Summary
Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.
Introduction
Il calcio è un importante secondo messaggero responsabile della trasmissione dei fisiologica cellulare e segnali fisiopatologici 1. Le concentrazioni di calcio citosolico sono tenuti bassi attraverso l'attività di pompe e scambiatori di calcio di calcio. Il / ATPasi del reticolo endoplasmatico calcio sarcoplasmatico (SERCA) riempie il reticolo endoplasmatico (ER) negozio di calcio come parte di un sistema di "perdita della pompa", mentre l'ATPasi della membrana plasmatica di calcio (PMCA) estrude calcio al compartimento extracellulare, sia in maniere ATP-dipendenti 2. Messaggeri fisiologici, come gli ormoni o neurotrasmettitori, trasmettono i loro segnali attraverso G-recettori accoppiati alle proteine, l'attivazione della fosfolipasi C, che idrolizza fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) nella membrana plasmatica per generare diacilglicerolo e inositolo trifosfato (IP3) 3. Mentre diacilglicerolo rimane nella membrana plasmatica, IP3 diffonde nel citosol e si lega al recettore IP3s (IP3Rs), che sono ligandi attivano i canali del calcio, che si trova nella membrana ER e il calcio viene rilasciato dal negozio ER luminale si conclude con un aumento delle concentrazioni di calcio citosolico 4. Una via alternativa a calcio per raggiungere il citosol è attraverso i canali del calcio e scambiatori presenti nella membrana plasmatica. Crosstalk tra questi due comparti sono stati descritti: rilascio di calcio di calcio indotto (CICR) in cui il calcio extracellulare induce il rilascio di calcio dai depositi ER 5, e conservare Entry operato di calcio (Soče), dove lo svuotamento dei depositi ER viene rilevata da STIM e provoca l'apertura di Orai canali del calcio nella membrana plasmatica per promuovere riempimento dei negozi ER 6.
In condizioni fisiopatologiche, la risposta cellulare di calcio è un aumento di calcio citosolico liberalizzati e in assenza di stimolatori fisiologici 1. La risposta di calcio può essere effettuata in vari modi: prolungata calciodel segnale, ritardato la rimozione del calcio dal citosol, esaurimento delle riserve di calcio o modifiche localizzate del calcio. Inoltre, i mitocondri assumono un ruolo centrale nel buffer e liberando calcio 7. Prolungato e / o sovramassimale aumento di calcio citosolico porta alla morte cellulare. In realtà, il calcio è il più delle volte coinvolto nella risposta cellulare e fisiopatologico è un evento chiave in una vasta gamma di malattie, come le malattie neurodegenerative, le malattie cardiache, il cancro, le malattie delle ossa e malattie renali, che sono principalmente associato con la morte delle cellule e la perdita o l'alterazione di organo o tessuto funzione 8-10. Inoltre, perturbazione dei segnali di calcio è stato collegato a adattamento cellulare e cambiamenti nelle funzioni e risposte cellulari.
Tradizionalmente, segnali di calcio sono misurati con un indicatore di calcio fluorescenti carica negativa che viene caricato in cellule in una cella acetossimetil permeabili (AM) forma estere. Una volta spaccati da Esteras cellularies, gli indicatori fluorescenti rimangono all'interno del compartimento intracellulare e aumentano di intensità di fluorescenza quando il calcio è legato. L'indicatore di calcio più conosciuto e utilizzato è il raziometrico Fura-2 sviluppato da Roger Tsien e colleghi 11. Indicatori di calcio con differenti affinità per il calcio consentono diverse piscine di calcio da monitorare. Metodi di rilevamento includono l'imaging cellulare dal vivo, lettore di micropiastre a fluorescenza e citometria a flusso. La cinetica relativamente veloce dei segnali di calcio (di solito nel giro di pochi secondi a minuti) rende l'imaging cellulare dal vivo il metodo migliore per ottenere la maggior parte delle informazioni sulle caratteristiche del segnale calcio. A parte la cinetica rapida dei segnali di calcio (nel giro di millisecondi), l'imaging cellulare dal vivo è un metodo migliore per studiare compartimentalizzazione cellulare di segnalazione di calcio all'interno di una singola cella 12. Le concentrazioni di calcio assoluti possono essere calcolate determinando la fluorescenza minima e massima della ind di calcioicator aggiungendo un chelante del calcio e permeabilizzante cellule, rispettivamente, come descritto da Grynkiewicz et al. 11.
