Summary

एक समुदाय आधारित सेटिंग से प्राप्त नमूनों में रैपिड fractionation और पूरे रक्त घटकों के अलगाव

Published: November 30, 2015
doi:

Summary

We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.

Abstract

एक गैर नैदानिक ​​सेटिंग में संग्रह और पूरे रक्त के नमूनों के प्रसंस्करण के साथ और पहले से मौजूद शर्तों के बिना दोनों समुदाय में रहने वाली व्यक्तियों का मूल्यांकन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। इन नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण कुंजी सेलुलर घटकों की गिरावट से बचने के लिए आवश्यक है। एक साथ परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC), डीएनए के लिए तरीकों यहाँ भी शामिल हैं, आरएनए और प्रसंस्करण के साथ एक महानगरीय क्षेत्र भर में प्रतिभागियों की सहमत के घरों में प्रदर्शन के लिए एक एकल रक्त ड्रा से सीरम अलगाव, संग्रह के 2 घंटे के भीतर शुरू की। हम 1600 से अधिक रक्त नमूनों बाद में सफल डीएनए मेथिलिकरण, जीनोटाइपिंग, जीन अभिव्यक्ति में इस्तेमाल किया और प्रवाह cytometry विश्लेषण करती किया गया है जो उपज संगत, उच्च गुणवत्ता सामग्री, प्रक्रिया के लिए इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है। नियोजित तरीके से कुछ मानक हैं; बताए गए तरीके से संयुक्त हालांकि, जब वे population- और / या समुदाय के प्रतिभागियों से नमूने के कुशल संसाधन को सक्षमसामान्य रूप से एक नैदानिक ​​सेटिंग में मूल्यांकन किया जाना नहीं होता, जो आधारित अध्ययन करता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल आम जनता की अधिक प्रतिनिधि हैं कि (बाद में और डेटा) के नमूने प्राप्त करने की क्षमता है।

Introduction

कई अध्ययनों के साथ और मानसिक (या अन्य) 1-4 बीमारियों के बिना व्यक्तियों के बीच खून में जीन की अभिव्यक्ति, डीएनए मेथिलिकरण और सेल सबसेट में मतभेद की विशेषता है। ये अध्ययन, हालांकि, इस रोग से जुड़े मतभेद के कारण रोगियों के इलाज की मांग कर रहे हैं, जिसके लिए बीमारियों का आम तौर पर और अधिक गंभीर प्रकृति के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसमें नैदानिक ​​सेटिंग से प्राप्त किया गया है। कारण "omics" दृष्टिकोण के क्षेत्र में प्रगति करने के लिए पिछले एक दशक रोग प्रसार की जनसंख्या के आधार पर अनुमान प्रदान करने के क्रम में, समुदाय और / या महामारी विज्ञान सेटिंग्स 5-7 से जीवविज्ञान नमूने प्राप्त करने में रुचि का एक विस्फोट और की एक व्यापक तस्वीर में देखा गया है इन मानसिक और / या शारीरिक बीमारियों के पर्यावरण निर्धारकों।

इस संबंध में एक प्रमुख चुनौती एकत्रित नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं, frequentl हैं कि कुंजी प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों की गिरावटY एक व्यक्ति के स्वास्थ्य, संग्रह 8-10 के 2 घंटे के बाद वसूली में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ खून ड्रॉ पर तुरंत शुरू होता है का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया। इस चुनौती से निपटने के लिए, हम मानव पूरे रक्त के कई घटकों को एक साथ एक बड़ा महानगरीय क्षेत्र में रहने वाले विषयों के घरों में प्राप्त नमूनों से अलग कर रहे हैं, जिसमें एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल हमारे संकलन और भविष्य की तकनीक आगे अलगाव के लिए अनुमति घटना में सभी "" अतिरिक्त अंशों की भंडारण सहित वर्तमान तकनीकों के संशोधन पर आधारित है / विश्लेषण करती है। वैकल्पिक तरीकों या किट यहाँ वर्णित व्यक्ति तरीकों, उन रेखांकित की जगह में नियोजित किया जा सकता है, जबकि एक उच्च throughput ढंग से नमूने के प्रसंस्करण के लिए एक विश्वसनीय और कारगर साधन साबित किया है। उच्च गुणवत्ता भिन्न (PBMCs, डीएनए, सीरम, और आरएनए) ताजा खून की 2 दिन (चित्रा 1 के भीतर उपलब्ध हो सकता है 2 संग्रह के मानव संसाधन और सभी परख के लिए तैयार नमूनों के भीतर उत्पादन किया जा सकता)।

