Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.
Abstract
Elektronen Kryo-Tomographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Strukturbiologie, der fähig ist die Visualisierung der dreidimensionalen Struktur von biologischen Proben, wie Zellen, Zellorganellen, Membranvesikel oder Viren molekularen Detail. Um dies zu erreichen, wird die wässrige Probe schnell in flüssigem Ethan, die es in einem nahe-zu-native, tiefgefrorenen Zustand bewahrt verglast. Im Elektronenmikroskop sind Kippserie bei Temperatur von flüssigem Stickstoff, aus dem 3D rekonstruierten Schichtbilder aufgezeichnet. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des tomographischen Volumen inhärent niedrig. Erkennbar, wiederkehrende Funktionen werden von subtomogram Mittelung, von denen einzelne Teilvolumina werden ausgeschnitten, ausgerichtet und gemittelt, um Lärm zu reduzieren verbessert. Auf diese Weise Maps 3D mit einer Auflösung von 2 nm oder besser erhalten werden kann. Eine Anpassung der verfügbaren hochaufgelösten Strukturen auf die 3D-Volumen erzeugt dann Atommodelle von Proteinkomplexen in ihrer natürlichen Umgebung. Hier zeigen wir, wie wir mit Kryo-Elektronen tomography, um die in-situ-Organisation von großen Membran-Protein-Komplexe in den Mitochondrien zu untersuchen. Wir finden, dass die ATP-Synthase sind in Reihen entlang von Dimeren stark gekrümmten Scheitel der inneren Membran Cristae organisiert, während komplexe I zufällig in den Membranregionen auf beiden Seiten der Reihen verteilt. Durch Mittelung subtomogram eine Struktur der mitochondrialen ATP-Synthase-Dimeres erhalten wir innerhalb der Cristae-Membran.
Introduction
Mitochondrien sind die Kraft-Häuser der Zelle. Durch Umwandeln eines elektrochemischen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran in chemische Bindungsenergie erzeugt der mitochondrialen ATP-Synthase meisten der ATP, die zellulären Prozesse steuert. Um die Mechanismen der mitochondrialen Energieumwandlung zu verstehen, müssen wir die Struktur des ATP-Synthase in situ zu bestimmen, und um herauszufinden, wie es angeordnet ist und in der inneren mitochondrialen Membran verteilt. Obwohl hochaufgelösten Strukturen der meisten mitochondrialen ATP-Synthase-Komponenten 1-3 und niedriger Auflösung die Karten der ganzen Komplex 4 zur Verfügung stehen, ist es wichtig, die Struktur und die Konformation des Arbeits Enzym in der Membran zu etablieren. Die Verteilung der ATP-Synthase in der inneren mitochondrialen Membran wurde weithin angenommen, zufällig zu sein, aber ein frühes Auffinden 5 und eigenen ersten Ergebnisse 6 angegeben, dass dies nicht ter Fall ist. Nachfolgende Studien von unserer Gruppe und andere 7 bestätigt, dass die ATP-Synthase wird in langen Reihen von Dimeren entlang der eng gekrümmten Rippen der inneren Mitochondrienmembran Cristae 8 angeordnet, während die Protonenpumpen der Elektronentransportkette erscheinen auf beiden Seiten angeordnet sein der Reihen 9. Diese Anordnung hat wichtige Implikationen für die Mechanismen der mitochondrialen Energieumwandlung.
Die Technik, die wir verwendet haben, um diese Anordnung zu bestimmen, ist Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET). Kryo-ET ist derzeit die einzige Möglichkeit, die genaue dreidimensionale (3D) Volumen der Zellen, Zellkompartimente und Organellen führt bei Molekularauflösung. Kryo-ET ist besonders geeignet für die Untersuchung großer Komplexe in biologischen Membranen, weil die Membranen scheinen mit gutem Kontrast und sind leicht in 3D-Tomographievolumen verfolgen.
Andere Methoden die 3D-Struktur von Zellen oder Organelle, um zu studierenes bieten keine molekularen Detail. Super-Resolution Lichtmikroskopie 10, 11 ist hervorragend bei der Entdeckung der Position oder Abstände zwischen Leucht Etiketten auf Proteine von Interesse mit einer Genauigkeit von zehn nm angebracht, aber es zeigt nicht die Struktur des Proteins selbst, auch bei niedriger Auflösung . Transmissionselektronenmikroskopie von Serienschnitten 12 oder Block-face-Bildgebung mittels Rasterelektronenmikroskopie 13 aus Kunststoff eingebetteten biologischen Proben mit niedriger Auflösung bieten Aussicht auf Zellvolumen, aber ebenfalls nicht verraten molekularen Detail. Rasterkraftmikroskopie 14 kann im Prinzip liefern molekularen oder sogar atomare Auflösung, aber nur an der Oberfläche der Objekte auf einem atomar glatten, festen Träger. Schließlich ist 16 unwahrscheinlich, dass die Struktur von großen, komplexen aperiodischen Objekte wie ganze Zellen oder Zellorganellen in m zeigen Röntgentomographie 15 oder Streuung von intensiven Röntgenpulse von Freie-Elektronen-LaserMOLEKULARE Auflösung in absehbarer Zeit. So werden derzeit gibt es keine Alternative zu Cryo-ET für Studien der 3D-Struktur von Zellen oder Zellorganellen auf der Nanometerauflösung.