L'uso di citometria a flusso per misurare segnali di calcio è stato sviluppato nel 1980 in cellule immunologiche dove la possibilità di misurare più parametri, come l'integrità della membrana e la separazione della popolazione cellulare, e il requisito di cellule in sospensione in combinazione con lo sviluppo di singola lunghezza d'onda indicatori di calcio fatto citometria a flusso un metodo ideale e convenientdetection 13-15. In cellule aderenti, cellule vive fornisce più informazioni sulla segnalazione di calcio, soprattutto la cinetica, ma richiede una configurazione complicata comprendente un microscopio a fluorescenza, un sistema di perfusione, manutenzione dell'ambiente cellulare, come la temperatura, e il software microscopio specializzato per acquisire e analisi dei dati. Metodi alternativi come ad esempio un lettore di micropiastre a fluorescenza o Pharmacolmezzi ogical attraverso l'uso di chelanti del calcio sono incomparabili in termini di informazioni acquisite. Citometria a flusso sta diventando più ampiamente usato per monitorare calcio citosolico in cellule aderenti però, nella maggior parte degli studi, solo punto finale vengono effettuate misurazioni. Utilizzando il metodo sviluppato inizialmente da Gergely et al. In cellule B immunologiche 16, cambiamenti nella concentrazione di calcio libero citosolico di citometria a flusso con una cinetica in tempo reale e monitorare l'intensità di fluorescenza di singole cellule provenienti da un campione di popolazione sono stati misurati con successo in cellule epiteliali tumorali e cellule staminali tumorali ibridi 17. Questo metodo è stato ulteriormente adattato per l'uso in cellule epiteliali aderenti, che sono difficili da caricare con indicatori di calcio 18.
Qui, utilizzando una linea cellulare epiteliale aderente immortalato derivato dal segmento S1 del tubulo prossimale rene di ratto (WKPT-0293 Cl.2) 19, descriviamo un ottimizzato m semplificatoetodo per la misurazione delle variazioni di concentrazione di calcio citosolico di citometria a flusso. Dal momento che molte cellule epiteliali in possesso di un certo numero di trasportatori organici per i composti anionici, carico di cellule con un indicatore di calcio può rivelarsi una sfida. Per impedire l'efflusso di indicatori di calcio, probenecid, l'inibitore prototipico dei trasportatori di anioni organici e originariamente sviluppato per diminuire l'escrezione renale di penicillina 20, viene applicata simultaneamente nel mezzo di incubazione. Le cellule sono mantenute in monostrati di indicatore di calcio di carico, portati in segnali di sospensione e di calcio può essere rilevata immediatamente dopo l'aggiunta composto.
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Protocol
1. Preparazione dei reagenti e soluzioni
- Preparare la soluzione di un sale di Hank modificato bilanciata (HBSS) (in mM: 136,9 NaCl, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO3, pH 7,2, senza rosso fenolo). Conservare a 4 ° C.
- Fai 1,5 M CaCl 2 e 2 M 4- (2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.2) soluzione madre con acqua distillata.
- Preparare una soluzione 250 mM magazzino di probenecid. Per la forma di acido libero (spesso chiamato insolubile in acqua), sciogliere in polvere probenecid in NaOH 1N, riempire a tre quarti del volume finale con acqua distillata e titolare lentamente a pH 7,4 con HC1. Conservare a 4 ° C.
