Abstract
我们报告的径向单层细胞迁移测定法的一个新颖的适应，首次报道以测量粘附的肿瘤细胞的细胞外基质蛋白的径向迁移，用于测量荧光标记，非粘附人或鼠效应免疫细胞的运动性。这种技术采用一个不锈钢歧管和10以及特氟隆滑动灶性沉积非贴壁的T细胞变成制备与任一汇合的肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白的孔中。光和/或多信道荧光显微镜被用于随时间跟踪效应细胞的移动和行为。荧光染料和/或荧光的转基因编码用于差异标记的细胞类型进行成像的病毒载体。这种方法是从类似型的体外测定该跟踪水平或垂直的迁移/侵袭利用滑动室，琼脂或Transwell小板明显。该法允许详细的影像数据，以BË与特定的荧光标记区分不同类型的细胞收集;即使特定的细胞亚群（ 即 ，转导/ nontransduced）可以被监控。使用对应于所述转移的小区类型特定的荧光通道中产生的表面强度的荧光曲线。这允许在特定时间更好的可视化的非粘附免疫细胞迁移的。因此能够收集的其他效应细胞的功能，如细胞毒性或从效应器病毒载体的转移证据到靶细胞，以及。因此，该方法允许研究人员用显微镜记录差异标记的，非粘附的细胞 - 细胞间的相互作用与各种类型的贴壁细胞。这样的信息可以是在生物-操纵或激活免疫细胞类型，其中的功能性的视觉证据期望与肿瘤靶细胞将其用于癌症治疗前的评估特别相关。
Introduction
径向单层细胞迁移测定法最初开发到载玻片上涂覆有细胞外基质（ECM）蛋白5-7或具有单个ECM组分，如纤连蛋白或层粘连蛋白1,2-测量粘附的肿瘤细胞1-4的浸润特性。该技术涉及接种肿瘤细胞的单细胞悬浮液在使用不锈钢细胞沉降支管（CSM）的孔的中心。沉淀后，将肿瘤细胞将附着在井和在初始细胞群随时间的直径的改变的底物用于建立横向运动的速率。径向单层细胞迁移测定法提供了一种视觉优势所采用的transwell板，以测定细胞的体外迁徙功能等现有的方法;这些测定法是非利于成像8。同时，它也是在选择时间点所提供的自由量很大■当迁移评估，对时间点的数量没有限制的研究员能沉淀后，选择图像。
因为迁移的能力是对非贴壁细胞的一个重要的功能，特别是在免疫治疗或者它们可以用作递送载体为病毒载体领域，我们适于使用CSM来评价非粘附细胞的迁移类型对肿瘤细胞单层，除了ECM蛋白。的显微镜可视化上存活的肿瘤细胞单层非粘附细胞的迁移，在复杂的ECM从肿瘤，或单个ECM组分分离的额外的好处，使该测定的通用性。雇用孔涂有单一胞外蛋白分析不准确地反映ECM组织基质或肿瘤的细胞将通过迁移体内 。
这里，我们使用同种异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL），敏感地认识到主要histocomp使用单向混合淋巴细胞肿瘤细胞反应（MLTR）或混合淋巴细胞反应（MLR）9，作为我们的代表性非粘附细胞类型atibility复合体（MHC）蛋白。我们测试了人和鼠源的细胞。当迁移测定肿瘤单层，采用的肿瘤细胞或者部分相关指标，显示一些对用于敏感的效应，还是完全相关的目标，拥有全套MHC分子的细胞群发现了同样的MHC蛋白质的效应已被致敏对。在一些实验中，我们使用了荧光CellTracker红色CMPTX或细胞增殖染料eFluor 670效应细胞和靶细胞之间进行区分。我们还使用转用病毒载体编码荧光蛋白作为可视化细胞的另一种方式。对于某些分析，我们转了alloCTL与逆转录病毒的复制载体（RRV）编码翡翠绿（EMD）荧光蛋白10,11;对于超视距器，肿瘤细胞被转导的慢病毒载体编码mStrawberry。
