قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي
Summary
ويشارك الكالسيوم في العديد من مسارات الإشارات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. تصوير الخلايا الحية يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون مضيعة للوقت. تم تحسين A، طريقة بسيطة سريعة باستخدام عداد الكريات تدفق لتحديد التغيرات النسبية في الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية ملتصقة جلبت الى تعليق.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
الكالسيوم هو رسول الثاني المهم مسؤولة عن نقل الإشارات الخلوية والفسيولوجية المرضية 1. يتم الاحتفاظ تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي منخفض من خلال نشاط مضخات الكالسيوم والمبادلات الكالسيوم. و/ هيولي باطني أتباز شبكية الهيولى العضلية الكالسيوم (SERCA) الغيارات الشبكة الإندوبلازمية (ER) تخزين الكالسيوم كجزء من نظام "تسرب مضخة" في حين أن أتباز الكالسيوم غشاء البلازما (PMCA) يقذف الكالسيوم إلى الخلية مقصورة، سواء في الأدب ATP التي تعتمد على 2. رسل الفسيولوجية، مثل الهرمونات أو الناقلات العصبية، نقل إشارات من خلال مستقبلات البروتين G-جانب، وتفعيل فسفوليباز C، والتي تتحلمأ فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PIP2) في الغشاء البلازمي لتوليد مادة ال diacylglycerol واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) 3. في حين لا تزال مادة ال diacylglycerol في غشاء البلازما، IP3 ينشر في العصارة الخلوية وتربط لمستقبلات IP3يتم تحريرها ل (IP3Rs)، والتي يتم تفعيلها يجند قنوات الكالسيوم، وجدت في الغشاء ER والكالسيوم من مخزن ER اللمعية وبلغت ذروتها في زيادة تركيز الكالسيوم عصاري خلوي 4. طريق بديل للكالسيوم للوصول إلى العصارة الخلوية هو من خلال قنوات الكالسيوم والمبادلات موجودة في غشاء البلازما. وقد وصفت الحديث المتبادل بين هذين القسمين: الإفراج الكالسيوم الناجم عن الكالسيوم (CICR) حيث يدفع الكالسيوم خارج الخلية إطلاق الكالسيوم من ER 5 مخازن، ومتجر يعمل دخول الكالسيوم (SOCE) حيث تفريغ مخازن ER هو الذي تشعر به STIM ويسبب افتتاح Orai قنوات الكالسيوم في غشاء البلازما لتعزيز إعادة تعبئة مخازن ER 6.
في ظل الظروف المرضية في جسم المريض، والاستجابة الخلوية هي زيادة الكالسيوم الكالسيوم تحرير سعر وعصاري خلوي في غياب محفزات الفسيولوجية 1. قد تتأثر الاستجابة الكالسيوم في عدد من الطرق: لفترة طويلة الكالسيومإشارة، تأخر إزالة الكالسيوم من العصارة الخلوية، ونضوب مخازن الكالسيوم أو تغيرات محلية في الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تأخذ على دور مركزي في التخزين المؤقت والإفراج عن الكالسيوم 7. لفترات طويلة و / أو فوق الأعظمي زيادة الكالسيوم عصاري خلوي يؤدي إلى موت الخلايا. في الحقيقة، الكالسيوم هو في كثير من الأحيان لا تشارك في الاستجابة المرضية الخلوية ويعد حدثا رئيسيا في مجموعة واسعة من الأمراض، مثل أمراض الاعصاب، أمراض القلب، والسرطان، وأمراض العظام وأمراض الكلى، والتي ترتبط بشكل رئيسي مع موت الخلايا وفقدان أو تغيير الجهاز أو الأنسجة ظيفة 8-10. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط اضطراب الإشارات الكالسيوم إلى التكيف الخلوي والتغيرات في الوظائف الخلوية والاستجابات.
