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Medicine

एक समुदाय आधारित सेटिंग से प्राप्त नमूनों में रैपिड fractionation और पूरे रक्त घटकों के अलगाव

Published: November 30, 2015 doi: 10.3791/52227
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 5, 6, 7, 6, 1,2
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

Abstract

एक गैर नैदानिक ​​सेटिंग में संग्रह और पूरे रक्त के नमूनों के प्रसंस्करण के साथ और पहले से मौजूद शर्तों के बिना दोनों समुदाय में रहने वाली व्यक्तियों का मूल्यांकन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। इन नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण कुंजी सेलुलर घटकों की गिरावट से बचने के लिए आवश्यक है। एक साथ परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC), डीएनए के लिए तरीकों यहाँ भी शामिल हैं, आरएनए और प्रसंस्करण के साथ एक महानगरीय क्षेत्र भर में प्रतिभागियों की सहमत के घरों में प्रदर्शन के लिए एक एकल रक्त ड्रा से सीरम अलगाव, संग्रह के 2 घंटे के भीतर शुरू की। हम 1600 से अधिक रक्त नमूनों बाद में सफल डीएनए मेथिलिकरण, जीनोटाइपिंग, जीन अभिव्यक्ति में इस्तेमाल किया और प्रवाह cytometry विश्लेषण करती किया गया है जो उपज संगत, उच्च गुणवत्ता सामग्री, प्रक्रिया के लिए इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है। नियोजित तरीके से कुछ मानक हैं; बताए गए तरीके से संयुक्त हालांकि, जब वे population- और / या समुदाय के प्रतिभागियों से नमूने के कुशल संसाधन को सक्षमसामान्य रूप से एक नैदानिक ​​सेटिंग में मूल्यांकन किया जाना नहीं होता, जो आधारित अध्ययन करता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल आम जनता की अधिक प्रतिनिधि हैं कि (बाद में और डेटा) के नमूने प्राप्त करने की क्षमता है।

Introduction

कई अध्ययनों के साथ और मानसिक (या अन्य) 1-4 बीमारियों के बिना व्यक्तियों के बीच खून में जीन की अभिव्यक्ति, डीएनए मेथिलिकरण और सेल सबसेट में मतभेद की विशेषता है। ये अध्ययन, हालांकि, इस रोग से जुड़े मतभेद के कारण रोगियों के इलाज की मांग कर रहे हैं, जिसके लिए बीमारियों का आम तौर पर और अधिक गंभीर प्रकृति के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसमें नैदानिक ​​सेटिंग से प्राप्त किया गया है। कारण "omics" दृष्टिकोण के क्षेत्र में प्रगति करने के लिए पिछले एक दशक रोग प्रसार की जनसंख्या के आधार पर अनुमान प्रदान करने के क्रम में, समुदाय और / या महामारी विज्ञान सेटिंग्स 5-7 से जीवविज्ञान नमूने प्राप्त करने में रुचि का एक विस्फोट और की एक व्यापक तस्वीर में देखा गया है इन मानसिक और / या शारीरिक बीमारियों के पर्यावरण निर्धारकों।

इस संबंध में एक प्रमुख चुनौती एकत्रित नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं, frequentl हैं कि कुंजी प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों की गिरावटY एक व्यक्ति के स्वास्थ्य, संग्रह 8-10 के 2 घंटे के बाद वसूली में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ खून ड्रॉ पर तुरंत शुरू होता है का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया। इस चुनौती से निपटने के लिए, हम मानव पूरे रक्त के कई घटकों को एक साथ एक बड़ा महानगरीय क्षेत्र में रहने वाले विषयों के घरों में प्राप्त नमूनों से अलग कर रहे हैं, जिसमें एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल हमारे संकलन और भविष्य की तकनीक आगे अलगाव के लिए अनुमति घटना में सभी "" अतिरिक्त अंशों की भंडारण सहित वर्तमान तकनीकों के संशोधन पर आधारित है / विश्लेषण करती है। वैकल्पिक तरीकों या किट यहाँ वर्णित व्यक्ति तरीकों, उन रेखांकित की जगह में नियोजित किया जा सकता है, जबकि एक उच्च throughput ढंग से नमूने के प्रसंस्करण के लिए एक विश्वसनीय और कारगर साधन साबित किया है। उच्च गुणवत्ता भिन्न (PBMCs, डीएनए, सीरम, और आरएनए) ताजा खून की 2 दिन (चित्रा 1 के भीतर उपलब्ध हो सकता है 2 संग्रह के मानव संसाधन और सभी परख के लिए तैयार नमूनों के भीतर उत्पादन किया जा सकता)।

इस प्रोटोकॉल समुदाय में रहने वाली, डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन में परीक्षण के लिए डेट्रायट के शहर के वयस्क निवासियों से एकत्र नमूनों की कुशल संसाधन को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-एस 1), एक जनसंख्या आधारित सदमे के बाद तनाव विकार (पीटीएसडी) और अन्य मानसिक बीमारियों के सामाजिक और जैविक निर्धारकों का अध्ययन। डेट्रायट में पीटीएसडी के प्रसार में दो बार राष्ट्रीय औसत 11,12 से अधिक है। इस आबादी में पीटीएसडी के जैविक निर्धारकों की पहचान करना इस शहरी आबादी में, और अन्य उच्च जोखिम आबादी (जैसे, सैन्य दिग्गजों लौटने) दोनों में विकार से पीड़ित लोगों की सहायता के लिए उचित pharmacologic और / या संज्ञानात्मक व्यवहार उपायों को विकसित करने में मदद कर सकता है। पहले से डेट्रॉयट, मिशिगन में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में स्थित हमारी प्रयोगशाला, एक किस्म से ली गई ताजा ऊतकों के नमूनों से निपटने में हमारी विशेषज्ञता के आधार पर प्रसंस्करण के लिए चयनित किया गया थासूत्रों की आवश्यकता संग्रह के 2 घंटे के भीतर नमूने प्रसंस्करण के लिए शुरू करने के लिए, और संग्रह साइटों के लिए हमारी निकटता। हाथ में इस अद्वितीय अवसर के साथ, हमारे लक्ष्य को प्रत्येक नमूना से डीएनए, आरएनए, सीरम और परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) की सबसे बड़ी उपज (नमूना संग्रह के 5 लहरों पर एन = 1639 नमूनों की कुल) के लिए प्रसंस्करण अनुकूलन करने के लिए किया गया था। यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं इस प्रकार माइक्रोएरे, epigenetic, वास्तविक समय आरटी पीसीआर सहित बहाव के अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए सामग्री (औसत पैदावार के लिए 1 टेबल देखें) शुरू करने के उत्पादन, एक गैर नैदानिक ​​सेटिंग में एक साथ प्रदर्शन किया, और विश्लेषण प्रवाह cytometry जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. कुल मिलाकर काम प्रवाह। यहाँ दर्शाया समग्र प्रक्रिया की सहमत खास पहचान करने से रक्त नमूनों को प्राप्त करने की रसद शामिलरक्त के लिए ipants खुद को आकर्षित। उच्च गुणवत्ता, भिन्न (परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear; PBMCs, डीएनए, सीरम, और आरएनए) ताजा पूरे रक्त का संग्रह के 2 घंटे के भीतर उत्पादन किया जा सकता है और सभी परख के लिए तैयार नमूनों 2 दिनों के भीतर उपलब्ध हो सकता है। नमूने तुरंत परीक्षण किया जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं इसके अलावा, इस पद्धति के माध्यम से तैयार अंशों लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपयुक्त हैं। यहाँ रेखांकित पूरे समय एक ही दिन (~ 5 घंटा कुल) में पूरा किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के एक दिन विशेष रूप से तकनीक के साथ काफी अनुभव के साथ एक एकल तकनीशियन के लिए अत्यंत गहन परिश्रम किया जाएगा। इस प्रकार, हम कम से कम दो तकनीशियनों के बीच दिन 1 पर प्रक्रियाओं को विभाजित और 2 दिवस पर आरएनए प्रसंस्करण को पूरा करने की सिफारिश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन की समीक्षा की और मिशिगन के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रतिभागियों को पूर्व अध्ययन में उनकी भागीदारी के लिए सहमति सूचित प्रदान की है।

