एक समुदाय आधारित सेटिंग से प्राप्त नमूनों में रैपिड fractionation और पूरे रक्त घटकों के अलगाव
Summary
We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.
Abstract
एक गैर नैदानिक सेटिंग में संग्रह और पूरे रक्त के नमूनों के प्रसंस्करण के साथ और पहले से मौजूद शर्तों के बिना दोनों समुदाय में रहने वाली व्यक्तियों का मूल्यांकन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। इन नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण कुंजी सेलुलर घटकों की गिरावट से बचने के लिए आवश्यक है। एक साथ परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC), डीएनए के लिए तरीकों यहाँ भी शामिल हैं, आरएनए और प्रसंस्करण के साथ एक महानगरीय क्षेत्र भर में प्रतिभागियों की सहमत के घरों में प्रदर्शन के लिए एक एकल रक्त ड्रा से सीरम अलगाव, संग्रह के 2 घंटे के भीतर शुरू की। हम 1600 से अधिक रक्त नमूनों बाद में सफल डीएनए मेथिलिकरण, जीनोटाइपिंग, जीन अभिव्यक्ति में इस्तेमाल किया और प्रवाह cytometry विश्लेषण करती किया गया है जो उपज संगत, उच्च गुणवत्ता सामग्री, प्रक्रिया के लिए इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है। नियोजित तरीके से कुछ मानक हैं; बताए गए तरीके से संयुक्त हालांकि, जब वे population- और / या समुदाय के प्रतिभागियों से नमूने के कुशल संसाधन को सक्षमसामान्य रूप से एक नैदानिक सेटिंग में मूल्यांकन किया जाना नहीं होता, जो आधारित अध्ययन करता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल आम जनता की अधिक प्रतिनिधि हैं कि (बाद में और डेटा) के नमूने प्राप्त करने की क्षमता है।
Introduction
कई अध्ययनों के साथ और मानसिक (या अन्य) 1-4 बीमारियों के बिना व्यक्तियों के बीच खून में जीन की अभिव्यक्ति, डीएनए मेथिलिकरण और सेल सबसेट में मतभेद की विशेषता है। ये अध्ययन, हालांकि, इस रोग से जुड़े मतभेद के कारण रोगियों के इलाज की मांग कर रहे हैं, जिसके लिए बीमारियों का आम तौर पर और अधिक गंभीर प्रकृति के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसमें नैदानिक सेटिंग से प्राप्त किया गया है। कारण "omics" दृष्टिकोण के क्षेत्र में प्रगति करने के लिए पिछले एक दशक रोग प्रसार की जनसंख्या के आधार पर अनुमान प्रदान करने के क्रम में, समुदाय और / या महामारी विज्ञान सेटिंग्स 5-7 से जीवविज्ञान नमूने प्राप्त करने में रुचि का एक विस्फोट और की एक व्यापक तस्वीर में देखा गया है इन मानसिक और / या शारीरिक बीमारियों के पर्यावरण निर्धारकों।
इस संबंध में एक प्रमुख चुनौती एकत्रित नमूनों के तेजी से प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं, frequentl हैं कि कुंजी प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों की गिरावटY एक व्यक्ति के स्वास्थ्य, संग्रह 8-10 के 2 घंटे के बाद वसूली में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ खून ड्रॉ पर तुरंत शुरू होता है का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया। इस चुनौती से निपटने के लिए, हम मानव पूरे रक्त के कई घटकों को एक साथ एक बड़ा महानगरीय क्षेत्र में रहने वाले विषयों के घरों में प्राप्त नमूनों से अलग कर रहे हैं, जिसमें एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल हमारे संकलन और भविष्य की तकनीक आगे अलगाव के लिए अनुमति घटना में सभी "" अतिरिक्त अंशों की भंडारण सहित वर्तमान तकनीकों के संशोधन पर आधारित है / विश्लेषण करती है। वैकल्पिक तरीकों या किट यहाँ वर्णित व्यक्ति तरीकों, उन रेखांकित की जगह में नियोजित किया जा सकता है, जबकि एक उच्च throughput ढंग से नमूने के प्रसंस्करण के लिए एक विश्वसनीय और कारगर साधन साबित किया है। उच्च गुणवत्ता भिन्न (PBMCs, डीएनए, सीरम, और आरएनए) ताजा खून की 2 दिन (चित्रा 1 के भीतर उपलब्ध हो सकता है 2 संग्रह के मानव संसाधन और सभी परख के लिए तैयार नमूनों के भीतर उत्पादन किया जा सकता)।
