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Biology

L'infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l'analisi di differenziazione emopoietiche

Published: October 20, 2014 doi: 10.3791/52022

Protocol

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1 embrionali Corpo (EB) Formazione

  1. Gelatina-adattare CES che si sono mantenuti su fibroblasti di embrione di topo (MEF). Passage CES 3 volte su 6 e piastra di coltura dei tessuti rivestiti con lo 0,1% di gelatina per rimuovere MEF.
    1. Grow celle ESC mezzi di manutenzione con LIF per mantenere le cellule indifferenziate (Tabella 1). Assicurarsi che le cellule non superano mai il 80% di confluenza. Utilizzare passaggio basso (10 o meno passaggi dopo la rimozione dal MEF) per la differenziazione delle cellule.
  2. Il giorno prima del CES sono coltivate per EB differenziazione, passaggio le cellule in modo che saranno circa il 50-70% confluenti il ​​giorno successivo. Continuare coltura di cellule in ESC terreno di mantenimento per mantenere pluripotenza delle cellule.
  3. Il giorno della differenziazione, mezzi di manutenzione ESC aspirare e lavare con 1 ml di tampone fosfato (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, e 11,9 mM tampone fosfato, pH 7.4) per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
    1. Aggiungere 200 ml di 0,25% trypsin / EDTA a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 3 min.
    2. Disattivare la tripsina / EDTA con 800 ml di mezzi di differenziazione. Pipettare su e giù in un 2 ml pipetta sierologica con una punta p200 per rompere-le cellule in una sospensione di cellule singole. Assicurarsi che la punta P200 si adatta comodamente alla fine in modo multimediale non va tra la pipetta e l'interfaccia punta.
    3. Pipettare su e giù circa 5-10 volte. Fare attenzione a non creare bolle durante il pipettaggio.
  4. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Portare al volume di 10 ml con PBS. Centrifugare a 315 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il surnatante. Lavare due volte con 5 ml di PBS per rimuovere il supporto restanti contenenti LIF. Centrifugare come al punto 1.4 per ogni lavaggio.
    1. Risospendere il pellet cellulare finale in 2 ml di mezzi di differenziazione (Tabella 2).
  6. Contare le cellule con un contatore emocitometro o cellulare e piastra 6,000-10,000 cellule / ml in una piastra Petri 10 centimetri(Cultura non-tessuto trattato).
    1. Determinare le esatte cellule / ml empiricamente per ogni linea ESC. Utilizzare piastre di Petri sterili normalmente utilizzati per il lavoro batterica o piastre di aderenza basso.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati di differenziazione, EBS dovrebbero costituire ambiti che rimangono in sospensione senza associare alla piastra. Prova diverse marche di piastre per trovare quelli con meno aderenza.
    2. Incubare i CES di differenziazione in un tessuto C cultura incubatore 37 ° con il 5% di CO 2.
Reagente Stock Concentrazione finale Volume Azienda Numero di catalogo
DMEM 1x 410 ml S Igma / Aldrich D5796
FBS (ES schermato) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Non essenziali Aminoacidi 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-glutammina 100x 1x 5 ml Life Technologies 35050
Penncillin / streptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanolo 14.3 M 114 mM 4 microlitri Sigma / Aldrich M3148
Leucemia inibitorio Factor (LIF) 10 7 unità / ml 1.000 unità / ml 50 microlitri Millipore ESG1107
ONTENUTO "> Tabella 1: ESC Manutenzione Media.

Reagente Stock Concentrazione finale Volume Azienda Numero di catalogo
DMEM 1x 410 ml Sigma / Aldrich D5796
FBS (User sottoposti a screening per la differenziazione ottimale) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Non essenziali Aminoacidi 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-glutammina 100x 1x 5 ml Vita Technologie 35050
Penncillin / streptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanolo 14.3 M 114 mM 4 microlitri Sigma / Aldrich M3148

Tabella 2: Differenziazione Media.

