdet varberäknat från 121 subvolymer. Densiteten visas på tre kontur nivåer: 1s - mesh, 2s - ljusgrå och 3s - mörkgrå. Atomic modeller monteras i densiteten med hjälp av sekventiella fit rutin i Chimera. Atomic modeller: F 1 / rotor-ringen [PDB: 2WPD] 39 (blå och lila); oligomycin känsliga ger protein-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (grön); perifera stjälk fragment [PDB: 2CLY] 1 med N-terminala rester från [PDB: 2WSS]. 2 (gul och röd) Klicka här för att se video.
Anpassad från Davies et al 8. Se även figur 5.
Movie 3. Isolerad crista vesikel från ett P. anserina mitokondrien. Successiva skivor genom tomografiska volymen visas, följt av den segmenterade ytan-renderade volymen. Protein tätheter som skjuter ut från membrane syns tydligt. Röda och gula densiteter är ATP-syntas dimerer. Gröna densiteter är NADH dehydrogenas (komplex I) bestämt med märkning antikropp. Från Davies et al 9. Se även figur 6. Klicka här för att se video.
Discussion
Protokollet presenteras här ger en introduktion till cryo-ET och subtomogram medelvärdes av mitokondrier, men i huvudsak samma förfarande kan tillämpas på alla andra cellfack eller membran. För att få bästa möjliga information, kritiska steg under förfarandet är provberedning, steget frysprocessen och dataförvärvsstrategi. Prov kvalitet, vilket är avgörande för framgång, beror på ett optimerat frysning protokollet för att garantera lämpliga istjocklek, vilket är av största betydelse för god bildkontrast. Den optimala datainsamling strategi beror på instrumentet och provet. Parametrar som ska optimeras omfattar elektron dos per bild, tiltsystemet och minskad fokus. Förvärva en bra tomogram en bra prov gör all vidare behandling steg lättare och ger ett tillfredsställande slutresultat.
Cryo-ET kombinerat med subtomogram medelvärdes och atommodell montering ger detaljer om hur proteinkomplex är ordnade i their nativa cellulära miljö. Tekniken är lika väl lämpade för att undersöka strukturen hos stora membranproteinkomplex, såsom respiratoriska kedjan supercomplexes (1,7 MDA), ATP-syntas-dimerer (2x500 kDa), eller den nukleära por komplex (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Organiseringen av ATP-syntas dimerer i rader kan inte observeras av högupplösta tekniker såsom röntgenkristallografi, NMR eller kryo-EM enda partikel, eftersom dimer raderna störs av detergentextraktion, vilket är ett nödvändigt steg i isoleringen och rening av membranproteinkomplex.
Arrangemanget av ATP-syntas i rader av dimerer längs crista åsar är en princip universell organisering av mitokondrier i alla arter. De protonpump komplex av elektrontransportkedja, särskilt komplex I (NADH dehydrogenas), finns i membranområdena vardera sidan av raderna 8,9. Denna organisation av andningskedjan har stor inverkan på mitokondriella bioenergetik. Om dimeren rader inte kan bildas på grund av frånvaron av dimer-specifik proteinsubenheter, cellerna uppvisar längre generationstider och minskad cellulär kondition, såsom observerats i jästmutant som visas i fig 3 41. Med det växande intresset för mitokondriella sjukdomar, en detaljerad förståelse av den molekylära grunden reglerar mitokondriell ultrastruktur och funktion är av största vikt. Elektron Cryo-tomografi ger en länk mellan proteinstruktur bestäms av högupplösta metoder, samt distribution och arrangemanget av dessa proteiner i membranet på skalan av nanometer. Detta gör Cryo-ET ett viktigt verktyg för att förstå mitokondriell struktur och funktion i hälsa och sjukdom.
