Cytosoliska Kalcium Mätningar i Renal epitelceller med flödescytometri

Summary

Kalcium är involverad i ett stort antal fysiologiska och patofysiologiska signalvägar. Levande cell imaging kräver specialiserad utrustning och kan vara tidskrävande. En snabb, enkel metod med användning av en flödescytometer för att bestämma relativa förändringar i cytosoliskt kalcium i adherenta epitelceller bringas i suspension var optimerad.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

Kalcium är en viktig andra budbärare som ansvarar för överföring av cellulära fysiologiska och patofysiologiska signaler ^1. Cytosoliska kalciumkoncentrationer hålls låga genom verksamheten av kalciumpumpar och kalcium värmeväxlare. Sarkoplasma / endoplasmatiska retiklet kalcium ATPas (SERCA) fyller det endoplasmatiska retiklet (ER) kalcium butik som en del av en "pump läcka" systemet, medan plasmamembranet kalcium ATPas (PMCA) extruderar kalcium till det extracellulära rummet, både i ATP-beroende sätt ^2. Fysiologiska budbärare, såsom hormoner eller neurotransmittorer, sänder sina signaler via G-proteinkopplade receptorer, aktivering av fosfolipas C, vilket hydrolyserar fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) i plasmamembranet för att generera diacylglycerol och inositoltrifosfat (IP3) ^3. Medan diacylglycerol kvar i plasmamembranet, diffunderar IP3 in i cytosolen och binder till IP3-receptorns (IP3Rs), vilken ligand är aktiverade kalciumkanaler, som finns i ER-membranet och kalcium frigöres från ER luminala butik som kulminerar i en ökning i cytosoliska kalciumkoncentrationer ^4. En alternativ väg för kalcium att nå cytosolen är genom kalciumkanaler och växlarna är närvarande i plasmamembranet. Överhörning mellan dessa två avdelningar har beskrivits: kalcium inducerad kalciumfrisättning (CICR) där extracellulärt kalcium inducerar kalciumfrisättning från ER butiker ^5, och lagra drivs kalcium post (SOCE) där tömning av ER butikerna känns av Stim och orsakar öppnandet av Orai kalciumkanalerna i plasmamembranet för att främja påfyllning av ER lagrar ^6.

Under patofysiologiska förhållanden, är den cellulära kalciumsvaret avreglerade och cytosola kalciumökningar i frånvaro av fysiologiska stimulatorer ^1. Kalciumsvar kan påverkas på flera sätt: långvarig kalciumsignal, fördröjd kalcium bort från cytosolen, utarmning av kalcium butiker eller lokala förändringar i kalcium. Dessutom mitokondrierna ta på sig en central roll i buffring och släppa kalcium ^7. Långvarig och / eller supramaximal cytosoliskt ökning kalcium leder till celldöd. I själva verket är kalcium oftast involverade i cellulära patofysiologiska svar och är en viktig händelse i ett brett spektrum av sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, hjärtsjukdomar, cancer, skelettsjukdom och njursjukdom, som främst förknippas med celldöd och förlust eller ändring av organ eller vävnad funktion ^8-10. Dessutom har störning av kalciumsignaler kopplats till cellulär anpassning och förändringar i mobilfunktioner och svar.

Traditionellt är kalciumsignalerna mäts med en negativt laddad fluorescerande indikator kalcium som laddas in i celler i ett cell permeabelt acetoximetyl (AM) esterform. När spjälkas av cellulära Esterases, de fluorescerande indikatorerna fortfarande inom det intracellulära utrymmet och öka i fluorescensintensiteten när kalcium är bunden. Den mest kända och använda kalcium indikator är ratiometrisk Fura-2 har utvecklats av Roger Tsien och kollegor ^11. Kalcium indikatorer med varierande affinitet för kalcium tillåta olika kalcium pooler som skall övervakas. Detektionsmetoder inkluderar levande cell imaging, fluorescens-mikroplattläsare och flödescytometri. De relativt snabb kinetik av kalciumsignaler (oftast inom några sekunder till minuter) gör levande cell imaging den bästa metoden för att få mest information om egenskaperna hos kalciumsignalen. Bortsett från de snabba kinetiken av kalciumsignaler (inom millisekunder), är levande cell imaging en bättre metod för att studera cellulära uppdelning av kalciumsignalering i en enda cell ^12. Absoluta kalciumkoncentrationer kan beräknas genom att bestämma lägsta och högsta fluorescens av kalcium indicator genom att tillsätta en kalcium kelator och permeabilisering av cellerna, respektive, såsom beskrivits av Grynkiewicz et al., ^11.