2. preparazione di cellule EB per infezione da virus

  1. Nella fase di sviluppo desiderato (tra il giorno 2 e il giorno 3), trasferire i EBs dalla piastra di Petri 10 centimetri di tubo da 15 ml. Lavare la piastra con 5 ml di PBS e aggiungere il lavaggio al tubo conico.
  2. Pellet EBS a 315 xg a temperatura ambiente per 5 min. Lavare le cellule EB con 5 ml di PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco delle cellule scongelati (contenente enzimi proteolitici e collagenolitica) e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 ° (o incubatore) per 30 minuti con OCCagitazione asional (da sfogliare o luce vortex).
  4. Aggiungere 1 ml di media differenziazione. Pipettare su e giù con una pipetta 2 ml con una punta p200 pipetta. Collocare la provetta nel 37 ° C bagnomaria ancora per 30-60 min.
  5. Centrifugare le cellule a 315 xg per 5 minuti e lavare le cellule con PBS.

3. Infezione da virus

  1. Risospendere le cellule in 1,5 ml di media differenziazione. Trasferire la sospensione cellulare a un non-tessuto piastra di coltura trattata 6-bene.
  2. Preparare il retrovirus con tecniche standard prima del tempo. Aggiungere 5 a 100 ml di surnatante virale alle cellule seconda titolo virale. Non aggiungere polibrene per migliorare infezione come questo inibisce la successiva riforma della EBS.
  3. Spinoculate le cellule con virus mediante centrifugazione a 2120 xg per 90 min a temperatura ambiente.

4. Differenziare virali Celle EB infetti in Drops Hanging

  1. Aggiungere 2 ml di media differenziazione in ciascun pozzetto di infected EB sospensione cellulare.
  2. Pipettare 3,5 ml di sospensione cellulare infetto EB in un serbatoio di reagente sterile per multipipettors. Utilizzare il multipipettor da Dispensare 15-20 righe di otto 20 ml gocce sul coperchio rovesciato della piastra di 15 centimetri Petri.
  3. Aggiungere 10 ml di PBS sterile o acqua per la metà inferiore della piastra Petri. Poi invertire il coperchio con le gocce e posto sulla piastra di Petri. Assicurarsi che le gocce sono appesi a testa in giù dal coperchio con PBS o acqua sotto per mantenere la camera umidificata.
  4. Porre le capsule nella 37 ° C tessuto cultura incubatore con il 5,0% di CO 2.
  5. Dopo 2 giorni, raccogliere EBs formate nel appeso gocce di invertire coperchio e lavaggio con 4.5 ml di mezzi di differenziazione.
    1. Mezzi di trasferimento e EBs ad una nuova cultura 10 centimetri non-tessuto Petri piatto. Lavare il coperchio ancora una volta con 3 ml di mezzi di differenziazione e trasferimento alla piastra 10 cm.
  6. Celle di raccolta per l'analisi mediante citometria a flusso dopo un totale di 8giorni di cultura a partire dal trasferimento iniziale delle cellule di supporto differenziazione (-LIF).

5. Celle Preparazione per l'analisi Citofluorimetro

  1. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta 10 ml. Lavare la piastra con 5 ml di PBS e trasferire allo stesso tubo conico.
  2. Cellule pellet a 315 x g. Lavare pellet con 10 ml di PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco delle cellule scongelati e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 ° per 30 minuti con agitazione occasionale. Per il rilevamento di alcuni antigeni di superficie delle cellule, tripsina può essere utilizzato in sostituzione.
  4. Aggiungere 1 ml di mezzi di differenziazione e pipettare su e giù con una pipetta 2 ml. Utilizzare una punta p200 alla fine della pipetta per contribuire a spezzare-up digerito EB in sospensione di cellule singole.
    1. Posizionare il tubo in un bagno di 37 ° C l'acqua di nuovo per 60 minuti in modo che le proteine ​​integrali di membrana di riciclare alla superficie cellulare.
  5. Agglomerare cellule a 315 xg per 5 min.
  6. Lavare le cellule with 0,1% di sieroalbumina bovina Fraction V (BSA) preparato in PBS (PBS / BSA) e incubare le cellule con specifiche fluorescente contrassegnati anticorpi.