- Sciogliere membrana permeabile colorante fluorescente calcio vincolante anidra dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione magazzino di 1 mm. Conservare a -20 ° C al buio.
- Prima di ogni esperimento, appena preparare-probenecid contenente HBSS flusso (PHF) buffer combinando modificato con HBSS (concentrazioni finali) 1.5 mM CaCl 2, HEPES 10 mM, pH 7,2, siero fetale bovino al 5%, 2 mM probenecid, e 5,55 mM glucosio. Riscaldare a 37 ° C.
Cultura 2. Cella
- Tavola 2.5 x 10 5 cellule renali prossimali tubulari (WKPT-0293 Cl.2) per pozzetto di un piatto 6 pozzetti o 35 millimetri nel terreno di coltura standard e di crescere per 2 giorni che raggiungono una confluenza di circa il 70%.
3. Calcio Dye Loading
- Per ogni piatto bene o, mescolare 1 ml di terreno di coltura contenente siero fetale bovino 5%, 4 celle mM permeabile calcio colorante vincolante e probenecid mM 2.
- Sostituire il terreno di coltura con 1 ml di miscela di colorante di caricamento in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 30 minuti in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del indicatore fluorescente.
4. Preparazione di CeLLS per Citometria a Flusso
- Soluzione 0,05% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico Warm (EDTA) a 37 ° C.
- Aspirare calcio soluzione colorante di caricamento da ogni pozzetto e aggiungere 1 ml di tripsina, lungo la parete del pozzo.
- Incubare a 37 ° C fino a quando tutte le celle sono staccati.
- Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga a 10.000 g per 1 min.
- Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di tampone PHF e risospendere pipettando su e giù.
- Agglomerare cellule per centrifugazione a 10.000 g per 1 min.
- Ripetere i punti da 4.6. e 4.7. altre due volte.
- Risospendere le cellule in un volume finale di 500 microlitri di buffer PHF e utilizzare le cellule per la sperimentazione entro 1 ora.
- Opzionali: le cellule di conteggio per determinare la concentrazione cellulare e utilizzare 5 x 4-01 ottobre x 10 5 cellule per la misurazione.
5. Flusso CytImpostazione ometer
- Avviare il citometro a flusso, aprire il cassetto fluidica e capovolgere l'interruttore valvola di sfiato per aumentare la pressione d'aria del serbatoio del liquido guaina.
- "Prime" lo strumento per rimuovere eventuali bolle d'aria che risiede all'interno delle camere d'aria e la camera di flusso.
- Nel software di citometria a flusso, aperte due finestre dot plot.
- Il primo diagramma a punti richiede luce diffusa in avanti (FSC) per il parametro X e laterale della luce diffusa (SSC) per il parametro Y per controllare la qualità delle cellule all'interno del campione attraverso la loro dimensione e la loro granularità, rispettivamente.
- Il secondo diagramma a punti misura l'intensità di fluorescenza del colorante di calcio-bound. Selezionare il canale di rilevamento di fluorescenza appropriato per il parametro Y usando una scala logaritmica e il tempo in secondi per il parametro X su una scala lineare.
- Impostare la portata di 'alto'.
6. Citometria a flusso Measurement
- Eseguire le misurazioni a temperatura ambiente. In un citometria a flusso provetta (11,5 x 75 mm), aggiungere 480 microlitri di buffer PHF.
- Aggiungi sospensione cellulare 20 ml e brevemente vortice per mescolare.
- Spostare il braccio di supporto del tubo di lato e posizionare il tubo campione sul tubo di iniezione del campione fino a quando si forma una tenuta ermetica. Riportare il braccio di supporto del tubo nella posizione originale centrata.
- Ottimizzare misurazione regolando il canale di fluorescenza tale che l'intensità di fluorescenza media del campione è di circa 10 2 sul asse y. Salvare e utilizzare per gli esperimenti successivi.