1 अवलोकन

  1. ठीक ढंग से समापन बिंदु आंकड़ों के विश्लेषण के माध्यम से भर्ती से सभी स्तरों दस्तावेज़। चरणों स्विचन और समय परमिट के रूप में ओवरलैपिंग, एक साथ दिन 1 पर प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं। चरणों के अनुक्रम प्रदर्शन क्षमता बढ़ाने के लिए लिखा है। एक पूरी प्रक्रिया का अवलोकन प्रदान करता चित्रा।
    नोट: शब्द, "प्रतिभागी" एक सहमति व्यक्ति से तैयार डे-पहचान खून का नमूना सूचित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कोष्ठक में बार नीचे हाथों पर समय का संकेत मिलता है। ट्रैकिंग चादर और नमूना लॉग इन के उदाहरण क्रमशः, अनुपूरक टेबल्स एस 1 और एस 2 में पाया जा सकता है। नमूने घरों में phlebotomists द्वारा एकत्र कर रहे हैं(आगे की पूर्व प्रसंस्करण जानकारी के लिए अनुपूरक सूचना (एसआई देखें) 1) एक कूरियर द्वारा अध्ययन समन्वयक द्वारा प्रतिभागियों को सहमति दे और प्रयोगशाला के लिए ले जाया के रूप में पहचान व्यक्तियों के।

2. दिन 1 सेटअप

  1. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें।
  2. 56 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्मी ब्लॉक पहले से गरम।
  3. दिन का प्रसव (भागीदार प्रति 2) के लिए microcentrifuge ट्यूब की उपयुक्त संख्या में 20 μl aliquoting द्वारा प्रोटीज (एसआई 2 देखें) तैयार करें।
  4. यदि आवश्यक हो तो, लेबल पर संकेत के रूप में 100% इथेनॉल, उनका कहना है बफ़र AW1 और AW2 (डीएनए की शुद्धता बढ़ाने के लिए कि डीएनए अलगाव किट में प्रदान धोने बफ़र्स) उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रशीतित अपकेंद्रित्र शांत हो जाओ।
  6. हस्तांतरण एसपीआई के शीर्ष पर पेंच टोपी को बनाए रखना है, उपलब्ध कराई गई रबर पट टोपी के साथ 1x पीबीएस की बोतल पर टोपी की जगह और एक हस्तांतरण कील के साथ रबर पट बेधKe वाष्पीकरण को रोकने के लिए। आरएनए स्थिरीकरण समाधान की बोतल के साथ दोहराएँ।
  7. बफ़र्स, सेंट्रीफ्यूज और गर्मी ब्लॉक की तैयारी के बाद, नमूना ट्रैकिंग शीट पर vacutainer डिलीवरी के समय के दस्तावेज (तालिका एसआई देखें)।

3. दिन 1: डीएनए, PBMCs और ल्युकोसैट आरएनए के लिए प्रसंस्करण पूरे रक्त के नमूने (2 घंटा)

