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Immunology and Infection

रेडियल गतिशीलता और रेट्रोवायरल नकल वेक्टर transduced, गैर-पक्षपाती Alloresponsive टी lymphocytes की साइटोटोक्सिक समारोह

Published: February 11, 2015 doi: 10.3791/52416
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1,2, 1,4,5, 3,5, 1,4,5
1Department of Neurosurgery, UCLA David Geffen School of Medicine, 2Department of Molecular and Medical Pharmacology, UCLA David Geffen School of Medicine, 3Department of Medicine, UCLA David Geffen School of Medicine, 4Brain Research Institute, UCLA David Geffen School of Medicine, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA David Geffen School of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

हम पहले fluorescently लेबल, गैर पक्षपाती मानव या murine प्रेरक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता को मापने के लिए, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन पर पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं के रेडियल प्रवास को मापने के लिए सूचना दी, रेडियल Monolayer सेल प्रवास परख के एक उपन्यास अनुकूलन रिपोर्ट। इस तकनीक को एक स्टेनलेस स्टील कई गुना और 10 अच्छी तरह से Teflon स्लाइड focally मिला हुआ ट्यूमर सेल monolayers या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ या तो तैयार कुओं में गैर पक्षपाती टी कोशिकाओं जमा करने के लिए कार्यरत हैं। लाइट और / या मल्टी चैनल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी समय के साथ प्रेरक कोशिकाओं के आंदोलन और व्यवहार पर नज़र रखने के लिए किया जाता है। फ्लोरोसेंट रंजक और / या फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन के लिए कोड विभिन्न इमेजिंग के लिए सेल प्रकार लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है कि वायरल वैक्टर। इस विधि स्लाइड कक्षों, अगर या transwell प्लेटों का उपयोग क्षैतिज या खड़ी माइग्रेशन / आक्रमण कि ट्रैक विट्रो assays में भी इसी प्रकार से अलग है। परख विस्तृत इमेजिंग डेटा ख के लिए अनुमति देता हैविशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों द्वारा प्रतिष्ठित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ एकत्र ई; कोशिकाओं के भी विशिष्ट उप-जनसंख्या (यानी, nontransduced / transduced) पर नजर रखी जा सकती है। भूतल तीव्रता प्रतिदीप्ति भूखंडों पलायन सेल प्रकार के अनुरूप है कि विशिष्ट प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। इस विशिष्ट समय में गैर-पक्षपाती प्रतिरक्षा सेल गतिशीलता के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह रूप में अच्छी तरह से, कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इस तरह के cytotoxicity या प्रेरक से वायरल वैक्टर के हस्तांतरण के रूप में अन्य प्रेरक सेल काम करता है, के सबूत इकट्ठा करने के लिए संभव है। इस प्रकार, विधि शोधकर्ताओं microscopically विभिन्न प्रकार के पक्षपाती कोशिकाओं के साथ विभिन्न लेबल, गैर पक्षपाती की सेल करने वाली सेल बातचीत करने के लिए दस्तावेज़ की अनुमति देता है। इस तरह की सूचना कार्यक्षमता का दृश्य सबूत कैंसर के उपचार के लिए उनके उपयोग से पहले ट्यूमर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ वांछित है जहां जैविक रूप से छेड़छाड़ या सक्रिय प्रतिरक्षा सेल प्रकार के मूल्यांकन में विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है।