所述alloCTL被通过歧管的一个通道进入任一肿瘤细胞单层或ECM从肿瘤细胞单层收获的中心接种。粘附和非粘附细胞相互作用显现由光和/或通过在一段时间的荧光显微镜。中断在肿瘤细胞单层在低功率，或肿瘤细胞具有片段化的细胞核在高功率是细胞损伤的由裂解和细胞凋亡的指标，分别。我们创建数字表面强度荧光地图显示非粘附荧光T细胞在单层培养的迁移。我们还注意到毒性集群的形成叠加的非贴壁alloCTL之后主义及其对贴壁胶质瘤细胞单层。同时，观察RRV-EMD从alloCTL到胶质瘤单层水平传导。
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Protocol
1.将准备
- 将细胞沉淀歧管滑入杀菌袋和密封用高压灭菌胶带。面对滑板袋的纸侧，以避免在井中塑料沉积物的特氟隆涂层的一面。
- 高压釜袋15分钟，在121℃。
- 在无菌的150×15毫米的无菌培养皿中取出的幻灯片从生物安全柜和地点内杀菌袋。多达四个幻灯片每盘可以容纳。广场旁边的幻灯片35×10毫米的培养皿。加入2-3毫升无菌H 2澳提供加湿。
- 预涂载玻片用聚-D-赖氨酸，在100微克/毫升用足够体积，以覆盖整个井。 1小时，在室温之后，吸出溶液，并通过移液的1×PBS在孔的表面冲洗井两次的表面上。
- （可选）添加纤维连接蛋白或其他ECM组件，以确保更强的肿瘤细胞的粘附。添加纤维连接蛋白在5微克/毫升足够量塔吨的井不会时间在RT在短时间内干燥。
- 1小时后，吸剩的解决方案，并通过上下吹打与1X PBS洗两次澡。
- 保持PBS的井，直到肿瘤准备电镀。使用滑动的同一天。
- 收获的所需粘附的肿瘤细胞类型的汇合烧瓶中。在适当缓冲的生长培养基，例如计数通过光学显微镜和重悬使用台盼蓝染料排斥的活细胞以5×10 6个细胞/ ml，Dulbecco氏最小基本培养基（DMEM）中，用10％胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺和丙酮酸钠。
- 如果粘附细胞群的荧光成像是期望的，以一个重要的荧光染料或细胞增殖的染料由以下由制造商提供的协议标签的粘附细胞群。
- 顺利吸取10微升完全培养基到滑动照顾的每个孔中，以避免在WEL产生气泡LS，因为这些可以预防均匀肿瘤细胞的粘附。
- 添加2.5-5.0×10 4细胞（5-10微升的细胞悬浮液），以在各孔中（ 图1A）的介质。调整取决于肿瘤细胞类型和生长的天所需的数目的最佳数目。较大的肿瘤细胞或快速成长的细胞可能需要较少的细胞开始。通过加入培养基和吸管上下，以确保均匀分布的细胞带来良好体积多达40微升。
- 毕竟井种子，使肿瘤细胞附着在RT，然后将盖体上的150×15毫米培养皿中并小心地将皿在37℃/ 5％CO 2的加湿培养箱中在至少24小时。
- 每日更换培养基。小心吸取从单层废介质的一部分，并替换为新鲜的完全培养基。
注意：由于蒸发，更容积将需要比取出要添加。井将准备测定时为偶数，confluent层细胞的存在。这通常是初始播种后1-3天。 - 如步骤1.4中所述并继续到步骤2，如果单层需要的话，或以下面的步骤1.13从单层提取ECM蛋白用PBS洗单层轻轻一次。
- 使0.5％的Triton-X（V / V）在完全培养基中的溶液，并添加30微升至每个孔中。让在引擎盖单层消化2分钟，然后用完全培养基通过移液如上所述洗涤两次。
注：细胞外基质层可以是通过光学显微镜（ 图2）可见。使用幻灯片马上，或保持在完全培养基中的加湿的CO 2培养箱中培养1-2天。不要让水井干涸。
2.沉淀非附着性T细胞上的滑动