  1. अवलोकन
    1. रक्त आकर्षित और प्रसंस्करण शुरू समय के बीच में देरी को कम करने के लिए पर्याप्त समय के लिए आवंटित। लाल रक्त कोशिका संदूषण में वृद्धि हुई है और मोनोन्यूक्लियर सेल वसूली में कमी से बचने के लिए रक्त ड्रा के 2 घंटा के भीतर Ficoll युक्त वैक्यूटेनर के प्रसंस्करण के लिए शुरू।
    2. Ficoll जेल ढाल युक्त 2 वैक्यूटेनर, 2 कश्मीर 2 ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) वैक्यूटेनर, और वयस्क भागीदार प्रति एक सीरम vacutainer का संग्रह मान लें। प्रयोगशाला में वैक्यूटेनर के वितरण पर, एक तकनीशियन के नमूनों की ट्रैकिंग चादर वाचक स्वीकृति पर हस्ताक्षर किया है। निवेदन करनानमूना लॉग इन पर एक vacutainer प्रतिशत के आधार पर प्रलेखित प्रारंभ समय के साथ तुरंत प्रसंस्करण में।
  2. सीरम अलगाव चरण 1 (1 मिनट)
    1. नमूना लॉग इन पर शुरू समय दस्तावेज़ (टेबल एसआई 2 देखें)। अपकेंद्रित्र एयरोसोल टोपी के साथ एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग (भागीदार प्रति 1) 7.0 मिलीलीटर सीरम (लाल) vacutainer (ब्रेक और त्वरण बंद के साथ) (जैव सुरक्षा स्तर 2; BSL2 प्रमाणित) 20 मिनट, 1300 XG, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए।
  3. डीएनए अलगाव चरण 1 (15 मिनट)
    नोट: इस अलगाव की प्रक्रिया के बारे में अधिक जानकारी के लिए, निर्माता प्रोटोकॉल 13 देखते हैं।
    1. प्रारंभ समय दस्तावेज़। एक BSL2 सेल संस्कृति हुड में, तो प्रोटीज के दो 20 μl aliquots (भागीदार प्रति 400 μl कुल) में से प्रत्येक में वैक्यूटेनर में से एक के ऊपर से पूरे रक्त 200 μl जोड़ने Ficoll जेल 5 बार युक्त वैक्यूटेनर पलटना। हुड में प्रोटीज + रक्त microcentrifuge ट्यूब जा रहे हो, Centri करने के लिए जारीकदम 3.4.1 में वैक्यूटेनर युक्त Ficoll के fugation।
      नोट: मन में कदम 3.4.1 में वैक्यूटेनर कताई जब (यानी, यह दो वैक्यूटेनर में से प्रत्येक से 200 μl को दूर करने के लिए आवश्यक हो सकता है) सेंट्रीफ्यूज संतुलन की आवश्यकता रखते हुए सबसे बड़े संग्रह की मात्रा के साथ vacutainer का प्रयोग करें। इसके अतिरिक्त, नीले वैक्यूटेनर के प्रसंस्करण के दौरान उचित जुदाई सुनिश्चित करने के लिए, vacutainer में शेष रक्त का स्तर Ficoll परत के ऊपर कम से कम 2.5 इंच नहीं होना चाहिए।
  4. PBMC अलगाव चरण 1 (1 मिनट)
    1. प्रारंभ समय दस्तावेज़ वैक्यूटेनर 8-10 बार युक्त Ficoll .Invert (लाल रक्त कोशिका संदूषण में वृद्धि हुई है और मोनोन्यूक्लियर सेल वसूली में कमी से बचने के लिए रक्त ड्रा के 2 घंटा के भीतर होना चाहिए)। (ब्रेक और त्वरण बंद के साथ) अपकेंद्रित्र 30 मिनट, 1600 XG, 22 डिग्री सेल्सियस के लिए एयरोसोल टोपियां (BSL2 प्रमाणित) के साथ एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग वैक्यूटेनर (भागीदार प्रति 2)।
  5. हुड पर लौटें और प्रोटीज + रक्त microcentrifuge ट्यूब (कदम 3.3.1) में से प्रत्येक के लिए 200 μl बफर अल जोड़ें। कैप, हुड से भंवर 15 सेकंड और फ्लैश स्पिन को हटा दें।
  6. एक गर्मी ब्लॉक में 56 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट सेते हैं।
  7. गर्मी ब्लॉक से ट्यूबों निकालें। फ्लैश स्पिन। BSL2 हुड पर लौटें। 200 μl 100% इथेनॉल जोड़ें। कैप, हुड से भंवर 15 सेकंड और फ्लैश स्पिन को हटा दें। बचे हुए चरणों हुड के बाहर पूरा किया जा सकता।
  8. Lysate लागू (2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में) एक लेबल स्पिन स्तंभ के लिए (कदम 3.5.3 के 30 मिनट के भीतर)। एयरोसौल्ज़ के माध्यम से पार संक्रमण से बचने के लिए टोपी बंद करें। अपकेंद्रित्र 6000 XG, 1 मिनट।
  9. छानना युक्त संग्रह ट्यूब त्यागें और एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह है।
  10. रिम moistening बिना स्तंभ के लिए 500 μl बफर AW1 जोड़ें टोपी बंद करें, और सेंट्रीफ्यूज 6000 XG, 1 मिनट।
  11. FILTRA युक्त संग्रह ट्यूब त्यागेंते एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह और।
  12. रिम moistening बिना स्तंभ के लिए 500 μl बफर AW2 जोड़ें टोपी बंद करें, और सेंट्रीफ्यूज 20,000 XG, 3 मिनट।
  13. छानना युक्त संग्रह ट्यूब त्यागें और एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब (नहीं किट में शामिल है) में स्पिन स्तंभ जगह है, और सेंट्रीफ्यूज 20,000 XG, 1 मिनट।
  14. छानना युक्त संग्रह ट्यूब त्यागें और एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह (किट में शामिल नहीं)।
  15. प्रत्येक स्तंभ के लिए 200 μl बफर एई या पानी जोड़ें और 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। अपकेंद्रित्र 6000 XG, 1 मिनट।
  16. एक ही संग्रह ट्यूब में eluting दोहराएँ कदम 3.5.11।
  17. भागीदार प्रति 2 कॉलम से eluted डीएनए पूल। भागीदार प्रति कुल उपज ~ 800 μl।
  18. समय की अनुमति देता है जब एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर नमूने यों।
  19. Specime पर प्रत्येक की एकाग्रता का दस्तावेजीकरण, 2 मिलीलीटर cryovials में वांछित के रूप में अशेष डीएनएलॉग n। स्थानांतरण लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक cryobox और जगह पर cryovials। फ्रीजर शुरू समय दस्तावेज़।
  • ल्युकोसैट आरएनए अलगाव चरण 1 (30 मिनट)
    नोट: एक जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रमाणित सेल संस्कृति हुड में प्रदर्शन करते हैं। इस अलगाव पर अधिक जानकारी के लिए निर्माता के निर्देशों 15 देखते हैं।
    1. एक हस्तांतरण कील के साथ कश्मीर 2 EDTA vacutainer की रबर पट पियर्स। म्यान बनाए रखने के लिए और कदम 3.6.11 में उपयोग के लिए टोपी पेंच। BSL2 मानक प्रथाओं के बाद, Bloodborne रोगजनकों के लिए जोखिम से बचने के लिए ध्यान रखना।
    2. हस्तांतरण कील के शीर्ष करने के लिए सफेद पर्ची कनेक्टर संलग्न।
    3. सफेद पर्ची कनेक्टर के लिए फिल्टर का प्रवेश (भड़का अंत) कनेक्ट तो इसी भागीदार आईडी के साथ फिल्टर लेबल।
    4. फिल्टर के आउटलेट (पतला अंत) के लिए एक लिपटा 25⅝ जी सुई संलग्न। पहले प्रसव के लिए फिल्टर विधानसभा काफी है और इसलिए प्रक्रिया शीघ्रता से तैयार कर रहा है,फिल्टर, तो लिपटा सुई जोड़ने और उपयोग करें जब तक एक संस्कृति ट्यूब रैक में विधानसभा की स्थापना, स्थानांतरण कील के लिए सफेद पर्ची कनेक्टर संलग्न की सिफारिश की है।
    5. कश्मीर 2 EDTA ट्यूब सिस्टम की विधानसभा के बाद, सुरक्षित रूप से (एक धातु रंग के अंत का उपयोग करें) सुई unsheathe। एक खाली 10 मिलीलीटर खाली रक्त संग्रह ट्यूब (सीरम रिसीवर ट्यूब) में सुई वार और कश्मीर 2 EDTA vacutainer / फिल्टर / रिसीवर ट्यूब विधानसभा पलटना। BSL2 मानक प्रथाओं के बाद, Bloodborne रोगजनकों के लिए जोखिम से बचने के लिए ध्यान रखना।
    6. फिल्टर का पच्चर के आकार वर्गों रक्त की मंजूरी दे दी है जब तक रक्त के माध्यम से फिल्टर करने की अनुमति दें। छानने का काम के बारे में 2 मिनट लगते हैं और छानने के दौरान एक टेस्ट ट्यूब रैक में रखा जा सकता है।
    7. विधानसभा से फिल्टर निकालें। छानना युक्त ट्यूब में सुई छोड़ दो और एक sharps कंटेनर में पूरे विधानसभा त्यागें।
    8. में, 1x पीबीएस की बोतल पर हस्तांतरण कील करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज संलग्नबोतल हरा रंग, और 3 मिलीग्राम वापस ले लें।