6. Citometria a flusso Analisi per ematopoietiche Progenitori

  1. Mettere 10 6 cellule EB derivate in un 5 ml 12 x 75 mm tondo tubo inferiore. Per regolare citofluorimetro impostazioni di compensazione, utilizzare sfere di compensazione secondo le istruzioni del produttore.
  2. Cellule pellet a 315 x g. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in soluzione residua PBS / BSA nel tubo.
  3. Per la rilevazione ESC HPC, incubare le cellule con anticorpi fluorescenti marcato: anti-topo CD41-PE (R-Phycoerytherin) e anti-topo CD117 (CKIT) -APC / Cy7 (Allophycocyanin Cyanine 7).
    1. Diluire gli anticorpi 1: 100 in PBS / BSA. Aggiungere 100 ml di anticorpo diluito per ogni campione. Determinare la corretta diluizione di anticorpi per ogni fornitore, clone, e lotto o anticorpi. Determinare diluizione ottimale per l'etichettatura di cellule individualmente.
    2. Incubare campioni su ghiaccio al buio per 30 min.
    3. Aggiungere 2 ml di PBS / BSA e pellet cellule a 315 xg per 5 min.
    4. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 300 ml di PBS o un altro buffer isotonico.
    5. Filtro risospese cellule attraverso un tappo filtro cella (0.35 mM) per rimuovere grandi aggregati di cellule.
    6. Analizzare le cellule su un citometro a flusso.

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Representative Results

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In questi studi gelatinizzati RW4 (derivato dal ceppo del mouse 129X1 / SVJ CES) sono stati utilizzati. EBs sono stati isolati in 3 giorni di differenziazione. Per ottenere i migliori risultati EBS devono essere sferica e non aderente (Figura 1A, B). Dopo spinoculation con il virus co-esprimono la GFP marcatore fluorescente con un gene di interesse, EBS sono stati riformati secondo il metodo della goccia pendente. EBs sono stati riformati con successo da sospensioni cellulari preparate da 2,0, 2,5, e 3,0 giorni EBs. Tuttavia, EB non poteva essere riformata da sospensioni cellulari preparate dal giorno 4,0 EBS. Il chimerismo di EBS tra le cellule infette e non infette è stata osservata tramite microscopia a fluorescenza a giorno 8 di differenziazione (Figura 2A, B). La densità del EBs rende spesso EBS sembrano essere al 100% GFP positive. Tuttavia, concentrandosi su diversi piani focali può rivelare il contributo delle cellule positive e negative GFP alla EB (Figura 2B).

Foanalisi r di sviluppo HPC, EBs chimerici sono stati dissociato in sospensioni singola cella dopo 8 giorni di differenziazione. Antagonizzare l'attività di miRNA (s) del cluster mirn23a (miR-23a, 24-2, e -27) si traduce in una incapacità di CES di differenziarsi in cellule progenitrici del sangue (manoscritto in preparazione). Per determinare se la sovraespressione del cluster mirn23a ha l'effetto opposto, CSE sono stati infettati al momento della comparsa di differenziazione. Tuttavia, questo si traduce nella generazione di HPC è diminuita. Dal momento che il cluster mirn23a può essere coinvolto in TGFß / BMP / Smad segnalazione 18-21, il cluster può avere effetti diversi se espresso a diversi stadi di sviluppo EB simili a BMP4 attivata Smad1 proteine ​​12,13. Usando questo protocollo, EB sospensioni monocellulari sono stati infettati dopo 3 giorni di differenziazione. EBs sono stati riformati per impiccagione goccia, e successivamente analizzato a giorno 8 per la generazione di HPC analizzando CD41 e CD117 superficie cellulare expression mediante citometria di flusso. CD41 + cellule positive singole sono un pool di HPC primitivi e definitive, mentre le cellule CD41 + CD117 + contengono solo HPC definitive 22,23. Abbiamo osservato un significativo aumento della popolazione complessiva di CD41 + HPC nelle cellule MSCV-mirn23a infetti rispetto alle cellule di controllo MSCV virus infetti (Figura 3). Il dato dimostra anche che un elevato apporto di cellule infette ai EB riformati può essere raggiunto. E 'importante per infettare EB sia con un virus di controllo che esprime la proteina fluorescente da solo, così come infettare cellule con il virus sperimentale. Popolazioni infette (GFP +) dovrebbero quindi essere confrontati per le differenze di fenotipo. Esaminare le differenze tra cellule non infette contro le cellule infette possono dare risultati errati. Confrontando GFP (non infetto), e GFP + (infetto) popolazioni vi è una differenza nelle popolazioni CD41 sia nel MSCV e culture MSCV-mirn23a (Figura 3). Questo aumento può essere dovutodi retrovirus di infettare le cellule proliferative.