- 如果所述非粘附细胞群的荧光成像是期望的，标记的非粘附细胞群与重要的荧光染料，如CFSE，细胞追踪红CMPTX或eFluor670按照预先测定的由制造商提供的至少1小时的协议。替代地，操纵细胞以表达由病毒载体编码的荧光蛋白质。
- 如上面1.2中描述的高压釜的细胞沉淀歧管在高压釜中袋。
- 删除包含从孵化器和地方生物安全柜Teflon涂层幻灯片加湿室。
- 移液器向上洗井用1×PBS和向下，然后加入45微升完全培养基中含有至少10％的血清。
- 从消毒信封移除歧管，小心地将在过孔中，直到“钩”在歧管的端部接触的滑动（ 图1B）的底部。
- 确保该培养基是在每一个信道的可见。如果没有看到，起飞歧管，并添加更多的媒体到对应得很好，然后更换并再次检查。
- 每个陈重复步骤2.5歧管的NEL，或尽可能多的水井所需。
- 计数非粘附细胞，并重新悬浮于不低于1.0-2.0×10 5个/微升。制定1微升的细胞并缓慢吸取他们进入通道（ 图1C）。做到这一点的每口井所需。
- 离开，整个电池装载装置中， 即 ，歧管和滑动，生物罩内20-30分钟以使细胞在通道沉降。
- 通过触摸两端并轻轻提起它垂直向上从滑动，以便不打扰灶性接种于孔中（ 图1D）的中心的细胞移除歧管。
- 检查各孔，以确保非粘附细胞已经成功地接种在井停留在歧管通道的圆周内的中心。非粘附细胞将理想地稍微粘附在单层或ECM和对方，因此轻轻移动滑动周围不会导致细胞PELLE吨驱散。不要挤的幻灯片。
3.荧光显微镜
- 通过适当的实验设备，进行拍摄沉淀被确认之后。理想情况下，使用配有CO 2的湿度室中的显微镜。要采取更大的面积的图像在低功率， 即 ，4X或10X，以允许多个图像，使得井的整体可以看出来。
- 获得使用图像捕捉软件的数字图像。执行明和/或多通道荧光成像。
- 如果需要的话，设置了一个时间推移在给定区域，以记录不同频道的图像，或保持在滑动加湿，并在37℃/ 5％CO 2培养箱并手动取出到图像在所需的时间点（ 图1E＆F，建议在较长的时间点）。
4.分析和显示
- 使用图像编辑软件，合并轻，FLuorescent图像转化成1层，使多种细胞类型和标记物可以看出，在相同的图像。拖放图像文件为每个单独的颜色到程序中，出现提示时，选择“添加图层”选项来创建具有多个图层的图像文件。
- 在更高的放大倍率，拿，对齐和缝合跨越以及图像组合在一起数字。通过观察两个图像之间的保守的区域，并覆盖在另一个的顶部的一个图像，直到产生一个完整的画面对准的文件。
- 使用采集软件来确定距离单个细胞迁移收购过程中添加微米酒吧的图像。
- 以确定在不同时间的细胞的迁移，使表面强度荧光地图与图像软件， 即 ImageJ的，量化荧光T细胞聚集或分布在时间。
- 要生成表面图，采取步骤4.1和图层窗口下产生分层图像，取消除对应所需的通道之外的所有图层。例如，如果一个面积希望可视EMD表达，只有“绿色”对应于用于该标记的过滤层应该是可见的。
- 拼合图像并将其保存在识别的文件格式（ 例如 ，.png格式），并加载图像到程序中。要生成曲面图，改变图像类型为8位，根据需要减少背景更改亮度/对比度，并选择“分析/曲面图”选项。通过检查“阴影”，“绘制轴”，“一个多边形每行'和'平滑”复选框中生成图5中的图像。
- 可替代地，采取利用从焦点细胞存半径或直径的测量，在时间零，并比较所述的细胞在最外点在不同的时间。特氟隆孔的直径为6.0毫米。
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Representative Results