    9. (3-5 प्रति सेकंड बूँदें) फिल्टर के प्रवेश करने के लिए पीबीएस के साथ सिरिंज संलग्न और फिल्टर फ्लश। प्रवाह के माध्यम से एक जैविक अपशिष्ट कंटेनर में ले लीजिए। सवार retracting बिना फिल्टर से सिरिंज अलग करें।
    10. निस्पंदन और एक पीबीएस धोने के बाद, एक नया 5 मिलीलीटर सिरिंज और कदम 3.6.8 में वर्णित विधि का उपयोग आरएनए स्थिरीकरण एजेंट के 3 मिलीलीटर वापस ले लें। कदम 3.6.9 के रूप में फिल्टर फ्लश। आरएनए स्थिरीकरण एजेंट फिल्टर पर रहना चाहिए। सवार retracting बिना फिल्टर से सिरिंज अलग करें।
    11. आरएनए स्थिरीकरण एजेंट के साथ संतृप्त फिल्टर छोड़ने हस्तांतरण कील से बनाए रखा म्यान और पेंच टोपी के साथ फिल्टर इनलेट और आउटलेट सील। फिल्टर इस बिंदु पर संग्रहित किया जा सकता है। 5.4.7 करने के लिए 5.3 चरणों को पूरा करने के लिए समय परमिट तक -80 डिग्री सेल्सियस (~ 2 घंटा) पर फिल्टर स्टोर।
      नोट: संग्रह के बाद एक साल तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत फिल्टर एक decrea बिना संसाधित किया गया हैशाही सेना गुणवत्ता में एसई।
  • PBMC अलगाव स्टेज 2 (30 मिनट)
    1. सेंट्रीफ्यूज (कदम 3.4.1) से Ficoll युक्त वैक्यूटेनर निकालें और एक BSL2 हुड में जारी है। वैक्यूटेनर चित्रा 2 के रूप जुदाई प्रदर्शित करना चाहिए।, 2 टेबल नहीं देख पा रहे हैं।
    2. Vacutainer BSL2 हुड में लौट रहा है एक बार, डाट हटाने और मोनोन्यूक्लियर (स्पष्ट / सफेद) परत के करीब हो रही बिना एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग शीर्ष, पीले, प्लाज्मा परत (चित्रा 2) के 1.5 मिलीलीटर वापस ले लें। (- 1 प्रतिभागी 2 वैक्यूटेनर से पूल -) cryovial एक 5 मिलीलीटर के लिए प्लाज्मा स्थानांतरण। एकत्र मात्रा लॉग ऑन करें। भंडारण निर्देश के लिए कदम 3.7.6 देखें।
      नोट: सबसे अच्छा जुदाई और सबसे बड़ी PBMC पैदावार से पहले रक्त संग्रह करने के लिए कम से कम 12 घंटे के उपवास किया है जो प्रतिभागियों से आते हैं।
    3. यू - शेष प्लाज्मा और श्वेताभ, मोनोन्यूक्लियर परत (चित्रा 2 जेल परत के ऊपर सब कुछ) स्थानांतरणएक शंक्वाकार ट्यूब में भागीदार प्रति वैक्यूटेनर युक्त दो Ficoll में से प्रत्येक से मोनोन्यूक्लियर परत पूलिंग, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट गाते हैं।
    4. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कुल मात्रा लाने के लिए 1x पीबीएस जोड़ें। कैप ट्यूब और पलटना 5 बार। 15 मिनट, 300 XG, 22 डिग्री सेल्सियस (ब्रेक और त्वरण बंद के साथ) अपकेंद्रित्र।
    5. हुड में Ficoll युक्त वैक्यूटेनर पर लौटें और चारों ओर चक्कर आने और Ficoll जेल परत के बाहर ढीला और यदि संभव हो तो इसे हटाने के लिए एक 5¾ "पाश्चर pipet का उपयोग करके लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) इकट्ठा। इकट्ठा करने और cryovial एक 5 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिकाओं (~ 4.5 एमएल) के हस्तांतरण के लिए एक सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग करें। एकत्र मात्रा लॉग ऑन करें।
    6. एक नियंत्रित दर ठंड कंटेनर के लिए (कदम 3.7.5 में प्लाज्मा कदम 3.7.2 में और लाल रक्त कोशिकाओं) दोनों 5 मिलीलीटर cryovials स्थानांतरण और वे एक cryobox को हस्तांतरित और लौटा जा सकता है, जो समय के बाद कम से कम 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर डाल लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस।
    7. सह लौटेंकदम 3.7.4 में centrifugation पूरा हो गया है, और गोली परेशान बिना पीबीएस के सभी लेकिन ~ 500 μl महाप्राण जब डाकू, को nical ट्यूब। पीबीएस के ~ 200 μl इस स्तर पर गोली ऊपर छोड़ दिया जाता है, तो PBMC उपज अधिक है।
    8. 10 मिलीलीटर मात्रा लाने के लिए ताजा 1x पीबीएस जोड़ें। धीरे गोली Resuspend। कैप ट्यूब और पलटना 5 बार। 10 मिनट, 300 XG, 22 डिग्री सेल्सियस (ब्रेक और त्वरण बंद के साथ) अपकेंद्रित्र।
  • सीरम अलगाव स्टेज 2 (10 मिनट)
    नोट: एक BSL2 हुड में प्रदर्शन करते हैं।
    1. वांछित के रूप में 2 मिलीलीटर cryovials में, centrifugation (कदम 3.2.1) के बाद, सीरम vacutainer से शीर्ष सीरम परत विभाज्य। ठेठ उपज 2.5 मिलीलीटर (तालिका 1) है। मात्रा लॉग ऑन करें। उदाहरण के लिए, cryovial 1 में 200 μl aliquoting 4 cryovials, cryovial 2 में 1,000 μl उपयोग करें और फिर cryovials 3 और 4 में शेष विभाजित।
    2. लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक cryobox और जगह पर cryovials स्थानांतरण। फ्रीजर शुरुआत दस्तावेज़समय।
  • PBMC अलगाव स्टेज 3 (15 मिनट)
    1. गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला / पीबीएस के रूप में centrifugation (कदम 3.7.8), और महाप्राण के बाद, हुड पर लौटें। मझौले 1 बर्फ़ीली 2.5 मिलीलीटर PBMC में pipetting द्वारा resuspend गोली (एसआई 2 देखें)।
    2. कदम 3.9.1 में सेल / मध्यम समाधान के लिए मध्यम 2 (एसआई 2 देखें) बर्फ़ीली 2.5 मिलीलीटर PBMC जोड़ें। भंवर धीरे।
    3. विभाज्य एक 0.65 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सेल के समाधान के 10 μl (आगे कमजोर पड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है)। 0.65 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 0.4% trypan नीले दाग के 10 μl जोड़ें और कई बार pipetting द्वारा मिश्रण। अधिक जानकारी के निर्माता की पुस्तिका 16 देखें।
    4. Pipet मिश्रण के 3 मिनट के भीतर सेल काउंटर में चैम्बर स्लाइड और जगह स्लाइड गिनती एक सेल में मिश्रण के 10 μl। में ज़ूम और कोशिकाओं ध्यान केंद्रित। PBMC गिनती प्राप्त करने के लिए "गिनती प्रकोष्ठों" दबाएँ।
    5. अशेष, व्यवहार्य है, तोCryovials में वांछित और 3.9.9 कदम करने के लिए जारी रखने के रूप PBMC नंबर, मिली लीटर प्रति 3 लाख कोशिकाओं (एमसी / एमएल) के ऊपर है। कम से कम 3 एम सी / मिलीलीटर प्रत्येक की एकाग्रता में 5 cryovials में स्टोर PBMCs।
    6. व्यवहार्य PBMC संख्या 3 एम सी नीचे है / एमएल, 5 मिलीलीटर से व्यवहार्य एम सी / एमएल गुणा करके कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना। 3 एम सी / मिलीलीटर के साथ कम से कम एक ट्यूब वहाँ हो जाएगा तो 4, 3, 2 या 1 मिलीलीटर से उस नंबर को विभाजित करते हैं।
    7. अपकेंद्रित्र 300 XG (ब्रेक और त्वरण रवाना) पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं / ठंड माध्यम समाधान युक्त शंक्वाकार ट्यूब। Centrifugation के बाद, (4, 3, 2 या 1 मिलीलीटर) ऊपर गणना की मात्रा छोड़ने ठंड मध्यम (सतह पर तैरनेवाला) की उचित मात्रा महाप्राण।
    8. Cryovial / 1 मिलीलीटर पर cryovials (1-4) की उपयुक्त संख्या में शेष सतह पर तैरनेवाला में गोली और विभाज्य कम से कम 3 एम सी / एमएल Resuspend। अंतिम ठंड माध्यम है 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) / 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) / 70% रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 1640।
    9. Documcryovial प्रति कोशिका गिनती ईएनटी। एक नियंत्रित दर ठंड कंटेनर के लिए cryovials स्थानांतरण और cryovials एक cryobox को हस्तांतरित और लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन टैंक (भाप चरण) में रखा जा सकता है, जो समय के बाद कम से कम 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर डाल दिया। दस्तावेज़ फ्रीजर समय शुरू करते हैं।

