फ्लो से गुर्दे उपकला कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम माप
Summary
कैल्शियम कई शारीरिक और pathophysiological संकेत दे रास्ते में शामिल है. लाइव सेल इमेजिंग विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और समय लग सकता है. निलंबन में लाया पक्षपाती उपकला कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम में रिश्तेदार परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग कर एक त्वरित, सरल विधि अनुकूलित किया गया था.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
कैल्शियम सेलुलर शारीरिक और pathophysiological संकेत 1 के प्रसारण के लिए जिम्मेदार एक महत्वपूर्ण दूसरा दूत है. साइटोसोलिक कैल्शियम सांद्रता कैल्शियम पंप और कैल्शियम एक्सचेंजर्स की गतिविधि के माध्यम से कम रखा जाता है. sarcoplasmic / endoplasmic जालिका कैल्शियम ATPase (SERCA) एटीपी निर्भर शिष्टाचार में दोनों, प्लाज्मा झिल्ली कैल्शियम ATPase (PMCA) कोशिकी डिब्बे में कैल्शियम extrudes जबकि एक "पंप रिसाव" प्रणाली के भाग के रूप endoplasmic जालिका (ईआर) कैल्शियम की दुकान केवल एक बार 2. ऐसे हार्मोन या न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में शारीरिक दूतों, जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स, diacylglycerol और inositol ट्रायफ़ोस्फेट (IP3) 3 उत्पन्न करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली में phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट (PIP2) hydrolyses जो phospholipase सी, के सक्रियण के माध्यम से उनके संकेत संचारित. Diacylglycerol प्लाज्मा झिल्ली में रहता है, IP3 cytosol में diffuses और IP3 रिसेप्टर को बांधताईआर झिल्ली और कैल्शियम में पाया ligand कैल्शियम चैनल सक्रिय कर रहे हैं जो (IP3Rs), साइटोसोलिक कैल्शियम सांद्रता 4 में वृद्धि में बनी ईआर luminal दुकान से जारी है. Cytosol तक पहुँचने के लिए कैल्शियम के लिए एक वैकल्पिक मार्ग प्लाज्मा झिल्ली में मौजूद कैल्शियम चैनल और एक्सचेंजर्स के माध्यम से है. इन दो डिब्बों के बीच crosstalk वर्णित किया गया है: कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम कोशिकी कैल्शियम ईआर दुकानों 5 से कैल्शियम रिहाई लाती है जहां रिलीज (CICR), और दुकान STIM से लगा है ईआर दुकानों के खाली जहां कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE) संचालित और उरई के उद्घाटन का कारण बनता है प्लाज्मा झिल्ली में कैल्शियम चैनल ईआर भंडार 6 के refilling बढ़ावा देने के लिए.
Pathophysiological शर्तों के तहत, सेलुलर कैल्शियम प्रतिक्रिया शारीरिक stimulators 1 के अभाव में अविनियमित और साइटोसोलिक कैल्शियम बढ़ जाती है. कैल्शियम प्रतिक्रिया तरीकों की एक संख्या में प्रभावित हो सकता है: कैल्शियम लंबे समय तकसंकेत, cytosol से कैल्शियम हटाने, कैल्शियम भंडार या कैल्शियम में स्थानीय परिवर्तन की कमी देरी. इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया बफरिंग में एक केंद्रीय भूमिका पर ले और कैल्शियम 7 रिहा. लंबे समय तक और / या supramaximal साइटोसोलिक कैल्शियम वृद्धि कोशिका मृत्यु की ओर जाता है. वास्तव में, कैल्शियम अधिक बार सेलुलर pathophysiological प्रतिक्रिया में शामिल है और इस तरह मुख्य रूप से कोशिका मृत्यु के साथ जुड़े रहे हैं जो neurodegenerative रोग, हृदय रोग, कैंसर, हड्डी रोग और गुर्दे की बीमारी, जैसे रोगों की एक विस्तृत सरणी में एक महत्वपूर्ण घटना है नहीं की तुलना में है हानि या अंग या ऊतक समारोह 8-10 के परिवर्तन और. इसके अलावा, कैल्शियम संकेतों की गड़बड़ी सेलुलर अनुकूलन और सेलुलर कार्यों और प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन से जोड़ा गया है.