- Per avviare un esperimento, ripetere i passaggi 6,1-6,3.
- Record di fluorescenza di base per 50 sec.
- Pausa misurazione, rimuovere la provetta, aggiungere composti di interesse, vortex brevemente e ritornare al tubo di iniezione del campione. Questo passaggio non deve durare più di 15 secondi.
- Riprendi misurazione e continuare per un totale di 204,8 sec.
- Utilizzare un i di calcioonophore, come ionomicina (10 mM), e un chelante del calcio, come il glicole etilenico tetraacetico (EGTA), MnCl 2 o CoCl 2 (2 mM), per i controlli, rispettivamente positivo e negativo.
Analisi 7. I dati
- Analizzare i dati utilizzando un software dedicato citometria a flusso per l'analisi offline, come WinMDI (Windows Multiple Document Interface per citometria a flusso), un pacchetto software gratuito sviluppato da Joe Trotter presso l'Istituto Scripps, Citometria a flusso Nucleo strumento.
- Aprire un diagramma a punti con i parametri SSC e FSC.
- Selezionare la regione di celle per l'analisi con lo strumento "Regioni" (tasto destro del mouse sopra l'immagine) di escludere le cellule morte o detriti cellulari si trovano in basso a sinistra dall'analisi dei dati (Figura 1).
- Analisi Quadrant (Figura 2)
- Aprire una trama densità con tempo in ascisse e l'intensità di fluorescenza in asse y. Utilizzare tutti gli eventi.
- Noiuna e la stessa regione di gating come in 7.3.
- Quantificare i dati utilizzando funzione "Quadrant".
- Regolare i separatori quadrante in modo che la linea verticale viene posizionato al momento della aggiunta del composto e la linea orizzontale è posta al centro della fluorescenza basale nei controlli. Assicurarsi che il posizionamento dei separatori quadranti è uguale in tutti i campioni.
- La percentuale di cellule in ciascun quadrante viene visualizzato in ciascun angolo (Figura 2). Confrontare il quadrante in alto a destra (UR) tra i campioni.
- Analisi Istogramma (Figura 3)
- Aprire i dati di controllo in una finestra istogramma con intensità di fluorescenza sul asse x ed eventi sul asse y. Utilizzare tutti gli eventi.
- Per una visione pittorica, aggiungere i dati di test da confrontare con la trama controllo come trame di sovrapposizione (andare in File → Apri File → selezionare File → Overlay).
- Per l'analisi quantitativa, unico istogramma vinceredows devono essere utilizzati. Porta la popolazione di cellule con la regione R1 dal punto 7.3.
- Nel controllo non trattato, utilizzare la funzione marker ("marker") per contrassegnare l'area di analisi partendo dal punto medio tra il minimo e il massimo di fluorescenza del picco di controllo e termina alla massima intensità di fluorescenza. La percentuale di cellule in questo settore è calcolato.
- Recuperare i dati dalla finestra delle statistiche. Ripetere l'operazione per i rimanenti file di dati utilizzando la stessa area contrassegnata per l'analisi.
- Analisi intensità di fluorescenza (Figura 4)
- Aprire un diagramma a punti nel tempo su l'asse x e l'intensità di fluorescenza in asse y. Utilizzare tutti gli eventi.
- Attiva "Modalità Kinetics" e "Overlay Kinetics Line". Una linea blu apparirà nella trama punto che rappresenta l'intensità di fluorescenza media.
- Quantificare l'afflusso di calcio relativa mediante la creazione di più aree rettangolari. Ogni regione dovrebbe avere awLarghezza della merito "50", che equivale a "10 sec". Definire fino a 15 zone rettangolari.
- Recupera quantificazione dalla finestra delle statistiche e copia in un foglio di calcolo.
- Utilizzare i dati y-media per l'analisi. Calcolare la media dei R2 a R6, che è equivalente a 20 a 50 sec. Questo è il valore di base.