    • 4. 2 दिन सेटअप

    1. एक गर्मी ब्लॉक में 80 डिग्री सेल्सियस के लिए एक nuclease मुक्त ट्यूब में nuclease मुफ्त 0.1 मिमी EDTA के एक विभाज्य (फिल्टर प्रति 220 μl) गर्मी।
    2. धोने के समाधान के 1 और 2 (एसआई 2 देखें) तैयार करते हैं।

    5. दिन 2: लॉन्ग टर्म नमूना संग्रहण और ल्युकोसैट फ़िल्टर प्रसंस्करण (3 घंटा)

    1. अवलोकन।
      1. फिल्टर करने के लिए ल्यूकोसाइट्स के आवेदन के 6 महीने के भीतर इस प्रक्रिया को पूरा करें।
        नोट: कुल मिलाकर, दिन 2 प्रसंस्करण के बारे में 3 घंटा लेता है और यह लेबल है, जबकि "दिवस 2," महत्वपूर्ण आवश्यकता फिल्टर प्रसंस्करण भाग एक दिन जब पर किया जाना चाहिए यह है किप्रयोगशाला में होने वाली कोई दिन 1 प्रसंस्करण है।
    2. दीर्घकालिक नमूना संग्रहण (15 मिनट)
      1. पहले दिन 1 प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में नए वैक्यूटेनर के वितरण के लिए, हर दिन इस प्रक्रिया को पूरा करें। उचित लेबल cryoboxes में दिन 1 पर नियंत्रित दर ठंड कंटेनरों में हे / एन संग्रहीत किया गया है कि cryovials स्थानांतरण और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन (भाप चरण) के लिए उन्हें वापस। समापन बिंदु assays के लिए ट्रैकिंग नमूना स्थान में तेजी लाने का नमूना प्रकार (उदाहरण के लिए, डीएनए, PBMC, लाल रक्त कोशिकाओं, आदि) के आधार पर cryovials को व्यवस्थित करें।
    3. ल्युकोसैट आरएनए फिल्टर प्रसंस्करण (45 मिनट)।
      नोट: इस प्रक्रिया के बारे में अधिक जानकारी के निर्माता के निर्देशों 17 देखें।
      1. आरटी के लिए फिल्टर लाओ (लगभग 5 मिनट के विगलन)।
      2. म्यान निकालें और फिल्टर से टोपी पेंच। सवार दबाना, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के सवार वापस लेना और फिल्टर का प्रवेश (भड़का अंत) से कनेक्टआरएनए स्थिरीकरण एजेंट को निष्कासित करने के लिए एक जैविक अपशिष्ट कंटेनर में फिल्टर बंदरगाहों से।
      3. एक लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में lysate का संग्रह है, फिल्टर के माध्यम से समाधान निकलवाने के लिए सवार दबाना, आरएनए अलगाव के लिए एक फिनोल और guanidine आइसोथियोसाइनेट समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ एक नया 5 मिलीलीटर सिरिंज लोड और फिल्टर के प्रवेश को देते हैं (भागीदार प्रति 2)।
      4. , सवार वापस लेना, फिल्टर से सिरिंज डिस्कनेक्ट फिल्टर करने के लिए इसे फिर से देते हैं, और एक ही 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में फिल्टर डिस्क में फंस अवशिष्ट नमूना निष्कासित करने के लिए सवार दबाना। फिल्टर और सिरिंज त्यागें।
      5. शंक्वाकार ट्यूब के लिए 800 μl बीसीपी जोड़ें कसकर ट्यूब को बंद करने और सख्ती 30 सेकंड के लिए प्रस्तुत करने का हिला।
      6. 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 2,000 x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
      7. एक नया लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (~ 2.5 एमएल) के लिए जलीय (ऊपर) चरण स्थानांतरण।
      8. Nuclease मुक्त पानी एक की जलीय चरण की 0.5 गुना मात्रा में जोड़ेंअच्छी तरह मिक्स घ। तो 100% इथेनॉल के जलीय मात्रा 1.25x जोड़ सकते हैं और फिर मिश्रण।
        नोट: एक 2.5 मिलीलीटर जलीय मात्रा के लिए, nuclease मुफ्त पानी के 1.25 मिलीलीटर जोड़ने मिश्रण है, तो 4.7 एमएल 100% इथेनॉल (2.5 मिलीलीटर एक्स 0.5 = तो 2.5 मिलीलीटर + 1.25 मिलीलीटर = 3.75 मिलीलीटर नई जलीय मात्रा 1.25 मिलीग्राम nuclease मुफ्त पानी जोड़ने फिर 3.75 मिलीलीटर एक्स 1.25 = 4.7 एमएल 100% इथेनॉल)। यह कदम छोटे आरएनए अंश भी शामिल है कि कुल शाही सेना के अलगाव के लिए अनुमति देता है। अलगाव से छोटे RNAs चूकना के लिए एक विधि का मार्गदर्शन 17 में पाया जा सकता है।
      9. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से सवार निकालें और उसके स्थान पर एक स्पिन कारतूस डालें। एक वैक्यूम कई गुना करने के कारतूस / सिरिंज विधानसभा संलग्न। नीचे के साथ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब काट अंदर वैक्यूम कई गुना करने के लिए एक अधिक सुरक्षित कनेक्शन के लिए, कारतूस / सिरिंज विधानसभा जगह है।
      10. यह कारतूस के माध्यम से खींच लिया है के रूप में ध्यान से अधिक नमूना उनका कहना है, पर वैक्यूम के साथ धीरे-धीरे स्पिन कारतूस करने के लिए कदम 5.3.8 से नमूना लागू करें।
        नोट: कोई वैक्यूम हैवर्तमान, http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf पर centrifugation विधि देखते हैं।
      11. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्पिन कारतूस स्थानांतरण और धो 1. सेंट्रीफ्यूज की स्पिन कारतूस / ट्यूब विधानसभा 5 750 μl जोड़ - 12,000 एक्स जी पर 10 सेकंड।
      12. ट्यूब से छानना त्यागें और एक ही microcentrifuge ट्यूब स्पिन कारतूस वापसी।
      13. 12,000 एक्स जी पर 10 सेकंड - 5 के लिए धो 2 और सेंट्रीफ्यूज की स्पिन कारतूस / ट्यूब 750 μl जोड़ें। कदम 5.3.12 के रूप में छानना त्यागें। एक ही microcentrifuge ट्यूब स्पिन कारतूस लौटें।
      14. कदम 5.3.13 के रूप में धो 2 और centrifugation का एक और 750 μl के साथ दोहराएँ। त्यागें छानना। एक ही microcentrifuge ट्यूब स्पिन कारतूस लौटें। फिल्टर सुखाने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर स्पिन कारतूस / ट्यूब अपकेंद्रित्र।
      15. एक ताजा करने के लिए स्पिन कारतूस स्थानांतरण, 1.5 μl microcentrifuge ट्यूब लेबल।
      16. Nuclease मुक्त 0.1 मिमी EDTA के 200 μl जोड़ें (80 & # करने के लिए छोड़ देते हैंस्पिन कारतूस फिल्टर भागीदार प्रति (2) के केंद्र के लिए सी), 176। 1 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      17. आरएनए elute करने के लिए 12,000 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। छानना को बनाये रखें। स्पिन कारतूस त्यागें।
      18. ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, लेबल में दो, 100 μl aliquots में प्रत्येक 200 μl छानना विभाजित है और बर्फ पर रख। इस बिंदु पर, भागीदार प्रति 2 फिल्टर के साथ शुरू भागीदार प्रति शाही सेना के चार 100 μl aliquots निकलेगा।
    4. DNase उपचार (1 घंटा)
      नोट: इस इलाज पर अधिक जानकारी के निर्माता प्रोटोकॉल 18 देखें।
      1. (त्रुटि pipetting के लिए खाते में) मैं विभाज्य + 1 के प्रति DNase मैं बफर के 10 μl और 2 μl rDNase संयोजन के द्वारा एक मास्टर मिश्रण बनाएं।
        नोट: चार नमूने लिए, 100 μl aliquots के 50 μl DNase मैं बफर + 10 μl rDNase आई उपयोग
      2. अशेष 12 कदम 5.3.18 से शाही सेना aliquots में से प्रत्येक में कदम 5.4.1 में मास्टर मिश्रण के μl और धीरे मिश्रण। 37 पर सेतेएक गर्मी ब्लॉक में 30 मिनट के लिए सी °।
      3. DNase निष्क्रियता अभिकर्मक भंवर और प्रत्येक विभाज्य 11.2 μl जोड़ने के लिए, अच्छी तरह से मिला लें। गर्मी के दौरान 2-3 बार vortexing 2 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      4. 1.5 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
      5. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब सतह पर तैरनेवाला (आरएनए) स्थानांतरण। एक ही प्रतिभागी से aliquots यहां जमा किया जा सकता है।
      6. एकाग्रता लाने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्रत्येक नमूना चलाएँ। शाही सेना के एक गुणवत्ता विश्लेषण एक Bioanalyzer (5.5 कदम देखें) का उपयोग की सिफारिश की है।
      7. के रूप में वांछित cryovials में शाही सेना विभाज्य। एक Bioanalyzer विश्लेषण बाद में विश्लेषण के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में तुरंत, विभाज्य नमूना के 1.5 μl प्रदर्शन नहीं किया जाएगा। सांद्रता और फ्रीजर शुरू समय दस्तावेज़। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने हैं।
    5. Bioanalyzer विश्लेषण (1 घंटा)
      1. निर्माता प्रोटोकॉल 19 का पालन करें। रन पूरा हो गया है, डेटा स्वचालित रूप से संग्रहीत है, लेकिन डब्ल्यू फिर इसे बचाने के लिए हैएक छोटे, अधिक पहचानने योग्य फ़ाइल नाम ith। अपेक्षित परिणाम (चित्रा 3): सीढ़ी नमूने 3 चोटियों (2 ribosomal चोटियों 44 सेकंड और 50 सेकंड में क्रमश: और 25 सेकंड में एक प्रारंभिक मार्कर चरम पर) होना चाहिए, 6 चोटियों होनी चाहिए।