对于荧光蛋白编码病毒载体可以除了，或代替，荧光染料可以使用。病毒转导应提前运动检测来进行。既粘附和非粘附的细胞类型可以是差异标记。的协议转导将取决于载体的使用的类型。在这里，我们转导在图3，图5和图6与RRV-EMD至少两天的alloCTL提前使用协议测定的描述12。我们还使用的慢病毒载体，CMV-草莓-IRES-FLUC2，转导的肿瘤细胞以表达mStrawberry红色荧光蛋白（ 图4）。这种转导通过加入载体，以细胞的烧瓶48小时，在这一点上，加入新鲜培养基来实现。使细胞恢复两天，有限稀释后进行，以产生100％的转导的细胞群。
13-06-MG（图3和5）。荧光显微镜显示单元，最初接种井的中心，远离中心迁移随着时间的推移。 4小时（ 图3，白色箭头）很可能反映了由激活的，IL-2的T细胞群13显示出的自分泌生长模式后alloCTL的形成粒料。
在另一个实验中，鼠效应alloCTL通过单向MLR使用单倍型H-2d中的Balb / c脾细胞应答和单倍型H-2B / k的刺激脾细胞从B6C3F1小鼠制成，应变到的TU-2449胶质瘤是同源的。立即通过吨的沟道播种前他总管到肿瘤细胞单层中，alloCTL沾满eFluor 670. alloCTL（紫色细胞）接种到TU-2449胶质瘤细胞（红色），即分别为100％转与CMV-Straw-建立单层中心IRES-FLUC2病毒载体，并镀上井图4A和4B展示在1和48小时拍摄的相同以及同一象限中。显微图像前检测。 图4C和D使用ImageJ转换成数字化的紫色荧光生成的一天强度成显示在三维格式定量表面图。
最后，人类alloCTL分别与来自转移性乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231BR由MLTR的灭活刺激人脑嗜细胞制成; 图6以上的非粘附CMPTX标记alloCTL时间显示光和荧光显微图像，部分地转导RRV-EMD，迁移上提取˚FECM的蛋白质ROM的肿瘤细胞。在（A）沉淀后的明场显微照片显示alloCTL的焦点位置。在（B和F）的明场显微照片表明，在4和8小时，分别alloCTL径向迁移的细胞外基质。与从井的中心的距离的alloCTL密度降低（井的中心是场中的BI左上角）。面板（C和G）秀 沾有CMTPX整个alloCTL制剂;（D和H）示出了alloCTL与RRV-EMD部分转导由小数目的EMD + T细胞所指示的，和（E和I）表示RRV-EMD的合并图像转alloCTL随着未转导alloCTL迁移的细胞外基质。
图2.肿瘤细胞单层和ECM镀上CSM幻灯片井 。滑井的显微照片准备与（A）融合U-87MG胶质瘤细胞单层，或融合U-87MG考马斯亮蓝染色染料提取（B）ECM的蛋白质。酒吧= 200微米。 点击此处查看该图的放大版本。
图3.迁移与RRV-EMD转导的淋巴细胞中在中心的细胞毒性和细胞存时间的推移前缘 。在不同的时间，以便在前缘和alloCTL-RRV-EMD的下列沉降上粘附的U-87MG胶质瘤细胞单层的中心截取的荧光显微照片。效应alloCTL种子为单细胞，形成球状集群内放置4小时（白色箭头）。单荧光标记的CTL迁移从该中心还有一个是时候进展。 24小时后，在贴壁单层空单元的补丁是可见的大概是由于肿瘤靶细胞的细胞溶解alloCTL（破折号内见区）。酒吧= 200微米。 点击此处查看该图的放大版本。
鼠alloCTL与eFluor 670上，在1和48小时示mStrawberry标记胶质瘤细胞染色的图4的径向迁移。同样地井一个象限中的（A）的 1小时和（B）的荧光的沉淀后48小时的荧光显微照片标记的非粘附alloCTL上的TU-2449胶质瘤细胞的一个单层。低功率显微照片反映包含在CSM中的一个象限井（半径3毫米），该区域。在高功率（A和B，插图）异体的CTL（白色箭头）示于接近或与个别肿瘤细胞相关联;之一具有崩解外观零散细胞核和是凋亡。使用ImageJ软件示出的数字化的紫色荧光图像的像素值获得的三维图形格式（C和D）各自的表面强度的荧光的地图，并放置在代表井半径网格为3毫米。酒吧= 500微米。 点击此处查看该图的放大版本。