Användningen av flödescytometri för att mäta kalciumsignaler utvecklades först på 1980-talet i immunologiska celler där möjlighet att mäta flera parametrar, såsom membranintegritet och separering av cellpopulation, och kravet på celler i suspension i kombination med utveckling av en enda våglängd kalcium indikatorer gjorde flödescytometri ett ideal och convenientdetection metod ^13-15. I vidhäftande celler, ger levande cell imaging mest information om kalciumsignalering, viktigast av kinetiken, men kräver en komplicerad installation bestående av ett fluorescensmikroskop, ett perfusionssystem, underhåll av den cellulära miljön, såsom temperatur och specialiserad mikroskop programvara för att förvärva och analysera data. Alternativa metoder såsom en fluorescensmikroplattläsare eller Pharmacological sätt genom användning av kalcium chelatorer är makalös när det gäller fått information. Flödescytometri blir mer allmänt används för att övervaka cytosoliskt kalcium i vidhäftande celler men i de flesta studier, bara slutpunkten mätningar utförs. Med användning av den metod som ursprungligen utvecklades av Gergely et al., I immunologiska B-celler ^16, förändringar i cytosolisk fri kalciumkoncentration genom flödescytometri med realtids kinetik och övervakning av fluorescensintensiteten i enskilda celler från en provpopulation har framgångsrikt mätt i cancerepitelceller och cancer stamcell hybrider ^17. Denna metod har vidare anpassat för användning i adherenta epitelceller, vilka är svåra att ladda med kalciumindikatorer ^18.

Här, med hjälp av en odödlig vidhäftande epitelcellinje härledd från S1 segmentet av råttnjure proximala tubuli (WKPT-0293 CI.2) ¹⁹ beskriver vi en optimerad förenklad metod för mätning av förändringar i cytosolen kalciumkoncentrationen genom flödescytometri. Eftersom många epitelceller har ett antal organiska transportörer för anjoniska föreningar, kan laddning av celler med en kalciumindikator visa sig vara en utmaning. För att förhindra utflödet av kalciumindikatorer, probenecid, den prototypiska inhibitom av organisk anjon transportörer och som ursprungligen utvecklades för att minska den renala utsöndringen av penicillin ^20, appliceras samtidigt i inkubationsmediet. Cellerna hålls i monolager för kalcium indikator laddning, bringas i fjädring och kalciumsignalerna kan upptäckas omedelbart efter förening tillsats.

Protocol

1. Beredning av reagens och lösningar Bered en modifierad Hanks balanserade saltlösning (HBSS) (i mM: 136,9 NaCI, 5,37 KCI, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCOs 3, pH 7,2, ingen fenolrött). Förvaras vid 4 ° C. Gör 1,5 M CaCl 2 och 2 M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) (pH 7,2) stamlösningar med användning av destillerat vatten. Förbered en 250 mM stamlösning av probenecid. För den fria …

Representative Results

För att öka cytosoliskt kalcium ades två farmakologiska föreningar tillämpas på njur proximala tubuli celler (WKPT-0293 CI.2) laddade med cellpermeabla kalciumbindande färgämne, Fluo-3-AM. Obehandlade kontrollprover laddades med kalciumbindande färgämnet i närvaro av probenecid och blandades men utan tillsatsen av några föreningar. Tapsigargin (TG) är en klassisk hämmare av SERCA pumpen leder till läckage ut ur ER och resulterar i ökad cytosoliskt kalcium. Tunikamycin (TUN) blockerar N-glykosylering av …

Discussion

Kalcium är en nyckelhändelse i multipla cellulära processer som verkar som en andra budbärare signalerande molekyl och även som ett sätt att kommunicera mellan ER och mitokondrier. Möjligheten att mäta förändringar i fria cytosoliska kalciumkoncentrationer är en användbar teknik som kan tillämpas på alla områden av cellbiologi. Det finns olika metoder för att upptäcka cytosoliska kalciumsignaler. Klassiskt, signaler från en ratiometrisk indikator kalcium, såsom Fura-2, övervakas i levande celler med …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)