Ytterligare tekniska utvecklingen och förbättringar av Cryo-ET inkluderar protein-märkning strategier för att identifiera positionen för protein subenheter i makromolekylära komplex eller platsen för mindre eller mindre distinkta proteiner (<0,5 MDA) i celler. Dessutom har bearbetningsmetoder hybrid EM, som kombinerar subtomogram medelvärdes med enda analys partikel eller spiral rekonstruktion nyligen fastställt proteinstrukturer till ~ 8 Å 42, 43. Dessa bearbetningsmetoder är för närvarande begränsad till renade proteiner, som är väl separerade i is eller bildar spiralformade församlingar och för närvarande inte tillämplig för trångt cellulära miljöer som mitokondrier och crista membran. För datainsamling, nya datorer och datorutrustning som utvecklas för att möjliggöra automatiserad tomogram förvärvet ökar bildens kontrast och minska den totala erforderliga elektrondosen. Den enda grundläggande begränsning i kryo-ET är strålningsskador på provet av elektronstrålen. Detta innebär att endast mycket låga elektron doser kan användas för att spela in varje bild av en tomografisk lutning serie, vilket resulterar i dålig signal-to-brusförhållande som i slutänden begränsar den uppnåbara upplösningen. De nya direktelektrondetektorer, som släpptes mindre än ett år sedan, för närvarande revolutionera området Cryo-EM 44, 45 single-partikel. Dessa nya detektorer ger högre kontrast och bättre upplösning vid lägre elektron doser. För elektron Cryo-tomografi, innebär detta att luta serie med mindre stegstorlekar eller till och med dubbla axel tomogram kan samlas in utan oro svåra skador strålning (en CCD är likvärdig i elektron dosen till fem direkta elektrondetektorbilder). De stora mängder data som produceras av dessa detektorer skapa sina egna utmaningar inom datahantering, bearbetning och lagring, som måste övervinnas.
Dessutom fas plattor, som fungerar på liknande principer som de som används rutinmässigt i ljusmikroskop för att öka fas kontrast, utvecklas för närvarande för transmissionselektronmikroskopi 46, 47. Detta bör göra det möjligt tomogram som ska samlas närmare fokusera och därmed hade högre upplösning, medan samtidigt bevara lågupplöst funktioner som behövs för anpassning och tolkning av tomografiska volymer. Sammantaget kommer dessa tekniska framsteg kraftigt öka utbudet av biologiska frågor som kan tas upp av Cryo-ET.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Max Planck-sällskapet (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM och WK), Cluster of Excellence Frankfurt "makromolekylära komplex" som finansieras av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) och en postdoktoral EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
| Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
| Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
| Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
| Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
| Consumables | |||
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
| Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
| EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
| Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
| Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
| Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
| Blender | Waring | 8011S | |
| Glass bead mill - bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
| Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
| Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
| Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
| Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
| Direct electron detector | Gatan | K2 summit | 4k x 4k pixels, counted mode |
| Charge coupled device (CCD) | Gatan | US4000 | 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector) |
| Energy filter | Gatan or Jeol | ||
| Software | |||
| Image acquisition software | Gatan | ||
| Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
| Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
| Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
| Tomogram visualization software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
| Visualization software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
| Structure visualization software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ | |
References
- Dickson, V. K., Silvester, J. A., Fearnley, I. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. On the structure of the stator of the mitochondrial ATP synthase. The EMBO journal. 25, 2911-2918 (2006).
- Rees, D. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. The structure of the membrane extrinsic region of bovine ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21597-21601 (2009).
- Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G., Walker, J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 16823-16827 (2010).
- Baker, L. A., Watt, I. N., Runswick, M. J., Walker, J. E., Rubinstein, J. L. Arrangement of subunits in intact mammalian mitochondrial ATP synthase determined by cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 11675-11680 (2012).
- Allen, R. D., Schroeder, C. C., Fok, A. K. An investigation of mitochondrial inner membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. The Journal of cell biology. 108, 2233-2240 (1989).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO journal. 27, 1154-1160 (2008).
