מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה
Summary
סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
סידן הוא שליח שני חשוב אחראי להעברת פיזיולוגית סלולריים ואותות pathophysiological 1. ריכוז יוני הסידן Cytosolic נשמרים נמוך באמצעות הפעילות של משאבות סידן ומחליפי סידן. ATPase סידן הרשתית / endoplasmic sarcoplasmic (SERCA) ממלא reticulum endoplasmic (ER) חנות סידן כחלק ממערכת "דליפת משאבה", ואילו ATPase סידן קרום פלזמה (PMCA) extrudes סידן לתא תאי, הן בנימוסים תלוי ATP 2. שליחים פיסיולוגיים, כמו הורמונים או נוירוטרנסמיטרים, לשדר אותותיהם באמצעות קולטנים G- חלבון בשילוב, הפעלה של C פוספוליפאז, שhydrolyses phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) בקרום הפלזמה לייצר אדנוזין diacylglycerol ואינוסיטול (IP3) 3. בעוד diacylglycerol נשאר בקרום הפלזמה, IP3 מתמוסס לתוך cytosol ונקשר לקולטן ה- IP3s (IP3Rs), אשר יגנד מופעלות ערוצי סידן, שנמצאה בקרום ER וסידן משתחררת מחנות luminal ER הגיעה לשיאה בעלייה בריכוז יוני הסידן cytosolic 4. תוואי חלופי לסידן כדי להגיע לcytosol הוא בערוצי סידן ומחליפים קיימים בקרום הפלזמה. Crosstalk בין שני תאים אלו תוארו: שחרור סידן נגרם סידן (CICR) שבו סידן תאי גורם לשחרור סידן מחנויות ER 5, וחנות המופעלים על כניסת סידן (SOCE) שבו מתרוקן מחנויות ER נקלטת על ידי STIM וגורם לפתיחה של Orai ערוצי סידן בקרום הפלזמה לקדם מילוי חוזר של חנויות ER 6.
בתנאי pathophysiological, תגובת סידן התאית היא עליות סידן וחוסר פיקוח ממשלתיות וcytosolic בהעדר הגירוי פיסיולוגי 1. תגובת סידן עלולה להיות מושפעת במספר הדרכים: ממושך בסידןאות, התעכב פינוי סידן מcytosol, דלדול של חנויות סידן או שינויים מקומיים בסידן. יתר על כן, המיטוכונדריה לקחת על עצמו תפקיד מרכזי בחציצה ושחרור סידן 7. מתמשך ו / או עליית סידן cytosolic supramaximal מובילה למוות של תאים. למעשה, סידן הוא לעתים קרובות יותר מאשר לא מעורב בתגובת pathophysiological הסלולרית והוא אירוע מרכזי במגוון רחב של מחלות, כגון מחלת ניוון עצבי, מחלות לב, סרטן, מחלות עצם ומחלת כליות, אשר קשור בעיקר עם מוות של תאים ואובדן או שינוי של איבר או רקמת הפונקציה 8-10. יתר על כן, ההפרעות של אותות סידן נקשרה להסתגלות ושינויים בפונקציות ותגובות תאיות סלולריים.
באופן מסורתי, אותות סידן נמדדים עם מחוון סידן ניאון טעון שלילי שהוא נטען לתוך תאים בצורת acetoxymethyl החדיר תא (AM) אסתר. ביקע פעם אחת על ידי esteras הסלולריes, אינדיקטורים הניאון להישאר בתוך התא תאיים ועלייה בעוצמת הקרינה כאשר סידן הוא מחויב. מחוון סידן הידוע ביותר ומשמש הוא הפורע-2 ratiometric שפותח על ידי רוג'ר Tsien ועמיתים 11. מדדי סידן עם זיקות שונות מן לסידן לאפשר בריכות סידן שונות כדי להיות במעקב. שיטות זיהוי כוללות הדמיה תא חי, קורא microplate הקרינה וcytometry זרימה. קינטיקה מהירה יחסית של אותות סידן (בדרך כלל תוך מספר שניות עד דקות), הופכת את התא חי הדמיה השיטה הטובה ביותר להשגת רוב המידע על מאפיינים של אות סידן. מלבד קינטיקה מהירה של אותות סידן (באלפיות שני), הדמיה תא חי היא שיטה טובה יותר ללימודי מידור סלולארי של איתות סידן בתוך תא בודד 12. ניתן לחשב ריכוז יוני הסידן המוחלט על ידי קביעת הקרינה המינימלית ומקסימלי של ind סידןicator על ידי הוספת chelator סידן וpermeabilizing התאים, בהתאמה, כפי שתואר על ידי et al Grynkiewicz. 11.