इस प्रोटोकॉल समुदाय में रहने वाली, डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन में परीक्षण के लिए डेट्रायट के शहर के वयस्क निवासियों से एकत्र नमूनों की कुशल संसाधन को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-एस 1), एक जनसंख्या आधारित सदमे के बाद तनाव विकार (पीटीएसडी) और अन्य मानसिक बीमारियों के सामाजिक और जैविक निर्धारकों का अध्ययन। डेट्रायट में पीटीएसडी के प्रसार में दो बार राष्ट्रीय औसत 11,12 से अधिक है। इस आबादी में पीटीएसडी के जैविक निर्धारकों की पहचान करना इस शहरी आबादी में, और अन्य उच्च जोखिम आबादी (जैसे, सैन्य दिग्गजों लौटने) दोनों में विकार से पीड़ित लोगों की सहायता के लिए उचित pharmacologic और / या संज्ञानात्मक व्यवहार उपायों को विकसित करने में मदद कर सकता है। पहले से डेट्रॉयट, मिशिगन में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में स्थित हमारी प्रयोगशाला, एक किस्म से ली गई ताजा ऊतकों के नमूनों से निपटने में हमारी विशेषज्ञता के आधार पर प्रसंस्करण के लिए चयनित किया गया थासूत्रों की आवश्यकता संग्रह के 2 घंटे के भीतर नमूने प्रसंस्करण के लिए शुरू करने के लिए, और संग्रह साइटों के लिए हमारी निकटता। हाथ में इस अद्वितीय अवसर के साथ, हमारे लक्ष्य को प्रत्येक नमूना से डीएनए, आरएनए, सीरम और परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) की सबसे बड़ी उपज (नमूना संग्रह के 5 लहरों पर एन = 1639 नमूनों की कुल) के लिए प्रसंस्करण अनुकूलन करने के लिए किया गया था। यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं इस प्रकार माइक्रोएरे, epigenetic, वास्तविक समय आरटी पीसीआर सहित बहाव के अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए सामग्री (औसत पैदावार के लिए 1 टेबल देखें) शुरू करने के उत्पादन, एक गैर नैदानिक ​​सेटिंग में एक साथ प्रदर्शन किया, और विश्लेषण प्रवाह cytometry जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. कुल मिलाकर काम प्रवाह। यहाँ दर्शाया समग्र प्रक्रिया की सहमत खास पहचान करने से रक्त नमूनों को प्राप्त करने की रसद शामिलरक्त के लिए ipants खुद को आकर्षित। उच्च गुणवत्ता, भिन्न (परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear; PBMCs, डीएनए, सीरम, और आरएनए) ताजा पूरे रक्त का संग्रह के 2 घंटे के भीतर उत्पादन किया जा सकता है और सभी परख के लिए तैयार नमूनों 2 दिनों के भीतर उपलब्ध हो सकता है। नमूने तुरंत परीक्षण किया जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं इसके अलावा, इस पद्धति के माध्यम से तैयार अंशों लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपयुक्त हैं। यहाँ रेखांकित पूरे समय एक ही दिन (~ 5 घंटा कुल) में पूरा किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के एक दिन विशेष रूप से तकनीक के साथ काफी अनुभव के साथ एक एकल तकनीशियन के लिए अत्यंत गहन परिश्रम किया जाएगा। इस प्रकार, हम कम से कम दो तकनीशियनों के बीच दिन 1 पर प्रक्रियाओं को विभाजित और 2 दिवस पर आरएनए प्रसंस्करण को पूरा करने की सिफारिश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन की समीक्षा की और मिशिगन के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रतिभागियों को पूर्व अध्ययन में उनकी भागीदारी के लिए सहमति सूच?…

Representative Results

यह समग्र प्रक्रिया जीन माइक्रोएरे और आरटी पीसीआर विश्लेषण के माध्यम से अभिव्यक्ति, epigenetic संशोधनों का पता लगाने, और सेल सबसेट विविधताओं सहित बहाव के अनुप्रयोगों के एक भीड़ में विश्लेषण के लिए उच्च गुणव?…

Discussion

हम सफलतापूर्वक डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन में 1600 से अधिक पूरे रक्त के नमूनों की प्रक्रिया को लागू किया गया है कि एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इन तकनीकों के कई मौजूदा साहित्य में उप?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Henriette Mair-Meijers for invaluable attention to detail and hours devoted to processing the blood collections. We are grateful for the graphic design expertise of Natalie Jameson Kiesling. We also appreciate the approval of the manufacturers (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) mentioned herein to publish the use of their products as described. Funding for this work was generously provided by the National Institutes of Health award numbers DA022720, RC1MH088283, and DA022720-05-S1.