Kryo-ET ist die Methode der Wahl zur Untersuchung der Struktur und Konformation von Membran-assoziierten Protein Anordnungen des Kernporenkomplexes 17, die Influenza Spike-Komplexe 18 und die Flagellen Motorproteine 22, 23, sondern auch die Organisation des gesamten Bakterienzellen 19 und Eingabe von pathogenen Viren, wie HIV in den Zellen 20-23. Kryo-ET ist von unschätzbarem Wert für die Visualisierung filamentöse Proteine und deren Interaktionen in der Zelle, einschließlich der Aktinfilamente 24 oder 25 axonemes. Die Auflösung kann bis 2 nm oder besser durch subtomogram durchschnittlich 26, wobei Teilvolumina der wiederholten, regelmäßigen Zügen sind aus einem tomographischen Volumen von Single-Particle Image Pro Cut und gemittelt verbessert werdenVerarbeitung Techniken.
Kryo-ET ist der Erwerb einer Reihe von Projektionsbildern eines dünnen Probe (<250 nm) bei verschiedenen Neigungswinkeln in einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) aufgenommen. Die Probe muss dünn sein, so daß Elektronen, die stark mit Materie wechselwirken, sind nicht mehr als einmal gestreut. Mehrfachstreuung macht die resultierenden Bilder schwer zu interpretieren und verringert den Kontrast. Bilder der ausgewählten Probenbereich relativ zueinander aufeinander ausgerichtet und projiziert in einen 3D-Raum durch ein geeignetes Computerprogramm, Erzeugen eines 3D-Volumens der Probe. Die Ausrichtung der Bilder wird durch Goldbezugsmarkierungen, die mit der Probe vor dem Einfrieren gemischt werden unterstützt. Idealerweise 10 oder mehr gleichmäßig verteilt Bezugsmarkierungen sollte in jedem Bild, eine gute Ausrichtung zu erreichen.
Um molekulare Detail zu beobachten, sind Proben Sprung gefroren in flüssigem Ethan, die ihre Mutter hydrierten Zustand bewahrt. Einfrieren in flüssigemEthan ist so schnell (~ 10 5 ° C / s) 27, die Wasser nicht kristallisiert, sondern bleibt in einer verglasten, glasartigen Zustand. Bildung von Eiskristallen Schäden empfindlichen biologischen Strukturen. Da biologische Proben leiden Strahlenschäden, gibt es eine Grenze für die Gesamtanzahl von Streuereignissen kann die Probe zu tolerieren. Bilder werden somit in Niedrigdosis-Modus erworben: Ein Bereich von Interesse ist bei geringer Vergrößerung (1,500X) mit einer Elektronendosis unter 1 e identifiziert - / nm 2 (Suchmodus). Das Bild wird dann bei einer höheren Vergrößerung fokussiert, aus dem Bereich von Interesse (Fokusmodus). Nur wenn ein Bild aufgenommen wird, wird der Bereich von Interesse mit einer höheren Elektronendosis (Belichtungsmodus) bestrahlt.
Hier präsentieren wir einen Überblick, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen mit ATP-Synthase-Dimere in der inneren Mitochondrienmembran als Beispiel. Das folgende Protokoll beschreibt, wie Mitochondrien für Kryo-ET vorbereiten, wie Sieund Sammeln eines Neigungs Reihe mit einer bestimmten Gesamt-Elektronendosis, und wie die Neigung Reihe mit einem 3D-Volumen des Bereichs von Interesse zu erhalten, zu verarbeiten. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
1. Herstellung von Mitochondrien aus Zellen oder Gewebe durch differentielle Zentrifugation
Dieser Abschnitt beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Isolierung von intakten Mitochondrien aus verschiedenen eukaryotischen Organismen. Die genaue Pufferkomponenten und Zentrifugation Geschwindigkeiten müssen für jedes Gewebe optimiert werden / Arten untersucht.
- Brechen Zellen in isotonischen Puffer (zB 250 mM Saccharose, 10 mM HEPES pH 7,4), unter Verwendung eines Glasperlenmühle (Pilzmyzel) 28, enzymatische Verdauung der Zellwand (Saccharomyces cerevisiae) 29, ein Kugellager Homogenisator (Einzel -cell Eukaryoten / Kultur Zellen / Nematoden) 30 oder ein Mixer (tierischen oder pflanzlichen Geweben) 31.
- Entfernen von Zelltrümmern durch Filtration durch Mull, gefolgt von Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2.000 × g, 4 ° C, 10 min).
- Sammeln Stand und Pellet Mitochondrien durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (9.000 × g, 4 ° C, 10 min).
- Wo erforderlich, verwenden Sie eine isotonische Dichte Stufengradienten für zusätzliche Reinigung der mitochondrialen Fraktion 32.