图5.迁移alloCTL和RRV-EMD从转导alloCTL到肿瘤细胞的水平传播。荧光显微照片串联缝合在一起以覆盖所述使用公图像编辑软件的半径。 RRV-EMD的迁移转alloCTL（白色箭头）示出在U-87MG肿瘤细胞的以下沉降的单层，在0和72小时。肿瘤细胞在单层的RRV-EMD转导也很明显，在72小时之后加入EMD转导alloCTL，说明水平传播感染RRV的从淋巴细胞与肿瘤细胞发生（白框，插图）。酒吧= 200微米。 点击此处查看该图的放大版本。
alloCTL图6径向迁移转导RRV-EMD和沾有CellTracker红CMTPX。细胞沉降到从MDA-MB-231BR细胞来源的ECM提取物。 alloCTL迁移在0,4和8小时的成像由明场光学显微镜（A，B，分别˚F第1列）。荧光所述CMPTX（红色）的香味的图像标记alloCTL（C，G，第2列），则RRV-EMD（绿色）转导alloCTL（D，H，第3栏），和合并的图像（E，I，第4栏）是在4和8小时显示。酒吧= 200微米;酒吧适用于图像CI B所示。 点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
肿瘤细胞中的单个细胞悬浮液移液到特氟隆掩模滑动的孔中。使细胞附着，然后在湿润的5％CO 2，37℃培养箱（ 图1A），形成单分子膜。从单层衍生既定单层或ECM蛋白可收获这些测定（ 图1B）。标记有重要的荧光染料或转导的载体编码的EMD效应T淋巴细胞接种到使用CSM阱的中央。然后非粘附效应T淋巴细胞的迁移上的单层或ECM蛋白随时间的能力进行了评估和量化的光及荧光显微镜。这里，我们评估非粘附效应alloCTL的迁移和细胞毒性上的部分相关的目标的U-87MG胶质瘤细胞单层（ 图3和5）。这些靶细胞，只显示某些人类白细胞抗原（HLA）分子（HLA-A2，B44）上的原始刺激发现，被用来减少将由alloCTL到相关13-06-MG的靶细胞（HLA-A1,2和B44被显示在有效的溶解活性，57）。我们还观察到alloCTL上的ECM从MDA-MB-231BR乳腺肿瘤细胞的单层（ 图6）收获的流动性。该alloCTL通过单向MLTR根据以前出版的9的方法产生的。效应alloCTL收获4-5天单向MLTR后和转导的RRV-GS4-EMD（ 图3和5）或RRV-ACE-EMD（ 图6）10,11。更高转导水平实现了与利用长臂猿白血病病毒包膜比用嗜ACE矢量GS4向量。使用这种径向迁移实验中，我们注意到，这两个转导和nontransduced荧光标记alloCTL不得不迁移能力。我们还表明，他们保留自己的能力被细胞色素经历操作的RRV转导后otoxic。
鼠alloCTL的迁移能力也评估（ 图4）。 alloCTL致敏由TU-2449细胞显示单倍型H-2B / K沾满eFluor 670（紫色），并使用TU-2449转导CMV-秸秆IRES-FLUC2（红色）进行迁移试验。当使用充分相关目标，alloCTL效应细胞的数量较少接种防止肿瘤细胞靶迅速裂解。用1小时为基准，T细胞被主要定位在高密度的井的中心为单细胞悬浮液。在48小时的显微照片显示出T细胞朝向井和alloCTL的聚类的外边缘的广泛迁移是与杀伤肿瘤细胞的容易明白在它们的初始沉积的位点。在TU-2449细胞的增殖证明为mStrawberry的密度比以及标记细胞增加。这是在表面更好地看到已生成的可视化紫色的细胞中的孔中（ 图4，下图）的分布的荧光曲线。 AlloCTL的流动性是非常的好，在48小时相比，1小时基线更加明显。类似什么被认为在利用人alloCTL并胶质瘤细胞的测定法，围绕效应的初始沉积的区域中的肿瘤细胞的清除是明显的，在48小时，这表明对肿瘤靶细胞的裂解。