تقليديا، يتم قياس اشارات الكالسيوم مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت سالبة الشحنة التي يتم تحميلها إلى الخلايا في خلية acetoxymethyl نفاذية (AM) شكل استر. مرة واحدة من قبل المشقوق esteras الخلويةوفاق، لا تزال المؤشرات الفلورسنت داخل حجرة داخل الخلايا وتزيد في كثافة مضان عندما يرتبط الكالسيوم. مؤشر الكالسيوم أكثر من المعروف جيدا والمستخدم هو ratiometric FURA-2 التي وضعها روجر تسين وزملاؤه 11. مؤشرات الكالسيوم مع اختلاف الانتماءات للكالسيوم تسمح حمامات الكالسيوم مختلفة ليتم رصدها. وتشمل طرق الكشف التصوير الخلية الحية، ومضان قارئ صفيحة ميكروسكوبية والتدفق الخلوي. حركية سريعة نسبيا من إشارات الكالسيوم (عادة في غضون بضع ثوان إلى دقائق) يجعل الخلية الحية التصوير أفضل طريقة لكسب أكبر قدر من المعلومات عن خصائص إشارة الكالسيوم. وبصرف النظر عن حركية السريعة للإشارات الكالسيوم (داخل ميلي ثانية)، تصوير الخلايا الحية هو أفضل طريقة لدراسة التقسيم الخلوي للإشارات الكالسيوم داخل خلية واحدة (12). ويمكن حساب تركيز الكالسيوم المطلقة من خلال تحديد الحد الأدنى والحد الأقصى مضان من الكالسيوم الصناعيةicator بإضافة الكالسيوم وخالب permeabilizing الخلايا، على التوالي، كما وصفها Grynkiewicz وآخرون 11.
وقد تم تطوير استخدام التدفق الخلوي لقياس اشارات الكالسيوم الأول في 1980s في الخلايا المناعية حيث الفرصة لقياس معلمات متعددة، مثل سلامة الغشاء والفصل بين سكان الخلية، وشرط من الخلايا في تعليق جنبا إلى جنب مع تطور الطول الموجي واحد مؤشرات الكالسيوم جعلت التدفق الخلوي وسيلة مثالية وconvenientdetection 13-15. في الخلايا الملتصقة، ويوفر تصوير الخلايا الحية على معظم المعلومات عن إشارات الكالسيوم، والأهم من حركية، ولكن يتطلب الإعداد معقدة تضم المجهر مضان، نظام نضح، والحفاظ على البيئة الخلوية، مثل درجة الحرارة، والبرمجيات المجهر المتخصص لاكتساب وتحليل البيانات. طرق بديلة مثل قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية أو pharmacolوسائل ogical من خلال استخدام chelators الكالسيوم هي لا تضاهى من حيث المعلومات المكتسبة. التدفق الخلوي أصبح أكثر استخداما لمراقبة الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الملتصقة مع ذلك، في معظم الدراسات، وتجرى القياسات فقط نقطة النهاية. باستخدام طريقة تم تطويرها في البداية من قبل جيرجيلي آخرون في الخلايا البائية المناعية 16، وقد تم قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي مجانا عن طريق التدفق الخلوي مع حركية في الوقت الحقيقي ورصد كثافة مضان في الخلايا الفردية من سكان العينة بنجاح في سرطان الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية السرطانية الهجينة 17. هذه الطريقة تم تكييفها للاستخدام في مزيد من الخلايا الظهارية ملتصقة، التي يصعب تحميل مع مؤشرات الكالسيوم 18.
هنا، وذلك باستخدام خط الخلايا الظهارية ملتصقة خلد المستمدة من قطاع S1 من النبيبات الدانية الكلى الفئران (WKPT-0293 Cl.2) 19، وصفنا لم مبسطة الأمثلethod لقياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي من خلال التدفق الخلوي. منذ العديد من الخلايا الظهارية تمتلك عددا من شركات النقل للمركبات الأيونية العضوية وتحميل خلايا مع مؤشر الكالسيوم يمكن ان يكون تحديا. لمنع هروب رأس المال من المؤشرات الكالسيوم، البروبينسيد، والمانع من تنميط النقل أنيون العضوية وضعت في الأصل لتقليل إفراز الكلى من البنسلين 20، يتم تطبيقها في وقت واحد في المتوسط الحضانة. تتم المحافظة على الخلايا في الطبقات الوحيدة لتحميل مؤشر الكالسيوم، وجلبت الى تعليق والكالسيوم إشارات يمكن الكشف عنها على الفور بعد إضافة مركب.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكالسيوم هو الحدث الرئيسي في العمليات الخلوية متعددة بوصفها الثاني جزيء رسول الإشارات وأيضا كوسيلة للتواصل بين ER والميتوكوندريا. القدرة على قياس التغيرات في تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي الحر هو تقنية مفيدة يمكن أن تنطبق على جميع مجالات بيولوجيا الخلية. هناك عدة ط?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل البحوث في المختبرات من قبل مؤسسة فريتز بندر، ميونيخ، ألمانيا (لTD) وجامعة ويتن / Herdecke منحة بحثية الداخلي (لجورج-KL). نود أن نشكر الأستاذ الدكتور الدكتور فرانك Thévenod (معهد علم وظائف الأعضاء، الفيزيولوجيا المرضية والسموم بجامعة ويتن / Herdecke) للحصول على اقتراحات مفيدة.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it’s good, it’s very very good, but when it’s bad, it’s horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,’ p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