2. Herstellung von Mitochondrien für Cryo-Electron-Tomographie
Der folgende Abschnitt beschreibt, wie tiefgefrorenen Proben für Kryo-ET zu erhalten. HINWEIS: Die Methode beinhaltet die Verwendung von sehr kalten flüssigen Stickstoff und Ethan, die schwere Verbrennungen verursachen kann. Schutzbrille und Schutzhandschuhe Cryo-getragen werden. Flüssiges Ethan, das auch brennbar ist, muss in einem Abzug gehandhabt werden.
- Sedimentierte Mitochondrien in 250 mM Trehalose, 10 mM HEPES-Puffer bei pH 7,4 auf eine Konzentration von etwa 5 mg / ml Gesamtprotein.
- Gasentladungs löchrigen Kohlen EM-Gitter, Carbon Seite nach oben in einer Vakuumvorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers.
- Verflüssigen einige Milliliter von Ethan, indem ein Strom von Ethan Gas auf der Innenseite einer mit flüssigem Stickstoff kühlened Aluminiumbehälter.
- Mischen Protein A-konjugierten Goldbezugs Suspension 1: 1 mit Mitochondrien-Suspension und 3 ul sofort zu einer Glimmentladung EM Gitter in Pinzette anzuwenden.
- Platzieren der Pinzette in einem Verglasungseinrichtung, beispielsweise ein hausgemachter Guillotine. Tupfen Sie das überschüssige Flüssigkeit mit einem Keil von Filterpapier (~ 5 Sekunden oder bis keine Flüssigkeit mehr Spreizung) und sofort tauchen die Gitter in flüssigem Ethan durch Loslassen des Auslösers.
- Übertragen Sie das Gitter aus flüssigem Ethan in flüssigen Stickstoff. Während der Übertragung überschüssiges Ethan aus dem Netz mit Filterpapier. Setzen Sie die Spitze einer keilförmigen Stück Filterpapier in die Flüssigkeit Ethan. Da die Flüssigkeit Ethan steigt sanft ziehen Sie das Gitter bis das Filterpapier aber halten Sie es unter die Flüssigkeitsfront. Flüssiges Ethan vom Netz durch Kapillarwirkung entfernt und einmal alle flüssigem Ethan entfernt worden ist, das Netz sofort in flüssigem Stickstoff übertragen.
- Legen Sie die Steingitter in eine Grid-Storage-Box, einend unter flüssigem Stickstoff zu speichern zur späteren Verwendung als angemessen.
3. Aufnahme von Tomographische Tilt Series
Der folgende Abschnitt beschreibt, wie Sie und sammeln ein Tomographie Kippserie eines Mitochondrium mit einem Polara Elektronenmikroskop mit einer post-Spalte Energiefilter und CCD-Kamera ausgestattet. Ähnliche Protokolle werden mit allen Kryo-Elektronen Mikroskope mit CCD-oder direkte Elektronendetektor-Kameras eingesetzt wird.
- Richten Sie das Mikroskop
- Legen Prüfling zB Graphit und Gold-Inseln auf löchrigen Kohlenstoff-Film.
- Wählen Sie den Suchmodus in Low-Dose-System des Mikroskops.
- Bringen Probe euzentrischen Höhe. Dies ist der Punkt der minimalen XY-Bewegung beim Kippen der Probenhalter. Zentrieren Sie einen Punkt von Interesse bei 0 ° Neigung, kippen die Bühne, um 20 ° und neu zu zentrieren den Punkt durch den z-Höhe zu verändern. Zurück auf 0 ° und wiederholen, bis seitliche Versatz minimiert wird.
- WählenBelichtungsmodus. Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung zum Sammeln einer Schichtaufnahme (zB 25,000X auf Detektor ≈ 0,6 nm Pixelgröße Proben).
- Wählen Sie einen kleinen Kondensator Blende (50-70 mm), und wählen Sie eine Punktgröße und Strahlintensität, so dass der Strahl nur breiter als die bildgebenden Gerät und gibt eine Pixel Lesen von E 60 - / Pixel (CCD) oder 14 E - / Pixel / sec (direkte Elektronendetektor, Zählen Modus).
- Zentrum Kondensorapertur.
- Finden Gauß-Schwerpunkt zB Punkt minimal Kontrast. Reset Mikroskop Defokussierung Lesen und richtige Drehpunkte und Drehbearbeitungszentrum nach den Anweisungen des Herstellers.
- Zifferblatt in gewünschte Unschärfe-Tomogramm für die Aufnahme. Hinweis: Hohe Defokussierung (8 um) erhöht den Kontrast, sondern reduziert Auflösung, während niedrige Unschärfe-(2-4 um) erhöht Auflösung auf Kosten der Kontrast.
- Über einem leeren Loch, erzeugen eine neue Verstärkungsreferenz und richten Energiefilter nach HerstellerAnweisungen.
- Richten Suche und Belichtungsarten. In Belichtungsmodus zu zentrieren einen Punkt von Interesse und wechseln in den Suchmodus. Wählen Vergrößerung der 1,500X (0,033 um / Pixel Probe auf-Detektor) und Defokussierung von 100 um (für erhöhten Kontrast). Bringen Sie von Interesse zurück zum Zentrum mit Bildverschiebung Spulen.