- Scegliere un intervallo di tempo adeguato per l'analisi del flusso di calcio (dipende inizio, durata e intensità).
- Calcolare i segnali di calcio di ogni regione all'interno di questo intervallo di tempo rispetto al valore basale, cioè il segnale di fluorescenza prima aggiunta del composto, che è impostato al 100%. Determinare la media e la deviazione standard delle regioni inviare aggiunta del composto; questo è il segnale di calcio medio evocata dal composto.
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Representative Results
Per aumentare il calcio citosolico, due composti farmacologici sono stati applicati alle cellule renali prossimali tubulari (WKPT-0293 Cl.2) Pellicola colorante legame delle cellule di calcio permeabile, Fluo-3-AM. Campioni di controllo non trattate sono state caricate con calcio legame con colorante in presenza di probenecid e sono stati mescolati, ma senza l'aggiunta di composti. Tapsigargina (TG) è un inibitore classica della pompa SERCA che porta ad una perdita di pronto soccorso e un conseguente aumento di calcio citosolico. Tunicamicina (TUN) blocchi di N-glicosilazione delle proteine che portano all'attivazione della risposta proteine spiegato, ma aumenta anche il calcio citosolico 18,21. Come controllo positivo, ionomicina (IONO), un calcio ionoforo rendendo la membrana plasmatica permeabile al calcio extracellulare, è stato utilizzato. Per l'analisi, la popolazione di cellule è stato sorvegliato selezionando una regione del dot plot SSC / FSC (R1 nella figura 1). Una trama densità per intensità di fluorescenza in funzione del tempo è stato creato per ogni file di dati. Utilizzando la funzione quadrante, il dot plot è stato separato in quattro aree rappresentative Fluo-3 intensità di fluorescenza prima e dopo l'aggiunta del composto e sopra e sotto la fluorescenza basale. Quantificazione in percentuale della popolazione di cellule gated in ogni quadrante permette la determinazione di un aumento della concentrazione di calcio citosolico. In questo esempio, 3 mM TG provoca un aumento della percentuale di cellule nel quadrante superiore destro indica che il segnale di calcio è stata indotta. La percentuale di cellule aumenta dal 42,8% nel controllo al 51,3% (1,20 volte) in cellule TG trattate. Analogamente, 6 mM TUN aumenta la percentuale di cellule con maggiore intensità di fluorescenza di calcio al 49,9% (1,17 volte). Applicazione di 10 pM IONO provocato 65,5% (1,53 volte) di cellule nel quadrante superiore destro (Figura 2). L'analisi istogramma portato a 1,41 volte, 1,36 volte e 2,11 volte dai TG, TUN e IONO rispettivamente (Figura 3) (per le statistiche, vedere <sup> 18). Infine, utilizzando la modalità regione analisi multiple, TG, TUN e IONO causati 1,55 volte, 1,29 volte e 4,54 aumenti piega in segnale di calcio oltre il controllo, rispettivamente (Figura 4).