在该测定中的一个关键步骤是健康单层与'骨架'的ECM随后收获的生长。肿瘤细胞在2.5播种-每孔5.0×10 4个细胞，按照上面的步骤1.9，通常导致了大致即使单层为我们所用的肿瘤细胞类型。我们发现它的关键，以允许肿瘤细胞附着在RT，否则出现在37℃，将推动细胞向孔的中心的对流。井无线的同时，预涂层个聚-D-赖氨酸和/或细胞外基质蛋白，如纤连蛋白或胶原蛋白可以大大增加成功率。此外，我们与这些实验用单层派生的“骨骼”ECM较个别ECM组件（ 即 ，纤维连接蛋白，胶原蛋白），这更可靠的证明更好的成功。它尝试使用非粘附细胞的数目通过沉降支管以沉积以及是重要的，并且如果使用的是纯的细胞类型，人们可能在理论上能够定义一个运动系数与该测定。由于孔体积是小的和中等的一些蒸发时，单层需要用新鲜培养基每天的补充。媒体置换还可以防止有毒乳酸积累的细胞生长和分裂。如果不能培养出健康的单层可导致脱落，从井面的单层或ECM的。
从U-87MG胶质瘤细胞里获得的考马斯亮蓝染色的细胞外基质蛋白根据步骤1.13以上被示为消化用Triton X-100（ 图1B）之后留下的粘合基体层的一个例子视觉NE。 ECM生成从乳腺癌细胞系，MDA-MB-231BR细胞，通常为片状，薄，导致这是更差的粘附，有时从测定期间的滑动解除的ECM层。在ECM的蛋白质坚持幻灯片时，提高肿瘤细胞维持的融合单层消化前1-2天。在整个过程中，维修的周围井的特氟隆密封也很重要。保持低量和最小化特氟隆到的Triton-X100溶液的曝光减轻损害的聚四氟乙烯密封件的完整性。
该协议的一个调整可能是使用三维细胞外基质的OCT包埋的肿瘤组织14节收获的。但是，应该指出的是，从平面博特的距离omed很好地滑动面仅为1毫米;因此，部分超过这个厚度可以通过歧管布置被打乱。另外，一个方法也需要设计一种制造轻微钻孔在组织接受包含非粘附细胞介质的液滴。
是效应T淋巴细胞的良好分散的单细胞悬液的提前沉淀的制剂也势在必行。非贴壁的T细胞轻柔tituration驱散聚集到单个细胞悬浮液加载alloCTL入CSM的频道之前权的一个基本步骤。使用非酶细胞分离缓冲区应在必要时使用。另外，效应淋巴细胞的密度应该是周围1.0 - 2.0×10 5个细胞/微升为沉淀，如在上面步骤2.8中所述。较低的细胞数量，可能会导致不沉淀，而较高的细胞数量可能会导致大量存款，很容易移动时的干扰滑动。此外，还建议，在培养基中的血清浓度至少为10％，以提供正凹凸，减少溢出的可能性的足够的表面张力。
倒置光显微镜，荧光成像能力和4倍或10倍的目标是最适合此法。用于成像的时间点可以根据各个实验的查询和细胞类型来确定。非粘附的CTL特别是从沉淀的中心朝向井的边缘更迅速地对ECM蛋白（4-8小时）比通过细胞单层（12-72小时）迁移。部分的MHC相关靶细胞优选为alloCTL测定以鼓励运动的可视化，并减少前显著迁移可发生在单层的细胞介导的细胞溶解的相关目标;使用低效应子的靶比也减缓了裂解。使用局部匹配的目标可以更好地可视化的RRV的传输到肿瘤细胞。
使用倒置显微镜的能提供多种优点直立范围。一个倒置的范围允许通过加湿室的成像，使得滑动不必受到干扰，同时还保持了细胞的无菌环境。另外，通过腔室成像提供试样和技师之间的屏障，以来自人的组织15工作时，允许粘附至II级生物安全（BSL II）的指导方针。