इस प्रोटोकॉल समुदाय में रहने वाली, डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन में परीक्षण के लिए डेट्रायट के शहर के वयस्क निवासियों से एकत्र नमूनों की कुशल संसाधन को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-एस 1), एक जनसंख्या आधारित सदमे के बाद तनाव विकार (पीटीएसडी) और अन्य मानसिक बीमारियों के सामाजिक और जैविक निर्धारकों का अध्ययन। डेट्रायट में पीटीएसडी के प्रसार में दो बार राष्ट्रीय औसत 11,12 से अधिक है। इस आबादी में पीटीएसडी के जैविक निर्धारकों की पहचान करना इस शहरी आबादी में, और अन्य उच्च जोखिम आबादी (जैसे, सैन्य दिग्गजों लौटने) दोनों में विकार से पीड़ित लोगों की सहायता के लिए उचित pharmacologic और / या संज्ञानात्मक व्यवहार उपायों को विकसित करने में मदद कर सकता है। पहले से डेट्रॉयट, मिशिगन में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में स्थित हमारी प्रयोगशाला, एक किस्म से ली गई ताजा ऊतकों के नमूनों से निपटने में हमारी विशेषज्ञता के आधार पर प्रसंस्करण के लिए चयनित किया गया थासूत्रों की आवश्यकता संग्रह के 2 घंटे के भीतर नमूने प्रसंस्करण के लिए शुरू करने के लिए, और संग्रह साइटों के लिए हमारी निकटता। हाथ में इस अद्वितीय अवसर के साथ, हमारे लक्ष्य को प्रत्येक नमूना से डीएनए, आरएनए, सीरम और परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) की सबसे बड़ी उपज (नमूना संग्रह के 5 लहरों पर एन = 1639 नमूनों की कुल) के लिए प्रसंस्करण अनुकूलन करने के लिए किया गया था। यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं इस प्रकार माइक्रोएरे, epigenetic, वास्तविक समय आरटी पीसीआर सहित बहाव के अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए सामग्री (औसत पैदावार के लिए 1 टेबल देखें) शुरू करने के उत्पादन, एक गैर नैदानिक सेटिंग में एक साथ प्रदर्शन किया, और विश्लेषण प्रवाह cytometry जा सकता है।
चित्रा 1. कुल मिलाकर काम प्रवाह। यहाँ दर्शाया समग्र प्रक्रिया की सहमत खास पहचान करने से रक्त नमूनों को प्राप्त करने की रसद शामिलरक्त के लिए ipants खुद को आकर्षित। उच्च गुणवत्ता, भिन्न (परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear; PBMCs, डीएनए, सीरम, और आरएनए) ताजा पूरे रक्त का संग्रह के 2 घंटे के भीतर उत्पादन किया जा सकता है और सभी परख के लिए तैयार नमूनों 2 दिनों के भीतर उपलब्ध हो सकता है। नमूने तुरंत परीक्षण किया जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं इसके अलावा, इस पद्धति के माध्यम से तैयार अंशों लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपयुक्त हैं। यहाँ रेखांकित पूरे समय एक ही दिन (~ 5 घंटा कुल) में पूरा किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के एक दिन विशेष रूप से तकनीक के साथ काफी अनुभव के साथ एक एकल तकनीशियन के लिए अत्यंत गहन परिश्रम किया जाएगा। इस प्रकार, हम कम से कम दो तकनीशियनों के बीच दिन 1 पर प्रक्रियाओं को विभाजित और 2 दिवस पर आरएनए प्रसंस्करण को पूरा करने की सिफारिश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सफलतापूर्वक डेट्रायट पड़ोस स्वास्थ्य अध्ययन में 1600 से अधिक पूरे रक्त के नमूनों की प्रक्रिया को लागू किया गया है कि एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इन तकनीकों के कई मौजूदा साहित्य में उप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Henriette Mair-Meijers for invaluable attention to detail and hours devoted to processing the blood collections. We are grateful for the graphic design expertise of Natalie Jameson Kiesling. We also appreciate the approval of the manufacturers (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) mentioned herein to publish the use of their products as described. Funding for this work was generously provided by the National Institutes of Health award numbers DA022720, RC1MH088283, and DA022720-05-S1.
Materials
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2ml and 5ml cryovials and 1.5ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2ml and 5ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125mm vacutainers and 15ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| -80 ˚C freezer | Thermo Scientific | 992RAK | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
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