- Im Suchmodus einstellen Punktgröße und Strahlintensität, so dass der Strahl nur breiter als die bildgebenden Gerät und gibt eine Pixel Lesen von ~ 20 e - / Pixel (CCD) oder ~ 8 e - / Pixel / sec (direkter Elektronendetektor, Zählen Modus).
- Das Finden eines guten Probenraum
- Legen Sie das Gitter mit tiefgefrorenen Mitochondrien in das Elektronenmikroskop bei Temperatur von flüssigem Stickstoff (siehe EM Herstellers).
- Im Suchmodus finden Sie in der Startaufstellung für Bereiche entsprechende Eisdicke und Probenqualität. Werfen Sie einen 6 Sek Suche Bild von vielversprechenden Bereichen um die Eignung für Tomogramm Sammlung zu bestimmen. Both der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien sollte bei dieser Vergrößerung sichtbar.
- Aufnahme eines Tomographische Tilt Series
- Sobald eine gute Probenraum gefunden wird, kippen die Bühne ± 60 °, um den maximalen Neigungsbereich, die verfügbar ist, ohne Behinderung der Ermittlung der Belichtung oder Fokus-Bereich durch Gitterstäbe oder Klumpen Eis.
- Auf einem nahe gelegenen Eis gefüllte Loch von ähnlichem Aussehen, um Belichtungsmodus ändern und die Strahlintensität oder Bildaufnahmezeit, so dass jedes aufgezeichnete Bild hat eine Elektronendosis von 30-50 E - / Pixel für CCDs oder 6-8 E - / Pixel / s direkten Elektronendetektoren, Zählen Modus.
- Berechnung der Dosisverteilungsverhältnis (I 0 / I 60) durch Teilen der Elektronenzahl für 1 Sekunde Bild bei 0 ° mit der eines Bild 60 ° erfasst. Dieses Verhältnis beschreibt die Zunahme der Belichtungszeit erforderlich ist, um eine konstante Elektronenzahl pro Bild mit zunehmendem Neigungswinkel (Belichtungszeit = 1 / C zu haltenOS (α) n (I 0 / I 60) = 2 n). Das Verhältnis dient auch als guter Indikator für die Eisdicke. Gute Tomogramme von Mitochondrien in der Regel mit einem I 0 / I 60 = 2,3-2,6 aufgezeichnet.
- Über einem leeren Loch, erwerben eine 1 sec Belichtungsmodus in Bild und beachten Sie die Elektronenzahl pro Å 2. Unter Berücksichtigung der Dosisverteilung Verhältnis, die Berechnung der Gesamtzahl der Bilder, die für einen bestimmten Gesamtelektronendosis aufgenommen werden können (zB <40 E - / A 2 für die Strukturbestimmung & ~ 160 E - / A 2 für Morphologie).
- Bestimmung der geeigneten Neigungsintervall für Tomogramm Sammlung, indem die Gesamtneigungsbereich (zB 120 ° ± 60 ° für) durch die Gesamtzahl der Bilder in 3.3.4 berechnet.
- Einrichten und Aufzeichnen einer Schichtaufnahme mit den oben mit geeigneten automatischen Datenerfassungs-Software 3 ermittelten Parameter3, 34. Tilt-Serie sind in der Regel bei ± 20 ° gestartet und gehen durch 0 ° vor Erreichen hoher kippt, um die Informationsinhalte von Low-Neigungs Bilder, die durch die Erhöhung Elektronendosis zerstört wird, zu maximieren.
4. Erstellung und Segmentierung von Tomographische Volumes
In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie tomographischen Volumen von Mitochondrien aus Kippserie und wie die Volumina für die allgemeine Betrachtungs vorhanden sind erzeugt.
- Speichern Sie die tomographischen Kippserie zu einem geeigneten Verzeichnis. Generieren eines Bildstapels und die Umwandlung in eine geeignete Dateiformat mit Open-Source-Software wie dm2mrc oder tif2mrc (IMOD-Paket), die .dm3, .dm4 oder TIF-Dateien zu konvertieren MRC-Stacks. MRC-Stacks für tomographische Rekonstruktion mit IMOD 35 erforderlich. Andere Pakete erfordern unterschiedliche Formate.
- Richten Sie die Bilder und erzeugen ein Tomogramm indem Sie die Schritte in der Anleitung beschrieben IMOD (
- Erhöhen den Kontrast des Schnittbildes mit Hilfe der nicht-linearen anisotropen Diffusionsfilter mit IMOD verteilt. Dieser Filter eignet sich gut für Membranen und Membran-assoziierten Teilchen, wie die ATP-Synthase.
- Zur Visualisierung, manuell Segment das Tomogramm mit kommerziell erhältlichen Programme zB Amira. Zuweisen Voxel entsprechend der inneren oder äußeren Membran und erzeugen eine Oberfläche. Verwendung des Clicker-Option in der EM-Paket-Plugin für AMIRA 36 markieren die Lage der ATP-Synthase-Partikel.
5. Subtomogram Mittelung von ATP-Synthase Dimere und Montage von X-Ray-Strukturen
Der folgende Abschnitt beschreibt, wie subtomogram Durchschnittswerte der ATP-Synthase-Dimere erhalten werden kann.