- Dudkina, N. V., Oostergetel, G. T., Lewejohann, D., Braun, H. P., Boekema, E. J. Row-like organization of ATP synthase in intact mitochondria determined by cryo-electron tomography. Biochimica et biophysica acta. 1797, 272-277 (2010).
- Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D., Kühlbrandt, W. Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13602-13607 (2012).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14121-14126 (2011).
- Wurm, C. A., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13546-13551 (2011).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Austin, J. R. 2nd, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43, 612-620 (2012).
- Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N., Scheuring, S. Rows of ATP synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophysical journal. 93, 2870-2876 (2007).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Current opinion in structural biology. 20, 623-631 (2010).
- Miao, J., Hodgson, K. O., Sayre, D. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 6641-6645 (2001).
- Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure. 20, 998-1006 (2012).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Chen, S., et al.
- Bharat, T. A., et al. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4275-4280 (2012).
- Bennett, A. E., et al. Ion-abrasion scanning electron microscopy reveals surface-connected tubular conduits in HIV-infected macrophages. PLoS pathogens. 5, e1000591 (2009).
- Liu, J., et al. Cellular architecture of Treponema pallidum: novel flagellum, periplasmic cone, and cell envelope as revealed by cryo electron tomography. Journal of molecular biology. 403, 546-561 (2010).
- Liu, J., et al. Intact flagellar motor of Borrelia burgdorferi revealed by cryo-electron tomography: evidence for stator ring curvature and rotor/C-ring assembly flexion. Journal of bacteriology. 191, 5026-5036 (2009).
- Patla, I., et al. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. Nature cell biology. 12, 909-915 (2010).
- Heuser, T., et al. Cryoelectron tomography reveals doublet-specific structures and unique interactions in the I1 dynein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2067-E2076 (2012).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Current opinion in structural biology. 23, (2013).
- Cheng, D., Mitchell, D. R. G., Shieh, D. B., Braet, F. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology. Méndez-Vilas, A. 2, Formatex. (2012).
- Brust, D., et al. Cyclophilin D links programmed cell death and organismal aging in Podospora anserina. Aging cell. 9, 761-775 (2010).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (30), (2009).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical biochemistry. 413, 123-132 (2011).
- Pavlov, P. F., Rudhe, C., Bhushan, S., Glaser, E. In vitro and in vivo protein import into plant mitochondria. Methods in molecular biology. 372, 297-314 (2007).
- Graham, J. M., et al. Ch. 3, Current protocols in cell biology. Bonifacino, J. S. , John Wiley and Sons. (2001).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment, and reconstruction. Journal of structural biology. 157, 138-147 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, 71-76 (1996).
- Pruggnaller, S., Mayr, M., Frangakis, A. S. A visualization and segmentation toolbox for electron microscopy. Journal of structural biology. 164, 161-165 (2008).
- Scheres, S. H., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature methods. 9, 853-854 (2012).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Dautant, A., Velours, J., Giraud, M. F. Crystal structure of the Mg.ADP-inhibited state of the yeast F1c10-ATP synthase. The Journal of biological chemistry. 285, 29502-29510 (2010).
- Carbajo, R. J., et al. Structure of the F1-binding domain of the stator of bovine F1Fo-ATPase and how it binds an alpha-subunit. Journal of molecular biology. 351, 824-838 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO journal. 21, 221-230 (2002).
- Bharat, T. A., et al. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature. 487, 385-389 (2012).
- Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G., Subramaniam, S. Protein secondary structure determination by constrained single-particle cryo-electron tomography. Structure. 20, 2003-2013 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods. , (2013).
- Danev, R., Nagayama, K. Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM. Ultramicroscopy. 111, 1305-1315 (2011).
- Walter, A., et al. Practical aspects of Boersch phase contrast electron microscopy of biological specimens. Ultramicroscopy. 116, 62-72 (2012).