La modalità di analisi più sensibile è stata la zona di analisi multipla. In contrasto con il quadrante e modalità di analisi dell'istogramma, dove viene quantificata la distribuzione della popolazione cellulare, la modalità zona di analisi multipla quantifica la variazione del segnale fluorescente della popolazione cellulare totale. Il più grande discrepanza nei risultati di diverse modalità di analisi è stato per ionomicina che variava da 1.53 volte maggiore il controllo dall'analisi quadrante di 4,54 volte dalla regione analisi multiple. I composti testati non hanno mostrato tale varianza. Tuttavia, in tutte le modalità di analisi, la misura del segnale di calcio evocati rimasta la stessa se i valori assoluti differivano, cioè, IONO aveva il maggior effetto seguito da TG e poi TUN. Applicazione di TG, TUN o IONO si traduce in cambiamenti permanenti del calcio citosolico. Per determinare se i segnali fisiologici di calcio, che sono transitori, possono essere misurati con questo metodo, l'ATP è stato applicato alle cellule Cl.2 WKPT-0293. ATP evocato un segnale di calcio rapida e transitoria, che non poteva essere registrato nella sua interezza dal flusso citometria metodo. Concentrazioni di ATP a 20-100 mM erano difficili da rilevare quindi la concentrazione è stata ridotta a "rallentare" i segnali di calcio. Come mostrato in Figura 5, un cambiamento di calcio citosolico può essere misurato dopo aggiunta di 5 mM ATP. Tuttavia, il picco del cambiamento di fluorescenza non è stato registrato. Utilizzando l'analisi quadrante (Figura 5B) e l'analisi istogramma (Figura 5C) modi, alcuna differenza di segnali di calcio in ATP potrebbe essere rilevato a causa della natura transitoria del segnale calcio. Tuttavia, con parti selezionate della traccia, il rett multiplaModalità regione analisi r ha registrato un aumento di 1,85 del segnale calcio subito dopo la ripresa di misura (Figura 5A).
Figura 1. SSC contro FSC dot plot. L'integrità della popolazione cellulare viene valutata utilizzando side scatter (SSC) e forward scatter (FSC). Una regione è selezionata (R1) per ulteriori analisi. Sono escluse le cellule morte e detriti cellulari, che hanno ridotto la dispersione della luce,. Viene visualizzato un diagramma a punti rappresentativi.
Figura 2. Analisi Quadrant. Fluorescenza basale di WKPT-0293 cellule Cl.2 dye-caricato che lega il calcio è stata misurata per 50 sec. Di misura è stato fermato, composto o diluent è stata aggiunta, in agitazione per mescolare e misura è stata ripresa immediatamente per un totale di 204,8 sec. La quantificazione è stata effettuata utilizzando l'analisi quadrante. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi Istogramma. Istogramma appezzamento di WKPT-0293 cellule Cl.2 dye-caricato trattati con TG, TUN o IONO vincolante di calcio. Utilizzando la funzione di marcatore, la percentuale di cellule gated con elevata capacità di legame di calcio intensità colorante fluorescente è stato quantificato posizionando il punto di partenza del marcatore al picco della curva di controllo e termina al massimo di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare un larger versione di questa figura.
Figura 4. multipla analisi regione. Fluorescenza basale di WKPT-0293 cellule Cl.2 dye-caricato che lega il calcio è stata misurata per 50 sec. Misurazione stato fermato, è stato aggiunto composto o diluente, in agitazione per mescolare e misurazione è stato ripreso immediatamente per un totale di 204,8 sec. La quantificazione è stata effettuata utilizzando l'analisi multipla un'area rettangolare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Analisi dei segnali di calcio ATP-indotta. Baseline fluorescenza of WKPT-0293 cellule Cl.2 dye-caricato che lega il calcio è stata misurata per 50 sec. Misurazione stato fermato, è stato aggiunto 5 mM ATP, in agitazione per mescolare e misurazione è stato ripreso immediatamente per un totale di 204,8 sec. Dati stata quantificata utilizzando multipli regione rettangolare analisi (A), analisi quadrante (B) o istogramma analisi (C). Per la regione analisi multiple, solo il segnale transiente di calcio è stato analizzato. Dati o analisi dal Rappresentante n = 3 -. 7 sono mostrati Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il calcio è un evento chiave in molteplici processi cellulari che agiscono come una seconda molecola di segnalazione messaggero e anche come mezzo per comunicare tra ER e mitocondri. La possibilità di misurare le variazioni delle concentrazioni di calcio citosolico libero è una tecnica utile che può applicarsi a tutti i settori della biologia cellulare. Ci sono vari metodi per rilevare segnali di calcio citosolico. Classicamente, i segnali provenienti da un indicatore di calcio raziometrica, come la Fura-2, sono monitorati in cellule vive con una messa a punto di imaging di fluorescenza e le concentrazioni di calcio assoluti può essere derivata dalla determinazione intensità minima e massima fluorescenza. Tuttavia, questa tecnica richiede attrezzature specializzate, quali un microscopio a fluorescenza, un imaging cellulare dal vivo impostare e software di analisi. Qui, descriviamo un metodo semplice per la rivelazione di calcio nel citoplasma delle cellule epiteliali aderenti in citometria a flusso, che è accessibile alla maggior parte dei laboratori.