如果使用的是直立的范围，最高放大率实现而不干扰井的正弯月形是20倍。不幸的是，使用一个盖玻片，或光学镜组件配件到细胞沉淀歧管的，不推荐，因为中断的弯液面通常导致沉淀的非贴壁细胞的整个井的蔓延。成像过长时间可能需要小心加入MEDIUM到每个孔中，以取代该丢失蒸发，尽管这更可能在延时成像至是必需的。
这个协议是从该测量贴壁细胞的水平的细胞迁移中Zigmond庭16,17的方法不同的，它的设计不会允许对非贴壁细胞迁移的可视化。通过在衬底评估朝向趋化梯度横向迁移，例如琼脂其它测定法通常用于研究一种细胞类型18-20的迁移。使用中的CSM的提供对这些方法中的一些优点以及用于测量培养的细胞，如在Boyden小室中或基质胶transwell小板的垂直迁移/侵袭的方法。首先，细胞 - 细胞接触允许通过效应细胞的确定靶效应细胞相互作用和损伤。 alloCTL-RRV-EMD的最初刺激单向MLTR与刺激13-06-MG肿瘤细胞对杂色的溶细胞能力同盟的MHC匹配的U-87MG细胞系是下列沉降明显在单层的在24和72小时的中心（ 图3和5中 ，虚线）。还有，TU-2449细胞的鼠alloCTL的降解是在48小时后的沉淀（ 图4）可见。所述单层冲掉在alloCTL存款的中心，但会发生更缓慢的单层的剩余部分，在与人类细胞21或低的测定法，由于无论对重叠的13-06-MG和U-87MG人类白细胞抗原表达起始效应细胞的数目对于鼠神经胶质瘤。另外，效应器到目标密度被降低的效应alloCTL迁移远离沉淀位点。除了迁移和细胞溶解，此协议可以用于可视化病毒编码荧光蛋白的转移。这里，72小时（ 图5，小图）后转移RRV编码的EMD从alloCTL到肿瘤细胞是明显的。
这种模型的一个限制是，迁移只能在体外 ，这可能不是真正地反射的体内迁移来评估。另一个限制是，趋化因子/趋化因子受体的梯度，不能利用该模型建立的。虽然仍可能发生，并且取决于免疫细胞与ECM或个体的肿瘤细胞的相互作用是什么的那些细胞分泌或表达，这种蠕动屁股AY不会回答是否在非粘附细胞会特异性迁移或远离分离因素的问题。
该测定的一个优点是，以确定是否非粘附细胞群保持迁徙功能如果淋巴细胞有或没有被转导的能力。在我们的例子中，转导的亚群是通过EMD蛋白表达可见的，并且很明显，迁徙功能被维持在这个亚群。更广泛的应用可能是测试各种浓度的药剂或药物，可能会影响非粘附免疫细胞迁移的影响。此外，其他的造血细胞可能被用于移动性在各种基材上，或从正常组织来源的贴壁细胞进行测试。最后，虽然未在这里完成，播种贴壁细胞类型， 即，基质细胞或树突状细胞与肿瘤的组合，可以提供分析反射的体内环境更复杂。
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Acknowledgments
支持由NIH R01 CA121258，R01 CA125244，R01 CA154256，NIH / NCATS UCLA CTSI授权号UL1TR000124，USAMRMC W81XWH-08-1-0734，和琼·S·霍姆斯纪念研究基金的一部分。 MJH和GCO接到琼S.福尔摩斯纪念博士后奖学金，在加州大学洛杉矶分校的支持。 CSM的装置是由创新科学方法获得：www.creative-sci.com。慢病毒载体是从加州大学洛杉矶分校矢量的核心，这是支持CURE / P30 DK041301收到。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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