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    Representative Results

    यह समग्र प्रक्रिया जीन माइक्रोएरे और आरटी पीसीआर विश्लेषण के माध्यम से अभिव्यक्ति, epigenetic संशोधनों का पता लगाने, और सेल सबसेट विविधताओं सहित बहाव के अनुप्रयोगों के एक भीड़ में विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता की सामग्री का उत्पादन है कि आवश्यक है। तालिका 1 सामग्री की औसत उपज और गुणवत्ता को इंगित करता है प्रक्रियाओं में से प्रत्येक से। 3 ल्युकोसैट शाही सेना अलगाव और फिल्टर प्रसंस्करण विधियों की गुणवत्ता के उत्पादन का एक उदाहरण प्रदान चित्रा। चित्रा 3 के ऊपरी बाईं ओर छवि केशिका वैद्युतकणसंचलन से उत्पन्न जेल छवि है। प्रत्येक लेन गिरावट का संकेत होता है जो कम से कम ग्रहण के साथ दो अलग बैंड का उत्पादन करना चाहिए। जेल से नीचे chromatograms चोटियों के स्थान और आकार के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है कि गिरावट का स्तर और प्रकार में एक अतिरिक्त नज़र प्रदान करते हैं। (; अपमानित कम) के लिए शाही सेना वफ़ादारी संख्या (Rin) 1 से चलता है कि एक और गुणवत्ता उपाय है10 (उच्च, शुद्ध, अच्छी गुणवत्ता आरएनए)।

    इस तरह के एक उच्च throughput कार्यप्रणाली एक सामयिक त्रुटि के लिए उधार देता है, लेकिन गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों के दौरान कई चौकियों देखते हैं। Ficoll युक्त vacutainer की centrifugation निम्नलिखित 2 दिखाता उचित जुदाई चित्रा। तालिका 2 में संकेत के रूप में एक vacutainer centrifugation गति, कम संग्रह मात्रा या एक उपवास भागीदार के अभाव में एक त्रुटि सहित इस जुदाई प्रदर्शित नहीं हो सकता इसके कई कारण हैं।

    इस प्रक्रिया का उपयोग कर पृथक नमूनों के सबसेट (एन = 100) 11 pyrosequencing द्वारा उन परिणामों का सत्यापन सहित HumanMethylation27 (HM27) डीएनए विश्लेषण BeadChips से सफलता के साथ विश्लेषण किया गया है। जीनोटाइपिंग, bisulfite pyrosequencing निशाना बनाया, और वास्तविक समय आरटी पीसीआर सफलतापूर्वक Wildman और उद्दीन प्रयोगशालाओं 20,21,22,23 में प्रदर्शन किया गया है। सीरम, बराबर में अलग-थलगBeadchip और जीनोटाइपिंग का विश्लेषण करती है, दोनों के लिए डीएनए अलगाव के साथ allel सफलतापूर्वक आईएल -6 और सी-रिएक्टिव प्रोटीन गतिविधि 24 के लिए विश्लेषण किया गया था। पृथक PBMCs से टी सेल सबसेट सफलतापूर्वक 25-28 प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया है। इसके अतिरिक्त, संशोधित ल्युकोसैट प्रक्रिया से शाही सेना वाइड जीन अभिव्यक्ति 29 प्रोफाइलिंग जीनोम के अधीन कर दिया गया है।