Introduction

रेडियल Monolayer सेल प्रवास परख मूल रूप से बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन 5-7 से या ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन या laminin के 1,2 के रूप में व्यक्तिगत ईसीएम घटकों के साथ लेपित स्लाइड्स पर पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं को 1-4 की infiltrative गुणों को मापने के लिए विकसित किया गया था। तकनीक एक स्टेनलेस स्टील सेल अवसादन कई गुना (सीएसएम) का उपयोग कुओं के केंद्र में ट्यूमर कोशिकाओं के एक एकल कोशिका निलंबन बोने शामिल किया गया। अवसादन के बाद, ट्यूमर कोशिकाओं क्षैतिज गतिशीलता की दर से स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अच्छी तरह से और समय के साथ प्रारंभिक सेल की आबादी के व्यास में परिवर्तन के नीचे का पालन करना होगा। रेडियल Monolayer सेल प्रवास परख कोशिकाओं की इन विट्रो प्रवासी क्षमताओं परख transwell प्लेटें कार्यरत कि अन्य मौजूदा तरीकों पर एक दृश्य लाभ प्रदान की; इन assays इमेजिंग से 8 गैर अनुकूल हैं। साथ ही, यह भी timepoint चुनने में स्वतंत्रता की एक बड़ी राशि प्रदान कीप्रवास, मूल्यांकन किया है timepoints की संख्या पर कोई सीमा के साथ एक शोधकर्ता अवसादन के बाद छवि के लिए चुन सकता है जब है।

विस्थापित करने की क्षमता विशेष रूप से वे वायरल वैक्टर के लिए प्रसव के वाहन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रतिरक्षा चिकित्सा या जहां के क्षेत्र में, गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण कार्यक्षमता है, क्योंकि हम गैर-पक्षपाती सेल के पलायन का मूल्यांकन करने के सीएसएम के उपयोग के लिए अनुकूलित ट्यूमर सेल monolayers पर प्रकार, ईसीएम प्रोटीन के अलावा। Microscopically, या अलग-अलग ईसीएम घटकों पर ट्यूमर से अलग जटिल ईसीएम पर, व्यवहार्य ट्यूमर सेल monolayers पर गैर पक्षपाती कोशिकाओं के प्रवास visualizing का जोड़ा लाभ इस परख बहुमुखी बनाता है। एक भी कोशिकी प्रोटीन के साथ लेपित कुओं कि रोजगार assays सही रूप में कोशिकाओं vivo में के माध्यम से विस्थापित होता ईसीएम ऊतक सब्सट्रेट या ट्यूमर को प्रतिबिंबित नहीं करते।

यहाँ, हम प्रमुख histocomp को अवगत alloreactive साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (alloCTL), प्रयोगहमारे प्रतिनिधि गैर पक्षपाती सेल प्रकार के रूप में, एक तरह से मिश्रित लिम्फोसाइट ट्यूमर सेल प्रतिक्रियाओं (MLTR) या मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं (एमएलआर) 9 का उपयोग कर atibility परिसर (एमएचसी) प्रोटीन। हम दोनों मानव और murine मूल की कोशिकाओं का परीक्षण किया। माइग्रेशन ट्यूमर monolayers पर मापा गया था, नियोजित ट्यूमर कोशिकाओं को या तो आंशिक रूप से प्रासंगिक लक्ष्य एमएचसी अणुओं का एक पूरा सेट के साथ प्रभावोत्पादक, या पूरी तरह से प्रासंगिक लक्ष्य, संवेदनशील बनाने के लिए प्रयोग किया जाता सेल की आबादी पर पाया वही एमएचसी प्रोटीन के कुछ प्रदर्शित किया गया है कि प्रभावोत्पादक की ओर अवगत कर दिया गया था। कुछ प्रयोगों में, हम प्रेरक और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए फ्लोरोसेंट CellTracker लाल CMPTX या सेल प्रसार डाई eFluor 670 का इस्तेमाल किया। हम यह भी कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक अतिरिक्त मार्ग के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए वायरल वैक्टर एन्कोडिंग के साथ पारगमन का इस्तेमाल किया। कुछ assays के लिए, हम पन्ना ग्रीन (ईएमडी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन 10,11 के लिए कोडिंग रेट्रोवायरल नकल वैक्टर (RRV) के साथ alloCTL transduced; अन्य संगठनों के लिएनेताओं, ट्यूमर कोशिकाओं mStrawberry के लिए कोडिंग lentiviral वैक्टर के साथ transduced थे।