Epiteli sono in possession di una serie di trasportatori responsabili per il trasporto di metaboliti, xenobiotici e farmaci. Di particolare importanza è la superfamiglia SLC22A, a cui cationi organici e anioni organici trasportatori fanno parte 22, e l'ATP-binding cassette (ATP) superfamiglia, che conta la resistenza ai farmaci ABCB1 e di multiresistenza ai farmaci proteine P-glicoproteina (MRP) tra i suoi membri 23 . Gli esperimenti iniziali utilizzando il rene di ratto prossimale linea cellulare tubulo WKPT-0293 Cl.2 state effettuate come descritto nel documento di Gergely et al. 16. Le cellule sono state messe in sospensione e caricati con Fluo-3 del mattino. Tuttavia, solo un modesto cambiamento è stato osservato con 10 mM ionomicina (38.14% contro 50.95% nel controllo mediante l'analisi del settore o di 1,78 volte per regione analisi multiple). Abbiamo ipotizzato che i trasportatori epiteliali erano responsabili per i poveri carico delle cellule con Fluo-3 del mattino. Per aggirare questo problema, probenecid e PSC833, inibitori di un organicotrasportatori Nion e la multiresistenza ai farmaci glicoproteina P, rispettivamente, sono stati applicati in contemporanea con il legante il calcio colorante monostrati cellulari. Probenecid migliorata legante il calcio colorante carico, come indicato da un aumento di intensità di fluorescenza basale, che PSC833 avuto effetto, che è in contrasto con una precedente relazione del criceto cinese cellule ovariche 24. Questa differenza sta probabilmente nei livelli di ABCB1 nelle diverse linee cellulari; la linea cellulare Cl.2 WKPT-0293 ospita un livello basso endogena di ABCB1, che può essere indotta da sostanze tossiche, quali metalli tossici 25,26. L'uso di probenecid per migliorare calcio colorante carico può essere estesa ad altri tipi di cellule che presentano sistemi di trasporto probenecid sensibili, come le cellule del sistema nervoso, barriera emato-encefalica e fegato, dove segnalazione calcio può giocare un ruolo nella segnalazione intracellulare percorsi.
La facile individuazione di calcio legame Fluo-3 risiede nella sua requimisu- di una sola lunghezza d'onda di eccitazione (506 nm) e di una lunghezza d'onda di emissione (525 nm). Tuttavia, i dati generati con un'unica lunghezza d'onda di calcio coloranti vincolante, come un colorante non raziometrica, possono essere utilizzati solo per quantificare aumento relativamente calcio citosolico oltre i controlli non trattati. Per determinare le concentrazioni di calcio assoluti, un colorante raziometrica è necessario perché uno spostamento spettrale verifica dopo legante il calcio che permette la correzione di una disparità di colorante di caricamento e di sbianca. Il colorante raziometrico indo-1 è stato utilizzato nella rilevazione di mobilitazione del calcio nelle cellule immunologiche mediante citometria di flusso 27,28 ma finora, non è stata eseguita in cellule epiteliali. Utilizzando i due spettri di emissione di Indo-1 UV-eccitabile (400 nm quando il calcio legato e 475 nm quando il calcio libero), le concentrazioni di calcio citosolico assoluti può essere determinata come descritto da Grynkiewicz et al. 11.