- Mit den markierten Partikel als Eingabe und einer entsprechenden Software-Paket wie die "Partkel Schätzung für Elektronen-Tomographie-Programm, berechnen subtomogram Durchschnitt.
- Antrag Schätzung vergleichen zwei unabhängig bestimmt subtomogram Durchschnitte durch Fourier-Shell-Korrelation 37.
- Falls verfügbar, Dock bekannten Röntgenstrukturen in den subtomogram Durchschnitt von starren Körper anliegend, entweder manuell oder mit Hilfe der automatischen sequentiellen Docking-Routinen, wie sie im Programm 38 Chimera.
Representative Results
Elektronen Kryo-Tomogramme Mitochondrien zeigen deutlich die 3D-Morphologie des Organelle (Abbildung 2). Manuelle Segmentierung der Membranen in einer tomographischen Volumen veranschaulicht die Struktur der Cristae im Mitochondrium. Durch Abbilden Mitochondrien von Hefe verschiedenen Knockout-Stämme, die bestimmte Protein-Komponenten fehlen, kann die Wirkung dieser Proteine auf Cristae Morphologie beurteilt durch. 3 zeigt ein Mitochondrium aus einem Hefestamm ohne ATP-Synthase-Untereinheit E. Für die Dimerisierung des mitochondrialen ATP-Synthase wird diese Komponente der ATP-Synthase-Komplex erforderlich ist. Mitochondrien aus diesem Stamm fehlt die normalen Lamellen Cristae Mitochondrien des Wildtyp (Figur 2) und eine Anzahl von inneren Kammern Membran anstelle enthalten. Diese Kammern sind entweder frei von Cristae oder geringe ballonförmigen Membran Einstülpungen (Abbildung 3).
In tomograms mit gutem Kontrast, großer mitochondrialen Protein-Komplexe, in diesem Fall ATP-Synthase-Dimere, leicht sichtbar (Figur 4; Film 1). (; Movie 2 Abbildung 5) Die Strukturen der Komplexe können bei 2-3 nm Auflösung von subtomogram Mittelung bestimmt werden. (; Movie 3 6) die durchschnittlichen Volumina zurück in das Tomogramm, um die Organisation der einzelnen Komplexe relativ zueinander und zu anderen Protein-Komplexe in der Membran zu beurteilen platziert werden.
Abbildung 1. Flussdiagramm, das die Phasen der Elektronen Kryo-Tomographie. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2. Morphologie eines Mitochondrium aus Wildtyp-S. Cerevisiae. Zentral Scheibe durch einen tomographischen Volumen eines Wildtyp S. cerevisiae Mitochondrien (links) und entsprechende Oberfläche-Volumen gerendert (rechts). Die segmentierte Volumen der äußeren Membran wird grau dargestellt und die Volumina der inneren Grenze und Cristae Membranen in hellblau. Von Davies et al 8 angepasst. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. Mitochondrium von einer S. Cerevisiae-Stamm fehlt eine Untereinheit für erforderlichATP-Synthase-Dimerisierung. Scheibe durch tomographische Volumen (links) und oberflächen gemacht Volumen (rechts) einer Mitochondrium von einem Begleit S. Cerevisiae-Stamm fehlt das E für die ATP-Synthase Dimerisierung erforderlich Proteinuntereinheit. Wenn sie mit Figur 2 verglichen wird, das Mitochondrium aus dem mutierten Stamm fehlt die normalen Lamellen Cristae von Wildtyp-Mitochondrien. Stattdessen hat das Mitochondrium viele innere Membran Fächer entweder mit keinem oder Cristae ballonförmigen Cristae. Elektronen Kryo-Tomographie unterstreicht damit Veränderungen in Membranmorphologie durch Gen-Deletionen. Von Davies et al 8 angepasst. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Figure 4. Mitochondrium aus dem Pilz P. anserina. tomographischen durch Volumen (links) und die dazugehörigen Oberflächen gemacht Volumen (rechts) einer Mitochondrium vom Fadenpilz P. in Scheiben schneiden anserina. In diesem Schnittbild, werden die Zeilen von 10 nm-Partikel (gelb Pfeilspitzen) über stark gekrümmte Membranrücken in der inneren Membran Cristae (siehe Video 1). Diese Teilchen wurden als ATP-Synthase Dimere subtomogram Lung identifiziert. Von Davies et al. 9 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 5. Struktur und Organisation der mitochondrialen ATP-Synthase. Side und Top-Ansicht, die die Elektronendichte eines ATP-Synthase Dimer aus S. c erevisiae wie subtomogram Mittelung mit Einbauatommodelle (links) bestimmt. Inneren Mitochondrienmembran-Vesikel, die die Organisation der ATP-Synthase-Dimere in Reihen (rechts). Die Figur wurde durch die Positionierung des subtomogram Durchschnitt der ATP-Synthase-Dimer in dem segmentierten Volumen der Membran-Vesikel, unter Verwendung der während der Mittelung berechneten Koordinaten erzeugt. Von Davies et al 8 angepasst. Atommodelle: F 1 / Rotor-Ring [PDB: 2WPD] 39 (blau und lila); Oligomycin empfindlich verleihen Protein-OCSP [PDB: 2BO5] 40 (grün); peripheren Stiel Fragment [PDB: 2CLY] 1 mit N-terminalen Reste von [PDB: 2WSS] 2 (gelb und rot) (siehe Video 2). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
_upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Abbildung 6. Isolierte Crista Vesikel aus einer P. anserina Mitochondrien. Scheiben von einem tomographischen Volumen (links) und die dazugehörigen Oberflächen gemacht Volumen (rechts) einer Crista Vesikel aus P. anserina. Proteindichten von der Membran vorsteht sind deutlich sichtbar. Die durch gelbe Pfeilspitzen markiert Dichten ATP-Synthase-Dimere, wie subtomogram Mittel identifiziert. Grüne Pfeilspitzen weisen auf Dichten von Antikörpermarkierung als NADH-Dehydrogenase identifiziert (Komplex 1; Details siehe 9). Segmentierung der Proteindichten zeigt die Organisation der Cristae, mit der ATP-Synthase-Dimere (rot und gelb) Bilden Reihen entlang der stark gekrümmten Cristae Rippen und den NADH-Dehydrogenase-Komplexen (grün) in die Membranbereiche auf beiden Seiten der Reihen (siehe Film 3). Von Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Film 1. Kryo-Elektronen-Tomogramm eines P. anserina Mitochondrien. Der Film zeigt aufeinander folgende Scheiben durch eine tomographische Volumen eines Mitochondrium aus dem Fadenpilz P. genommen anserina. Reihen der ATP-Synthase durch gelbe Pfeilspitzen angezeigt. Das oberflächen gemacht, segmentierten Volumen zeigt die Lage der ATP-Synthase (gelbe Kugeln) in Bezug auf die 3D-Struktur Cristae. Außenmembran, grau; inneren Grenzmembran, transparent blau; Cristae-Membranen, opak blau. Von Davies et al 9. Siehe auch Abbildung 4. Klicken Sie hier, um Video anzusehen.
Film 2. Subtomogram Durchschnitt der mitochondrialen ATP-Synthase Dimer aus S. Cerevisiae mit Einbauatommodelle. Der Durchschnitt warvon 121 Teilvolumina berechnet. Die Dichte wird auf drei Ebenen Kontur angezeigt: 1s - Mesh, 2 s - Lichtgrau und 3s - dunkelgrau. Atommodelle wurden in der Dichte mit der sequentiellen fit Routine in Chimera ausgestattet. Atommodelle: F 1 / Rotor-Ring [PDB: 2WPD] 39 (blau und lila); Oligomycin empfindlich verleihen Protein-OCSP [PDB: 2BO5] 40 (grün); peripheren Stiel Fragment [PDB: 2CLY] 1 mit N-terminalen Reste von [PDB: 2WSS]. 2 (gelb und rot) Klicken Sie hier, um Video anzusehen.
Von Davies et al 8 angepasst. Siehe auch Abbildung 5.
Film 3. Isoliert Cristae Vesikel aus einer P. anserina Mitochondrium. Aufeinanderfolgende Schnitte durch das tomographische Volumen angezeigt, gefolgt von der Segmentoberfläche gerendert Volumen. Protein von der Membran Dichten hervorstehendene sind deutlich sichtbar. Rote und gelbe Dichten ATP-Synthase-Dimere. Gründichten sind NADH-Dehydrogenase (Komplex I), wie durch Antikörpermarkierung bestimmt. Von Davies et al 9. Siehe auch Abbildung 6. Klicken Sie hier, um Video anzusehen.
Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll bietet eine Einführung in Cryo-ET und subtomogram Lung von Mitochondrien, aber im Wesentlichen die gleiche Vorgehensweise kann zu jeder anderen Zellkompartiment oder einer Membran aufgetragen werden. Um die bestmöglichen Daten zu erhalten, kritische Schritte während des Verfahrens sind die Probenvorbereitung, die Tauchgefrierprozess und Datenakquisitionsstrategie. Probenqualität, die für den Erfolg entscheidend ist, hängt von einer optimierten Gefrierprotokoll an geeignete Eisdicke, die aus guten Bildkontrast größter Bedeutung ist zu gewährleisten. Die optimale Datenakquisitionsstrategie hängt von dem Instrument und der Probe. Parameter, die optimiert werden können, umfassen Elektronendosis pro Bild, Neigung und Unschärfe-Schema. Erwerb eine gute Schnittbild eines guten Proben macht alle weiteren Verarbeitungsschritte einfacher und sorgt für ein zufriedenstellendes Endergebnis.
Cryo-ET mit subtomogram Mittelung und Atommodell passend kombiniert bietet Details, wie Protein-Komplexe sind in th angeordnetEIR nativen Zellumgebung. Die Technik ist gleichermaßen geeignet für die Untersuchung der Struktur von großen Membranproteinkomplexen, wie Atmungskette-Super (1,7 MDa), ATP-Synthase-Dimere (2x500 kDa), bzw. des Kernporenkomplexes (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Die Organisation der ATP-Synthase-Dimere in Zeilen kann nicht durch hochauflösende Techniken wie Röntgenkristallographie, NMR oder Einzelpartikel-Kryo-EM beobachtet werden, da die Dimer-Reihen durch Detergens-Extraktion, die ein notwendiger Schritt bei der Isolierung gestört und Reinigung der Membranproteinkomplexen.