alloCTL ट्यूमर सेल monolayers से काटा ट्यूमर सेल monolayers या ईसीएम या तो केंद्र में कई गुना का एक चैनल के माध्यम से वरीयता प्राप्त थे। पक्षपाती और गैर पक्षपाती सेल बातचीत प्रकाश द्वारा और / या समय के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना थे। उच्च शक्ति में खंडित नाभिक के साथ कम बिजली में ट्यूमर सेल monolayer में व्यवधान, या ट्यूमर कोशिकाओं को क्रमश: सेल और apoptosis द्वारा सेल चोट के संकेतक थे। हम डिजिटल monolayer संस्कृतियों से अधिक गैर-पक्षपाती fluorescing टी कोशिकाओं के प्रवास दिखा सतह तीव्रता फ्लोरोसेंट नक्शे बनाया। हम यह भी cytotoxicity मढ़ा गैर पक्षपाती alloCTL के समूह गठन के बाद पक्षपाती तंत्रिकाबंधार्बुद सेल monolayer को engendered का उल्लेख किया। साथ ही, तंत्रिकाबंधार्बुद monolayer के लिए alloCTL से RRV-ईएमडी की क्षैतिज पारगमन मनाया गया।

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Protocol

1. स्लाइड तैयार

  1. नसबंदी के पाउच में सेल अवसादन कई गुना स्लाइड डालें और आटोक्लेव टेप के साथ सील। थैली के कागज-पक्ष कुओं पर प्लास्टिक जमाओं से बचने के लिए स्लाइड की Teflon लेपित पक्ष का सामना।
  2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव पाउच।
  3. एक बाँझ 150 x 15 मिमी बाँझ पेट्री डिश में एक जैव सुरक्षा कैबिनेट और जगह के अंदर नसबंदी थैली से स्लाइड निकालें। चार स्लाइड अप करने के लिए पकवान प्रति फिट कर सकते हैं। स्लाइड्स के बगल में एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश रखें। आर्द्रीकरण प्रदान करने के लिए बाँझ एच 2 ओ के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. अच्छी तरह से पूरे कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग करके 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर पाली डी lysine के साथ प्री-कोट स्लाइड। आरटी पर एक घंटा के बाद, समाधान aspirate और कुओं की सतह पर 1x पीबीएस pipetting द्वारा अच्छी तरह से दो बार की सतह कुल्ला।
  5. वैकल्पिक रूप से, मजबूत ट्यूमर सेल पालन सुनिश्चित करने के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन या अन्य ईसीएम घटकों को जोड़ने। पर्याप्त मात्रा में था 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर फ़ाइब्रोनेक्टिन जोड़ेंकुओं टी आरटी पर समय की एक छोटी अवधि के भीतर नहीं सूख जाएगा।
    1. 1 घंटे बाद, बचे हुए समाधान aspirate और 1x पीबीएस के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा दो बार धो लें।
  6. ट्यूमर चढ़ाना के लिए तैयार है जब तक कुओं पर पीबीएस रखें। उपयोग उसी दिन स्लाइड।
  7. वांछित पक्षपाती ट्यूमर सेल प्रकार का एक मिला हुआ फ्लास्क हार्वेस्ट। पर्याप्त रूप से बफर मध्यम विकास के लिए उदाहरण में 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी और resuspend द्वारा Trypan ब्लू डाई बहिष्कार का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना, है Dulbecco न्यूनतम आवश्यक मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ (DMEM) (एफ बी एस), एल glutamine और सोडियम पाइरूवेट।
  8. पक्षपाती सेल की आबादी का फ्लोरोसेंट इमेजिंग वांछित है, एक महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक या निर्माता द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल का पालन करके एक सेल प्रसार डाई के साथ पक्षपाती सेल आबादी लेबल।
  9. सुचारू रूप से wel के में बुलबुले बनाने से बचने के लिए स्लाइड देखभाल के प्रत्येक कुएं में पूरा माध्यम के 10 μl पिपेटरास, इन के रूप में वर्दी ट्यूमर सेल पालन रोका जा सकता है।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए) में मध्यम करने के लिए 2.5-5.0 10 x 4 कोशिकाओं (सेल निलंबन की 5-10 μl) जोड़ें। ट्यूमर कोशिका प्रकार और वांछित वृद्धि के दिनों की संख्या के आधार पर इष्टतम संख्या को समायोजित करें। बड़ा ट्यूमर कोशिकाओं या तेजी से बढ़ कोशिकाओं शुरू में कम कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है। कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे मध्यम और पिपेट जोड़कर 40 μl अप करने के लिए अच्छी तरह से मात्रा लाओ।
  11. सभी कुओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं के बाद, ट्यूमर कोशिकाओं तो, आरटी पर पालन जगह ढक्कन 150 x 15 मिमी पेट्री डिश पर और ध्यान से कम से कम 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में पकवान ले जाने के लिए अनुमति देते हैं।
  12. दैनिक संस्कृति के माध्यम से बदलें। ध्यान से monolayer से बिताया मध्यम के एक हिस्से पिपेट और ताजा पूरा मध्यम के साथ बदलें।
    नोट: वाष्पीकरण की वजह से, अधिक मात्रा में बाहर ले जाया गया था, से जोड़ा जा करने की आवश्यकता होगी। वेल्स परख के लिए तैयार हो जाएगा जब एक भी, conflकोशिकाओं के uent परत मौजूद है। यह 1-3 दिनों के प्रारंभिक बोने के बाद आमतौर पर है।
  13. कदम 1.4 में वर्णित है और monolayers के वांछित हैं अगर दो कदम आगे बढ़ना है, या monolayer से ईसीएम प्रोटीन निकालने के लिए नीचे दिए गए 1.13 कदम करने के रूप में या तो पीबीएस के साथ धीरे एक बार monolayer धो लें।
  14. पूरा मध्यम में एक 0.5% ट्राइटन X (वी / वी) समाधान करें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 30 μl जोड़ें। Monolayer, फिर 2 मिनट के लिए हुड में पचाने रूप में ऊपर वर्णित pipetting द्वारा पूरा मध्यम के साथ दो बार धो दें।
    नोट: ईसीएम परत प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा दिखाई जा सकती है। सही दूर स्लाइड्स का प्रयोग करें, या 1-2 दिनों के लिए humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में पूरा मध्यम में रहते हैं। कुओं बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें।