Figura 1
Figura 1: Giorno Rappresentante 3 corpi embrionali RW4 CES sono state commutate dal CES manutenzione dei media in supporti di differenziazione e coltivate in piastre 10 centimetri (A) le immagini 4X e (B) 10X sono esposti dei corpi embrionali che si sono sviluppate dopo 3 giorni di coltura... Nell'immagine 4X barra rappresenta 1.000 micron, mentre nell'immagine 10X barra rappresenta 400 micron.

Figura 2
Figura 2: Otto giorni embrionali Bodies (EB) riformati dal infetti giorno 3 celle EB retrovirali. (A) la mano sinistra le immagini laterali sono in campo chiaro. (B) Le tre colonne fluorescenti di immagini fluorescenti a destra sono gli stessi EB presa in differenti piani focali. Nelle immagini 4X barra rappresenta 1.000 micron, mentre nelle immagini 10X barra rappresenta 400 micron.

Figura 3
Figura 3:. Analisi di citometria a flusso delle cellule progenitrici ematopoietiche prodotte in EBs chimerici singole cellule sospensioni sono state preparate da d3 EBs, e infettati con i retrovirus indicate. EBs sono stati riformati per impiccagione goccia, e colto ulteriori 8 giorni. Sospensioni di cellule singole sono stati generati e incubate con anticorpi fluorescente a CD41 e CD117. Sinistra istogramma mano mostrano la GFP (cellule non infettate) e GFP + (cellule infette) cancelli. I pannelli mano destra mostrano colore dot plot di cellule positive per CD41 e CD117 espressione nella GFP e GFP + cancelli. Progenitori emopoietici primitivi si trovano nelle CD41 + frazioni, e progenitori definitivi sono presenti sia nel CD + CD41117-, e CD41 + CD117 + frazioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Come discusso in precedenza, cloni ESC inducibile che esprimono un gene di interesse possono essere generati utilizzando sistemi di doxiciclina, tuttavia, la generazione di queste linee è ad alta intensità di tempo e di lavoro. Descritto in questo protocollo è un metodo per esprimere un gene di interesse in sospensione di cellule singole preparate con ESC derivato EBS. Queste cellule infette vengono poi riformate in EBs da appendere goccia per esaminare la successiva differenziazione. Nell'esempio (figura 3), si è dimostrato che l'espressione del cluster mirn23a migliora lo sviluppo ematopoietico quando espresso al giorno 3 di differenziazione. A questo punto lo sviluppo della nascente tessuto strato germinale è verificato compresa mesoderma precoce che dà origine a progenitori di sangue. Al giorno 2 e 3 della RW4 ESC differenziazione, espressione di geni che rappresentano ectoderma (Pax6), endoderma (Foxa2), e mesoderma (T, Twist, e Tbx6) vengono rilevati da PCR quantitativa trascrittasi inversa (Q-RT-PCR, i dati non mostrato). Per mirn23a per migliorare la produzione di HPC, potrebbe essere necessario essere espressa nei primi mesi del mesoderma. Questa tecnica permette la capacità di determinare se un transgene ha effetti diversi su sua espressione temporale senza spendere un sacco di fatica per generare nuovi reagenti. Osservando fenotipi associati alla distinta espressione temporale, un investigatore può decidere di spendere ora il tentativo di generare linee inducibili in cui l'espressione del transgene può essere controllato strettamente.

Altre applicazioni di questa tecnica includono l'esecuzione di esperimenti di salvataggio in CES, dove entrambi gli alleli di un gene di interesse sono state soppresse (Double Knockout CES, DKOS). Il gene di tipo selvatico o versioni mutate del gene eliminato potrebbero essere reintrodotti nelle cellule differenzianti EB. Inoltre salvataggio di un fenotipo da geni a valle del gene cancellato può essere saggiato. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare la natura cellula intrinseca dei fenotipi osservati. Ad esempio in hematopoiesis, i difetti sono stati osservati nei geni che influenzano sia l'staminali emopoietiche e stesse cellule progenitrici o talvolta il difetto possono influenzare le cellule del microambiente che sono necessari per sostenere lo sviluppo delle staminali e progenitrici delle cellule 16,24. In questo sistema, se il difetto è intrinseco alle cellule progenitrici ematopoietiche, poi reintroduzione del gene di tipo selvatico solo salvare lo sviluppo ematopoietico nel retrovirali (infetti), le cellule GFP +. Se il difetto fosse non-cellule autonome, quindi l'infezione retrovirale si tradurrebbe in un salvataggio di sviluppo ematopoietico essere osservati sia GFP + e le popolazioni GFP.