I nostri dati di esempio utilizzati composti farmacologici che inducono apcambiamento ermanent di calcio citosolico. Segnali di calcio fisiologiche sono di bassa intensità, mostrano cinetiche veloci e sono transitori, quindi la questione rimane se il metodo di citometria a flusso è abbastanza sensibile per rilevare i segnali fisiologici di calcio. Esperimenti con ATP sono state effettuate con la linea cellulare WKPT-0293 Cl.2, che ospita i recettori purinergici come dimostrato da un aumento del segnale del calcio a richiesta di ATP (misurata da imaging cellulare dal vivo). Utilizzando il citometro a flusso, aumento del calcio citosolico potrebbe essere osservato con 1 - 100 mM ATP, ma il rapido natura del segnale combinato con il ritardo nella ripresa della misurazione dopo aggiunta del composto significava che solo una porzione del segnale può essere registrato. Così un grande svantaggio della citometria a flusso metodo è la sua limitata capacità di registrare rapido (<10 sec) e segnali di calcio transitori; invece il metodo è più adatto per stimoli che danno luogo a segnali più lenti transitori (> 10 sec) o persistente elevata calcsegnali IUM. Queste limitazioni possono essere aggirate, riducendo la concentrazione stimolatore o mediante l'applicazione di inibitori della ricaptazione meccanismi di calcio per mantenere il calcio rilasciato nel citosol, ma la cautela deve essere presa per selezionare una concentrazione di inibitore che non aumenta il calcio citosolico di per sé.
L'informazione acquisita da imaging cellulare dal vivo e citometria a flusso sono molto diverse. Con l'imaging cellulare dal vivo, l'alta risoluzione significa che le variazioni spaziali nel calcio possono essere misurati selezionando regioni intracellulari di singole cellule per l'imaging. Inoltre, i segnali di fluorescenza vengono acquisiti senza sosta ogni 1 - 2 sec quindi segnali di calcio rapidi possono essere registrati. Al contrario, la citometria a flusso è più adatto per i segnali di calcio più lenti e di lunga durata e misura dei segnali di calcio da una popolazione di cellule intero. Solo variazioni relative a segnali di calcio possono essere quantificati con il metodo di citometria a flusso. Ma, la citometria a flusso metodo presenta una serie di ADVANTages più convenzionale di imaging cellulare dal vivo: 1) screening ad alto rendimento di composti (stimolatori e inibitori della segnalazione di calcio) possono essere eseguite; 2) competenze specifiche di imaging non è necessaria; 3) tecnici di ricerca in grado di eseguire le misurazioni; 4) laboratori clinici e non clinici che non hanno i mezzi per eseguire imaging ad alta risoluzione e le misurazioni di calcio raziometrici può indagare su segnalazione di calcio. Nel loro insieme, la citometria a flusso metodo è utile se il ricercatore desidera inizialmente per stabilire un ruolo per il calcio e potrebbe facilmente applicare inibitori per determinare vie di segnalazione a monte ea valle, mentre l'imaging cellulare dal vivo sarebbe necessario per caratterizzare il segnale del calcio (ad es., La cinetica , intensità, variazioni spaziali) in ulteriore dettaglio.
In sintesi, si descrive un metodo rapido, semplice e sensibile per la rilevazione di tempo reale variazioni relative di calcio citosolico in difficili da caricare aderente renale epitelialecellule, che sono stati portati in sospensione. Per sperimentatori senza accesso a un citometria a flusso, questo metodo può essere facilmente applicato ad uno spettrofluorimetro con la sospensione cellulare in una cuvetta.
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Acknowledgments
La ricerca nei laboratori è finanziato dalla Fondazione Fritz-Bender, Monaco di Baviera, Germania (a TD) e l'Università di Witten / Herdecke assegno di ricerca interno (a W.-KL). Vorremmo ringraziare il Prof. Dr. Dr. Frank Thévenod (Istituto di Fisiologia, Fisiopatologia e Tossicologia, Università di Witten / Herdecke) per gli utili suggerimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
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