    चित्र 2
    Ficoll युक्त vacutainer की centrifugation निम्नलिखित चित्रा 2. परत जुदाई। Centrifugation के बाद कई रक्त घटकों की जुदाई का एक दृश्य। अन्य परतों -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है, जबकि मोनोन्यूक्लियर परत आगे शुद्ध होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


    वर्णित ल्युकोसैट शाही सेना अलगाव और फिल्टर प्रसंस्करण विधियों (प्रोटोकॉल 3.6 और 5.3 देखें) के साथ पृथक शाही सेना अखंडता संख्या (RINs) 8 से ऊपर के साथ 18S और 28S ribosomal शाही सेना का प्रतिनिधित्व करने के लिए दो अलग बैंड प्रदर्शित चित्रा 3. उम्मीद ल्युकोसैट आरएनए प्रसंस्करण से परिणाम है। Bioanalyzer का परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    कुल औसत उपज (N≈500) औसत गुणवत्ता
    सीरम 2.30 मिलीलीटर एन / ए
    पूरे रक्त से डीएनए 39.97 माइक्रोग्राम 260/280 = 1.74 पर absorbance
    PBMC 22,250,000 व्यवहार्य कोशिकाओं समग्र अलगाव के कम से कम 95% व्यवहार्यता पर
    Leukocytes से शाही सेना 44.09 माइक्रोग्राम 260/280 = 2.01 पर absorbance
    आरएनए वफ़ादारी संख्या (Rin) 6.48 =

    तालिका 1. अपेक्षित पैदावार। औसत मात्रा और नमूनों की गुणवत्ता वर्णित विधियों का उपयोग संसाधित।

    समस्या संभावित हल
    Ficoll युक्त vacutainer centrifugation के बाद कोई जुदाई Vacutainer क्षमता से भरा नहीं है - पर्याप्त प्रसंस्करण के लिए न्यूनतम संग्रह मात्रा 6 मिलीग्राम है।
    , सेंट्रीफ्यूज सेटिंग्स की जाँच की गति जी-फोर्स में है सुनिश्चित करें। यदि गलत है, जी-फोर्स और respin करने के लिए निर्धारित किया है।
    कम PBMC सहUNT रक्त की मात्रा भी कम आकर्षित।
    कदम 3.7.8 में गोली के लिए भी बंद aspirated
    गैर-उपवास प्रतिभागी।
    सीरम vacutainer centrifugation के बाद कोई जुदाई , सेंट्रीफ्यूज सेटिंग्स की जाँच की गति जी-फोर्स में है सुनिश्चित करें। यदि गलत है, जी-फोर्स और respin करने के लिए निर्धारित किया है।
    Nanodrop 1000 का उपयोग कर अप्रत्याशित एकाग्रता माप उचित नमूना प्रकार (जैसे, डीएनए या आरएनए) के लिए है सुनिश्चित करें।

    तालिका 2 समस्या निवारण। वर्णित विधि और संभावित समाधानों के साथ सामना करना आम समस्याओं।

    टेबल S1
    पूरक तालिका 1. ट्रैकिंग चादर। Fro वैक्यूटेनर ट्रैकिंग का एक उदाहरणप्रयोगशाला प्रसव के लिए मीटर रक्त संग्रह। इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    टेबल S2
    पूरक तालिका 2. नमूना लॉग। प्रयोगशाला के लिए वितरण पर वैक्यूटेनर के प्रसंस्करण के दस्तावेज़ के लिए इस्तेमाल किया दस्तावेज़ का एक उदाहरण है। इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    टेबल S3
    पूरक तालिका 3. cryovial नंबरिंग प्रणाली। प्रत्येक भागीदार के लिए इस्तेमाल नंबर प्रणाली का एक उदाहरण है। इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    पूरक जानकारी 1. Preprocessing विवरण। स्टडी समन्वयक, कूरियर और Phlebotomist के कर्तव्यों का विवरण। अनुपूरक जानकारी 1 देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा S2
    अनुपूरक सूचना 2. व्यंजनों। आवश्यक अभिकर्मकों के लिए व्यंजनों की एक सूची। अनुपूरक जानकारी 2 को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    हम सफलतापूर्वक डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन में 1600 से अधिक पूरे रक्त के नमूनों की प्रक्रिया को लागू किया गया है कि एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इन तकनीकों के कई मौजूदा साहित्य में उपलब्ध हैं, प्रत्येक चरण के बीच ठीक से समय पर परिवर्तन सहित हमारे कदम-दर-कदम संकलन, सफलतापूर्वक बहाव के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ जैविक नमूनों की एक किस्म पैदा करता है कि एक अनुकूलित, कुशल प्रोटोकॉल को दर्शाता है, डीएनए मेथिलिकरण, mRNA अभिव्यक्ति और रोग प्रतिरोधक विश्लेषण भी शामिल है। इन नमूनों को पहले से ही राष्ट्रीय बैठकों 11,20,21,23,24,29 में सहकर्मी की समीक्षा साहित्य में प्रकाशित और / या प्रस्तुत किया गया है जिसके परिणाम प्रयोगों की एक किस्म में परीक्षण किया गया है। इस प्रोटोकॉल इस प्रकार DNHS के समान जनसंख्या आधारित अध्ययन में जैविक नमूनों को इकट्ठा करने की मांग अन्य जांचकर्ताओं के हित के लिए होना चाहिए।

    इस तरह के एक उच्च throughp में नमूने जब प्रसंस्करणकेन्द्र शासित प्रदेशों के तरीके, यह सभी स्तरों पर सही रिकॉर्ड बनाए रखने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। हम शुरू में cryovial जानकारी के सभी स्टोर करने के लिए एक डाटाबेस तैयार करने की सिफारिश। इस डेटाबेस (बॉक्स के भीतर भंडारण बॉक्स संख्या और स्थान) की मात्रा, एकाग्रता, गुणवत्ता, बारकोड, और भंडारण स्थान सहित प्रत्येक cryovial भीतर नमूना के सभी पहलुओं को शामिल करना चाहिए। हम पूर्व लेबल cryovials और एक बारकोड होते हैं, जो भंडारण बक्से तैयारी सलाह देते हैं। इसके अलावा, हम यह सुविधाजनक प्रत्येक भागीदार (तालिका S3) के लिए विशिष्ट प्रत्येक ट्यूब के लिए बारकोड, युक्त एक 'मास्टर' दस्तावेज़ है करने के लिए मिल गया है। इस नमूने को अनावश्यक / फ्रीज पिघलना चक्र शुरू करने, नमूने के अत्यधिक से निपटने के बिना डेटाबेस में cryovial डेटा के तेजी से इनपुट सक्षम बनाता है और मैन्युअल बारकोड में प्रवेश करने में मानव त्रुटि के लिए क्षमता समाप्त। -150 को तरल नाइट्रोजन -178 का यह लेबल के चरम पर पालन करना भी जरूरी है कि (जैसे, भाप चरणडिग्री सेल्सियस) तापमान। प्रलेखन समय लगता हो सकता है, और होने में कम से कम दो तकनीशियनों प्रक्रियाओं सबसे बड़ी कुशलता का उत्पादन है कि विभाजन वितरण पर कुशल प्रसंस्करण की आवश्यकता के साथ, हमने पाया है।