Die Anordnung der ATP-Synthase, die in Reihen von Dimeren entlang Cristae Rippen ist ein universelles Organisationsprinzip der Mitochondrien in allen Arten. Die Protonen-Pumpen-Komplexe der Elektronentransportkette, insbesondere Komplex I (NADH-Dehydrogenase), sind in den Membranflächen zu beiden Seiten der Reihen 8 angeordnet,9. Diese Organisation der Atmungskette hat tiefgreifende Auswirkungen auf die mitochondriale Bioenergetik. Wenn die Dimer-Reihen nicht auf das Fehlen von Dimer-spezifische Protein-Untereinheiten bilden, die Zellen aufweisen Generationszeiten länger und reduzierten zellulären Fitness, wie in der in Figur 3 41 gezeigt Hefe-Mutante beobachtet. Mit dem wachsenden Interesse an mitochondrialer Erkrankungen, eine detaillierte Verständnis der molekularen Grundlagen über mitochondrialen Ultrastruktur und Funktion ist von größter Bedeutung. Elektronen Kryo-Tomographie eine Verbindung zwischen Proteinstruktur durch hochauflösende Methoden bestimmt, und die Verteilung und Anordnung dieser Proteine in der Membran in der Größenordnung von Nanometern. Dies macht Kryo-ET ein wesentliches Instrument für das Verständnis der mitochondrialen Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit.
Weitere technische Entwicklungen und Verbesserungen in der Kryo-ET sind Protein-Markierungsstrategien, um die Position zu ermitteln protein Untereinheiten in makromolekulare Komplexe oder die Lage der kleinere oder weniger ausgeprägten Proteine (<0,5 MDa) in Zellen. Darüber hinaus haben Hybrid-EM Verarbeitungsmethoden, die subtomogram Mittelung mit Einzelpartikelanalyse oder Wendel Rekonstruktion kombinieren kürzlich bestimmt Proteinstrukturen zu ~ 8 Å 42, 43. Diese Verarbeitungsverfahren sind derzeit auf gereinigte Proteine, die gut in Eis getrennt sind oder bilden spiralförmigen Baugruppen und sind derzeit nicht für überfüllten zellulären Umgebungen wie Mitochondrien und Cristae Membranen beschränkt. Für die Datenerhebung werden neue Computer-und Hardware-Tools entwickelt, um die automatische Schnittbild Erwerb zu ermöglichen, erhöhen den Bildkontrast und reduzieren insgesamt benötigte Elektronendosis. Die einzige grundlegende Einschränkung in Kryo-ET Strahlung Schädigung der Probe durch den Elektronenstrahl. Dies bedeutet, dass nur sehr geringe Elektronendosen verwendet werden, um jedes Bild einer tomographischen Kippserie aufzuzeichnen, was zu einem schlechten Signal-t werdeno-Rausch-Verhältnis, die letztlich begrenzt die erreichbare Auflösung. Die neue direkte Elektronendetektoren, veröffentlicht weniger als vor einem Jahr, revolutionieren derzeit den Bereich des Einzelpartikel-Kryo-EM 44, 45. Diese neuen Detektoren höheren Kontrast und eine bessere Auflösung bei niedrigeren Elektronendosen. Für Kryo-Elektronentomographie bedeutet dies, dass Kippserie mit kleineren Schrittweiten oder auch Doppelachsenschnittbilder ohne übermäßig hohe Strahlenschäden (ein CCD-Bild entspricht in Elektronendosis bis 5 direkten Elektronendetektor Bilder) gesammelt werden. Die riesigen Datenmengen, die von diesen Detektoren erzeugten ihre eigenen Herausforderungen im Umgang mit Daten, Verarbeitung und Lagerung, die es zu überwinden werden.
Außerdem Phasenplatten, die auf ähnlichen Prinzipien wie die routinemäßig in der Lichtmikroskopie verwendet zu arbeiten, um Phasenkontrast zu erhöhen, werden derzeit für die Transmissionselektronenmikroskopie 46, 4 entwickelt7. Damit sollte Schichtaufnahmen näher gesammelt, um zu fokussieren und damit mit einer höheren Auflösung, während zur gleichen Zeit die Erhaltung niedriger Auflösung bietet für die Ausrichtung und Interpretation der tomographischen Mengen notwendig. Zusammengenommen werden diese technologischen Fortschritte stark erweitern die Palette der biologischen Fragen, die durch Kryo-ET angesprochen werden können.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM und WK), des Exzellenzclusters Frankfurt "Makromolekulare Komplexe" von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (WK) und einem Postdoc-EMBO Long-Term finanziert unterstützt Fellowship (VAMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
| Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
| Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
| Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
| Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
| Consumables | |||
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
| Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
| EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
| Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
| Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
| Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
| Blender | Waring | 8011S | |
| Glass bead mill - bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
| Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
| Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
| Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
| Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
| Direct electron detector | Gatan | K2 summit | 4k x 4k pixels, counted mode |
| Charge coupled device (CCD) | Gatan | US4000 | 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector) |
| Energy filter | Gatan or Jeol | ||
| Software | |||
| Image acquisition software | Gatan | ||
| Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
| Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
| Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
| Tomogram visualization software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
| Visualization software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
| Structure visualization software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ | |
References
- Dickson, V. K., Silvester, J. A., Fearnley, I. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. On the structure of the stator of the mitochondrial ATP synthase. The EMBO journal. 25, 2911-2918 (2006).