In questo citometria a flusso protocollo viene utilizzato per identificare le cellule progenitrici ematopoietiche dalla superficie cellulare espressione di CD41 e CD117. In alternativa, dopo 8 giorni di differenziamento infettate cellule GFP + possono essere isolate da fluorescenza delle cellule attivate (FACS). Le cellule isolate possono poi essere analizzati per la presenza di specific progenitori emopoietici di saggi colonie ematopoietiche nei media metilcellulosa, come abbiamo precedentemente descritto 25,26. Allo stesso modo, l'RNA può essere estratto da cellule filtrate e analizzate per l'espressione di geni specifici lignaggio.

Il vantaggio della tecnica descritta è che richiede uno sforzo minimo per generare i reagenti necessari e consente l'espressione temporale di un transgene in EB sviluppo. Se un vettore virale co-esprimenti il ​​gene di interesse con una proteina fluorescente è già disponibile l'esperimento può essere eseguita immediatamente. Ci sono alcune limitazioni da considerare con la scelta di utilizzare questo protocollo. La tecnica qui descritta richiede la capacità di produrre retrovirus alto titolo di avere un numero sufficiente di cellule per l'analisi. Si noti inoltre che l'uso del retrovirus può provocare mutagenesi inserzionale che potrebbe produrre un fenotipo. Tuttavia, poiché questo protocollo sta esaminando un pool di cellule infette, invece di unpopolazione clonale, è meno probabile che un fenotipo a causa di mutagenesi inserzionale sarà osservato nel tempo breve della cultura. La principale limitazione della tecnica (rispetto ad un sistema inducibile come al sistema tet) è che l'espressione del transgene non può essere messo a tacere in un punto temporale successivo, e non vi è alcuna possibilità di controllare i livelli di espressione. CES che esprimono un transgene sotto il controllo della regolazione doxiciclina è vantaggiosa in quanto permette non solo per accendere il gene in modo temporale, ma anche permette di spegnere il gene in un punto temporale successivo. Variando la quantità di un induttore, come doxiciclina permetterà anche all'utente di espressione fine-tune. Infine i sistemi inducibili permettono l'espressione del transgene riproducibile in tutte le cellule, mentre in questo protocollo retrovirale non vi è espressione chimerico del transgene. Come discusso in precedenza se questa espressione chimerico potrebbe essere utile per alcune applicazioni. I sistemi inducibili offrono chiaramente unmolti vantaggi. Tuttavia, a causa della facilità e minori oneri della tecnica qui descritta, molti ricercatori troveranno utile per i loro studi di differenziazione delle cellule staminali embrionali.

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Disclosures

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma/Aldrich D5796
β-mercaptoethanol Sigma/Aldrich M3148
FBS (ES Screened) Hyclone SH30070.03E
FBS (Defined) Hyclone SH30070.03
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140
L-Glutamine Life Technologies 35050
Penn/Strep Life Technologies 15070
Trypsin/EDTA Life Technologies 25200
LIF ESGRO Millipore ESG1107
ACCUMAX Millipore SCR006
Trypsin/EDTA Life Technologies 25200
Falcon Tissue Culture Plates 6-well Fisher Scientific 08-772-1B
Falcon Non-treated Plates 6-well Fisher Scientific 08-772-49
Falcon Petri dish 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Falcon Petri dish 15 cm Fisher Scientific 08-757-148
Falcon Tube 5 ml Fisher Scientific 14-959-11A
Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap Fisher Scientific 08-771-23
White sterile resevoirs U.S.A. Scientific 111-0700
Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated Biolegend 133906
Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated Biolegend 105826
RW4 ESCs ATCC CRL-12418

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References

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Bikorimana, E., Lapid, D., Choi, H., Dahl, R. Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation. J. Vis. Exp. (92), e52022, doi:10.3791/52022 (2014).More

Bikorimana, E., Lapid, D., Choi, H., Dahl, R. Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation. J. Vis. Exp. (92), e52022, doi:10.3791/52022 (2014).

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