    इस पद्धति का एक सीमा संग्रह साइट के लिए प्रयोगशाला की निकटता है। विशेष रूप से PBMC अलगाव के लिए, नमूने लाल रक्त कोशिका संदूषण में उल्लेखनीय वृद्धि से बचने के लिए संग्रह के 2 घंटे के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए और व्यवहार्य मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में कम हो जाती है। जैसे, प्रयोगशाला पैदा हो सकता है कि किसी भी यातायात से संबंधित मुद्दों के लिए खाते में एक संग्रह साइट से कोई 30 से अधिक मिनट होना चाहिए। इसके अलावा, का प्रस्ताव किसी भी प्रयोगशाला इष्टतम नमूना प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए हाथ पर दो तकनीशियनों की आवश्यकता होगी यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए। इसके अलावा, प्रत्येक प्रयोगशाला ऊपर उल्लिखित प्रत्येक चरण के लिए अपेक्षित उपकरणों के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रकार, कम स्टाफ और / या सीमित उपकरण डब्ल्यू साथ प्रयोगशालाओंसंभावना इस प्रोटोकॉल का कार्य करने में असमर्थ हो ould।

    इस प्रोटोकॉल का एक लाभ यह सहमति दे व्यक्तियों के घरों में सीधे नमूनों को इकट्ठा करने की क्षमता है। यह आमतौर पर शायद क्योंकि बीमा या परिवहन की कमी के कारण, चिकित्सा सहायता प्राप्त नहीं होता, जो मानसिक या अन्य स्वास्थ्य संबंधी मुद्दों के साथ व्यक्तियों तक पहुंचने के लिए अध्ययन की अनुमति देता है। यह भी समान चलाता अनुभवी है, लेकिन उनके मानसिक स्वास्थ्य के लक्षणों के मामले में अलग है, जो एक ही समुदाय के भीतर रहने वाले प्रभावित और अप्रभावित व्यक्तियों की तुलना में सक्षम बनाता है। इस तरीके से नमूनों को प्राप्त करने के क्षेत्र में phlebotomists की सटीक समय और समन्वय की आवश्यकता है। हमारी प्रयोगशाला हम अध्ययन कर रहे थे समुदाय के भीतर स्थित था, क्योंकि एक phlebotomist आम तौर पर दो-तीन घरों से नमूने इकट्ठा करने और पहले संग्रह की 2 घंटा खिड़की के भीतर प्रयोगशाला के लिए नमूने देने सकता है। क्षमता हमारे नमूना प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण है, और इस तरह के रूप में, हम में कई phlebotomists थाक्षेत्र, सटीक समन्वय के लिए की जरूरत बढ़ रही है। प्रयोगशाला के अलावा 2 घंटा दूरी पर प्रसव के लिए प्रति आठ प्रतिभागियों के साथ कई रक्त प्रसव प्राप्त किया। phlebotomists एक निर्दिष्ट स्थान पर मुलाकात की और केवल एक phlebotomist एक ही बैच के रूप में प्रयोगशाला में नमूनों देने के साथ उनके संग्रह संयुक्त। यहाँ वर्णित विधियों को आसानी से कई अन्य phenotypes और बहाव assays के एक भीड़ में इस्तेमाल किया जा सकता एकत्र जीवविज्ञान नमूनों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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    Disclosures

    लेखक घोषणा करते हैं कि उनकी कोई प्रतियोगी रुचि नहीं है।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Day 1: DNA isolation
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P5493-1L Day 1: PBMC isolation
    5 ¾” Pasteur pipets Fisher 13-678-6A Day 1: PBMC isolation
    Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated Life Technologies 10082147 Day 1: PBMC isolation
    Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-500ml Day 1: PBMC isolation
    RPMI Medium 1640, liquid Invitrogen 11875119 Day 1: PBMC isolation
    0.4% trypan blue stain  Invitrogen T10282 Day 1: PBMC isolation
    Countess Cell Counting Chamber Invitrogen C10283 Day 1: PBMC isolation
    Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer Invitrogen C10281 Day 1: PBMC isolation
    LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit  Ambion 1933 Day 1: Leukocyte RNA isolation
    25 G x 5/8 in. needles Becton Dickinson 305122 Day 1: Leukocyte RNA isolation
    Syringes (5 ml) Becton Dickinson 309646 Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation
    Denaturing Lysis Solution  Ambion 8540G Day 2: Leukocyte RNA isolation
    5 M NaCl Life Technologies 24740011 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    TRI Reagent Ambion 9738 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    Bromo-3-chloro-propane (BCP) Sigma B-9673 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    spin cartridges  Ambion 10051G Day 2: Leukocyte RNA isolation
    0.1 mM EDTA Ambion 9912 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    DNA-free Kit Ambion AM1960 Day 2: DNase treament
    RNA 6000 Ladder  Agilent 5067-1529 Day 2: Bioanalyzer analysis
    RNA 6000 Nano Series II Kit  Agilent 5067-1511 Day 2: Bioanalyzer analysis
    RNaseZAP Ambion AM8782 Day 2: Bioanalyzer analysis
    Ethanol >99% Sigma E7023-500ml
    Isopropanol >99%  Sigma I9516-500ml
    Nuclease-free ultra pure water  Invitrogen 9938
    Pipette tips (nuclease-free) Eppendorf 22491253
    Pipetter (serological) Eppendorf 2223020-4
    Pipetters (for volumes under 1 ml) Eppendorf 3120000-054
    Pipettes (serological) Fisher 13-678-27E
    Controlled rate freezing containers Nalgene 5100-0001
    Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) Fisher 03-395-464
    Test tube rack Thermo Scientific 14-804-134
    15 ml polypropylene tubes Fisher 14-959-49D
    1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes Fisher 07-200-534 and 07-200-185
    2 ml and 5 ml cryovials Fisher 10-500-26 and 10-269-88F 
    8 ml CPT vacutainer BD Biosciences 362761 2 tubes
    6 ml K2 EDTA vacutainer BD Biosciences 367863 2 tubes
    8.5 ml SST vacutainer BD Biosciences 367988 1 tube
    Vortexer Fisher 2215365
    Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes Fisher 11-715-1250
    Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood Fisher 01-257-87
    Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid Eppendorf 22637002
    Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes Eppendorf 22628157 2, one does not need to be refrigerated
    Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device Fisher 13-400-411
    Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies G2940CA
    Liquid nitrogen tank Thermo Scientific 11-676-56
    Sharps container Fisher 22-037-970
    Biological waste container Thermo Scientific 1223P52
    Biosafety Level 2  certified cell culture hood Thermo Scientific 13-261-315

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    References

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    चिकित्सा अंक 105 PBMC अलगाव पूरे रक्त डीएनए अलगाव आरएनए अलगाव समुदाय आधारित अध्ययन गैर नैदानिक ​​सेटिंग
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