- Rees, D. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. The structure of the membrane extrinsic region of bovine ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21597-21601 (2009).
- Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G., Walker, J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 16823-16827 (2010).
- Baker, L. A., Watt, I. N., Runswick, M. J., Walker, J. E., Rubinstein, J. L. Arrangement of subunits in intact mammalian mitochondrial ATP synthase determined by cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 11675-11680 (2012).
- Allen, R. D., Schroeder, C. C., Fok, A. K. An investigation of mitochondrial inner membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. The Journal of cell biology. 108, 2233-2240 (1989).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO journal. 27, 1154-1160 (2008).
- Dudkina, N. V., Oostergetel, G. T., Lewejohann, D., Braun, H. P., Boekema, E. J. Row-like organization of ATP synthase in intact mitochondria determined by cryo-electron tomography. Biochimica et biophysica acta. 1797, 272-277 (2010).
- Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D., Kühlbrandt, W. Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13602-13607 (2012).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14121-14126 (2011).
- Wurm, C. A., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13546-13551 (2011).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Austin, J. R. 2nd, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43, 612-620 (2012).
- Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N., Scheuring, S. Rows of ATP synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophysical journal. 93, 2870-2876 (2007).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Current opinion in structural biology. 20, 623-631 (2010).
- Miao, J., Hodgson, K. O., Sayre, D. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 6641-6645 (2001).
- Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure. 20, 998-1006 (2012).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (39), (2010).
- Bharat, T. A., et al. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4275-4280 (2012).
- Bennett, A. E., et al. Ion-abrasion scanning electron microscopy reveals surface-connected tubular conduits in HIV-infected macrophages. PLoS pathogens. 5, e1000591 (2009).
- Liu, J., et al. Cellular architecture of Treponema pallidum: novel flagellum, periplasmic cone, and cell envelope as revealed by cryo electron tomography. Journal of molecular biology. 403, 546-561 (2010).
- Liu, J., et al. Intact flagellar motor of Borrelia burgdorferi revealed by cryo-electron tomography: evidence for stator ring curvature and rotor/C-ring assembly flexion. Journal of bacteriology. 191, 5026-5036 (2009).
- Patla, I., et al. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. Nature cell biology. 12, 909-915 (2010).
- Heuser, T., et al. Cryoelectron tomography reveals doublet-specific structures and unique interactions in the I1 dynein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2067-E2076 (2012).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Current opinion in structural biology. 23, (2013).
- Cheng, D., Mitchell, D. R. G., Shieh, D. B., Braet, F. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology. Méndez-Vilas, A. 2, Formatex. (2012).
- Brust, D., et al. Cyclophilin D links programmed cell death and organismal aging in Podospora anserina. Aging cell. 9, 761-775 (2010).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (30), (2009).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical biochemistry. 413, 123-132 (2011).
- Pavlov, P. F., Rudhe, C., Bhushan, S., Glaser, E. In vitro and in vivo protein import into plant mitochondria. Methods in molecular biology. 372, 297-314 (2007).
- Graham, J. M., et al. Ch. 3, Current protocols in cell biology. Bonifacino, J. S. , John Wiley and Sons. (2001).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment, and reconstruction. Journal of structural biology. 157, 138-147 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, 71-76 (1996).
- Pruggnaller, S., Mayr, M., Frangakis, A. S. A visualization and segmentation toolbox for electron microscopy. Journal of structural biology. 164, 161-165 (2008).
- Scheres, S. H., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature methods. 9, 853-854 (2012).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Dautant, A., Velours, J., Giraud, M. F. Crystal structure of the Mg.ADP-inhibited state of the yeast F1c10-ATP synthase. The Journal of biological chemistry. 285, 29502-29510 (2010).
- Carbajo, R. J., et al. Structure of the F1-binding domain of the stator of bovine F1Fo-ATPase and how it binds an alpha-subunit. Journal of molecular biology. 351, 824-838 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO journal. 21, 221-230 (2002).
- Bharat, T. A., et al. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature. 487, 385-389 (2012).
- Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G., Subramaniam, S. Protein secondary structure determination by constrained single-particle cryo-electron tomography. Structure. 20, 2003-2013 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods. , (2013).
- Danev, R., Nagayama, K. Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM. Ultramicroscopy. 111, 1305-1315 (2011).
- Walter, A., et al. Practical aspects of Boersch phase contrast electron microscopy of biological specimens. Ultramicroscopy. 116, 62-72 (2012).