परंपरागत रूप से, कैल्शियम संकेतों एक सेल पारगम्य acetoxymethyl (एएम) एस्टर रूप में कोशिकाओं में भरी हुई है कि एक नकारात्मक आरोप लगाया फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक के साथ मापा जाता है. एक बार सेलुलर esteras द्वारा cleavedतों, फ्लोरोसेंट संकेतक intracellular डिब्बे के भीतर रहते हैं और कैल्शियम के लिए बाध्य है जब प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई है. सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है और इस्तेमाल किया कैल्शियम सूचक ratiometric Fura-2 रोजर Tsien और उनके सहयोगियों ने 11 से विकसित की है. कैल्शियम के लिए भिन्न समानताएं साथ कैल्शियम संकेतक अलग कैल्शियम पूल नजर रखी जा करने की अनुमति. तरीकों का पता लगाने लाइव सेल इमेजिंग, प्रतिदीप्ति microplate रीडर में शामिल हैं और प्रवाह cytometry. (आमतौर पर मिनट के लिए कुछ ही सेकंड के भीतर) कैल्शियम संकेतों के अपेक्षाकृत तेजी से कैनेटीक्स कैल्शियम संकेत की विशेषताओं के बारे में सबसे अधिक जानकारी पाने के लिए सबसे अच्छा तरीका इमेजिंग लाइव सेल बना देता है. एक तरफ (मिसे के भीतर) कैल्शियम संकेतों के तेज कैनेटीक्स से, जीना सेल इमेजिंग एक एकल कक्ष 12 के भीतर कैल्शियम संकेतन के सेलुलर compartmentalization के अध्ययन के लिए एक बेहतर तरीका है. निरपेक्ष कैल्शियम सांद्रता कैल्शियम इंडस्ट्रीज़ के न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति निर्धारित करने से गणना की जा सकतीGrynkiewicz एट अल. 11 द्वारा वर्णित के रूप में, क्रमशः, एक कैल्शियम chelator जोड़ने और कोशिकाओं permeabilizing द्वारा icator.
कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए फ्लो का उपयोग पहला अवसर ऐसी झिल्ली अखंडता और सेल की आबादी की जुदाई, और एकल तरंगदैर्ध्य के विकास के साथ संयुक्त निलंबन में कोशिकाओं की आवश्यकता के रूप में कई मापदंडों को मापने के लिए जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं में 1980 के दशक में विकसित किया गया था कैल्शियम संकेतक एक आदर्श और convenientdetection विधि 13-15 प्रवाह cytometry बनाया. पक्षपाती कोशिकाओं में, लाइव सेल इमेजिंग कैल्शियम संकेतन, सबसे महत्वपूर्ण बात कैनेटीक्स के बारे में सबसे अधिक जानकारी प्रदान करता है, लेकिन प्राप्त करने के लिए एक तरह के तापमान के रूप में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, एक छिड़काव प्रणाली, सेलुलर पर्यावरण के रखरखाव, जिसमें जटिल सेटअप, और विशेष माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर की आवश्यकता और डेटा का विश्लेषण. इस तरह के एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर या pharmacol के रूप में वैकल्पिक तरीकोंकैल्शियम chelators के उपयोग के माध्यम ogical साधन प्राप्त की जानकारी के मामले में अतुलनीय हैं. फ्लो अधिक व्यापक रूप से अध्ययन के बहुमत में है, हालांकि माप प्रदर्शन कर रहे हैं केवल अंत बिंदु पक्षपाती कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. शुरू में गरगेली एट अल द्वारा विकसित विधि का उपयोग करना. प्रतिरक्षाविज्ञानी बी कोशिकाओं 16 में, वास्तविक समय कैनेटीक्स साथ प्रवाह cytometry और एक नमूना जनसंख्या से व्यक्ति की कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता निगरानी द्वारा साइटोसोलिक मुक्त कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन सफलतापूर्वक कैंसर उपकला कोशिकाओं में मापा गया है और कैंसर स्टेम सेल 17 संकर. इस विधि को आगे कैल्शियम संकेतक 18 के साथ लोड करने के लिए मुश्किल हैं जो पक्षपाती उपकला कोशिकाओं में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था.
इधर, चूहा गुर्दे समीपस्थ छोटी नली (WKPT-0293 Cl.2) 19 के एस 1 खंड से ली गई एक अमर पक्षपाती उपकला सेल लाइन का उपयोग कर, हम एक अनुकूलित सरलीकृत मीटर का वर्णनफ्लो द्वारा साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन की माप के लिए ethod. कई उपकला कोशिकाओं ऋणात्मक यौगिकों के लिए जैविक ट्रांसपोर्टरों के एक नंबर के अधिकारी के बाद से, एक कैल्शियम सूचक के साथ कोशिकाओं की लोडिंग एक चुनौती साबित हो सकता है. कैल्शियम संकेतक, प्रोबेनेसिड, पेनिसिलिन 20 के गुर्दे उत्सर्जन को कम करने के लिए विकसित मूल आद्य जैविक आयनों ट्रांसपोर्टरों का अवरोध और के तपका रोकने के लिए, ऊष्मायन मध्यम में एक साथ लागू किया जाता है. कोशिकाओं, कैल्शियम सूचक लोड करने के लिए monolayers में बनाए रखा यौगिक इसके बाद तुरंत पता लगाया जा सकता निलंबन और कैल्शियम संकेतों में लाया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
कैल्शियम एक दूसरे के दूत संकेत अणु के रूप में और भी ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच संवाद करने के लिए एक साधन के रूप में कार्य कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण घटना है. मुक्त साइटोसोलिक कैल्शियम क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रयोगशालाओं में रिसर्च फ्रिट्ज-शराबी फाउंडेशन, म्यूनिख, जर्मनी (टीडी) और (डब्ल्यू-के.एल. करने के लिए) Witten / Herdecke आंतरिक अनुसंधान अनुदान के एक विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित है. हम उपयोगी सुझाव के लिए (फिजियोलॉजी, pathophysiology एवं विष विज्ञान, Witten विश्वविद्यालय / Herdecke के लिए संस्थान) प्रोफेसर डा डा फ्रैंक Thévenod धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
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