השימוש בזרימת cytometry למדוד אותות סידן פותחה לראשונה בשנת 1980 בתאים חיסוניים שבו את ההזדמנות כדי למדוד פרמטרים מרובים, כגון שלמות קרום והפרדה של אוכלוסיית תאים, ואת הדרישה של תאים בתרחיף בשילוב עם הפיתוח של אורך גל יחיד מדדי סידן עשויות cytometry זרימת שיטה אידיאלית וconvenientdetection 13-15. בתאים חסיד, הדמיה תא חי מספקת את רוב המידע על איתות סידן, הכי חשוב קינטיקה, אבל דורשת התקנה מסובכת הכוללת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מערכת זלוף, תחזוקה של הסביבה התאית, כגון טמפרטורה, ותוכנת מיקרוסקופ מיוחדת לרכישה וניתוח נתונים. שיטות חלופיות כגון קורא microplate הקרינה או Pharmacolאמצעי ogical באמצעות שימוש בchelators סידן הוא שאין במונחים של מידע שנצבר. Cytometry זרימה הופכת שימוש נרחב יותר כדי לפקח על סידן cytosolic בתאים חסיד אם כי, ברוב המכריע של מחקרים, נקודת סיום מדידות מתבצעות רק. תוך שימוש בשיטה פותחה בתחילה על ידי אל גרגלי ואח. בתאי B של מערכת חיסון 16, שינויים בריכוז סידן חופשי cytosolic ידי cytometry זרימה עם קינטיקה בזמן אמת וניטור עוצמת הקרינה בתאים בודדים מאוכלוסיית מדגם נמדדו בהצלחה בתאי האפיתל סרטן ותא גזע סרטני כלאי 17. שיטה זו הותאמה נוספת לשימוש בתאי אפיתל חסיד, שקשה לטעון עם אינדיקטורים סידן 18.
כאן, באמצעות שורת תאי אפיתל הונצחה חסיד נגזרת ממגזר S1 של אבובית הפרוקסימלי כליות חולדה (WKPT-0293 Cl.2) 19, אנו מתארים מותאם מ 'פשוטיםethod למדידת שינויים בריכוז סידן cytosolic ידי cytometry זרימה. מאחר ורבים מתאים אפיתל בעלי מספר המובילים האורגניים לתרכובות אניוני, טעינה של תאים עם מחוון סידן יכולה להוכיח להיות אתגר. כדי למנוע הזרימה של אינדיקטורים סידן, probenecid, המעכב הטיפוסי של מובילי אניון אורגניים ופותח במקור כדי להקטין את הפרשת כליות של פניצילין 20, מיושם בו זמנית במדיום הדגירה. התאים נשמרים בmonolayers לטעינת מחוון סידן, הביאו לאותות השעיה וסידן יכולים להתגלות מייד לאחר בנוסף מתחם.
Protocol
Representative Results
Discussion
סידן הוא אירוע מרכזי בתהליכים תאיים רבים מתנהגים כמו מולקולת איתות השליח שנייה וגם כאמצעי לתקשורת בין ER ומיטוכונדריה. היכולת למדוד שינויים בריכוזי סידן cytosolic חופשיים היא טכניקה שימושית שיכול לחול על כל תחומי ביולוגיה של תא. ישנן שיטות שונות לזיהוי אותות סידן cytosolic. ק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדות ממומן על ידי קרן פריץ-בנדר, מינכן, גרמניה (לTD) ואוניברסיטה וויטן / מענק מחקר הפנימי Herdecke (לW.-KL). ברצוננו להודות לפרופ 'ד"ר ד"ר פרנק Thévenod (מכון לפיסיולוגיה, פתופיזיולוגיה וטוקסיקולוגיה, האוניברסיטה וויטן / Herdecke) להצעות מועילות.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it’s good, it’s very very good, but when it’s bad, it’s horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,’ p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