Materials

QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Day 1: DNA isolation
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P5493-1L Day 1: PBMC isolation
5 ¾” Pasteur pipets Fisher 13-678-6A Day 1: PBMC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated Life Technologies 10082147 Day 1: PBMC isolation
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-500ml Day 1: PBMC isolation
RPMI Medium 1640, liquid Invitrogen 11875119 Day 1: PBMC isolation
0.4% trypan blue stain  Invitrogen T10282 Day 1: PBMC isolation
Countess Cell Counting Chamber Invitrogen C10283 Day 1: PBMC isolation
Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer Invitrogen C10281 Day 1: PBMC isolation
LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit  Ambion 1933 Day 1: Leukocyte RNA isolation
25G x 5/8 in. needles Becton Dickinson 305122 Day 1: Leukocyte RNA isolation
Syringes (5ml) Becton Dickinson 309646 Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation
Denaturing Lysis Solution  Ambion 8540G Day 2: Leukocyte RNA isolation
5M NaCl Life Technologies 24740011 Day 2: Leukocyte RNA isolation
TRI Reagent  Ambion 9738 Day 2: Leukocyte RNA isolation
Bromo-3-chloro-propane (BCP) Sigma B-9673 Day 2: Leukocyte RNA isolation
spin cartridges  Ambion 10051G Day 2: Leukocyte RNA isolation
0.1mM EDTA Ambion 9912 Day 2: Leukocyte RNA isolation
DNA-free Kit Ambion AM1960 Day 2: DNase treament
RNA 6000 Ladder  Agilent 5067-1529 Day 2: Bioanalyzer analysis
RNA 6000 Nano Series II Kit  Agilent 5067-1511 Day 2: Bioanalyzer analysis
RNaseZAP Ambion AM8782 Day 2: Bioanalyzer analysis
Ethanol >99% Sigma E7023-500ml
Isopropanol >99%  Sigma I9516-500ml
Nuclease-free ultra pure water  Invitrogen 9938
Pipette tips (nuclease-free) Eppendorf 22491253
Pipetter (serological) Eppendorf 2223020-4
Pipetters (for volumes under 1ml) Eppendorf 3120000-054
Pipettes (serological) Fisher 13-678-27E
Controlled rate freezing containers Nalgene 5100-0001
Cryoboxes (to hold 2ml and 5ml cryovials and 1.5ml microcentrifuge tubes) Fisher 03-395-464
Test tube rack Thermo Scientific 14-804-134
15ml polypropylene tubes  Fisher 14-959-49D
1.5ml and 0.65 microcentrifuge tubes Fisher 07-200-534 and 07-200-185
2ml and 5ml cryovials Fisher 10-500-26 and 10-269-88F 
8ml CPT vacutainer BD Biosciences 362761 2 tubes
6ml K2 EDTA vacutainer BD Biosciences 367863 2 tubes
8.5ml SST vacutainer BD Biosciences 367988 1 tube
Vortexer Fisher 2215365
Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes Fisher 11-715-1250
Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood Fisher 01-257-87
Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid Eppendorf 22637002
Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125mm vacutainers and 15ml polypropylene tubes  Eppendorf 22628157 2, one does not need to be refrigerated
Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device Fisher 13-400-411
Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies G2940CA
Liquid nitrogen tank Thermo Scientific 11-676-56
-80 ˚C freezer Thermo Scientific 992RAK
Sharps container Fisher 22-037-970
Biological waste container Thermo Scientific 1223P52
Biosafety Level 2  certified cell culture hood Thermo Scientific 13-261-315

References

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. . QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010)
  14. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  15. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  16. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2013).
  17. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  18. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  19. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2011).
  20. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2011).
  21. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2010).
  22. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2010).
  23. Bustamante, A. C., et al. . Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2013).

Play Video

Cite This Article
Weckle, A., Aiello, A. E., Uddin, M., Galea, S., Coulborn, R. M., Soliven, R., Meier, H., Wildman, D. E. Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting. J. Vis. Exp. (105), e52227, doi:10.3791/52227 (2015).

View Video