स्लाइड पर गैर-पक्षपाती टी कोशिकाओं की 2. अवसादन

  1. गैर पक्षपाती सेल की आबादी का फ्लोरोसेंट इमेजिंग वांछित है, ऐसे CFSE, सेल ट्रैकर लाल CMPTX, या eFluor के रूप में एक महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट डाई के साथ गैर-पक्षपाती सेल आबादी, लेबलपरख के अग्रिम में निर्माता को कम से कम एक घंटा द्वारा प्रदान की गई प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 670। वैकल्पिक रूप से, वायरल वैक्टर द्वारा इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं में हेरफेर।
  2. इसके बाद के संस्करण 1.2 में वर्णित के रूप में एक आटोक्लेव थैली में सेल अवसादन कई गुना आटोक्लेव।
  3. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में इनक्यूबेटर और जगह से Teflon लेपित स्लाइड्स युक्त humidified कक्ष निकालें।
  4. ऊपर pipetting द्वारा 1x पीबीएस के साथ कुओं धो और नीचे है, तो कम से कम 10% सीरम युक्त पूरा मध्यम के 45 μl जोड़ें।
  5. नसबंदी लिफाफा से कई गुना निकालें और ध्यान से स्लाइड (चित्रा 1 बी) के नीचे से छू कई गुना के अंत में 'हुक' जब तक कुओं ओवर में स्लाइड।
  6. संस्कृति के माध्यम चैनलों में से प्रत्येक में दिख रहा है कि सुनिश्चित करें। कोई भी देखा जाता है, तो कई गुना दूर ले और अच्छी तरह से इसी के लिए और अधिक मध्यम जोड़ने, तो जगह है और फिर से जाँच करें।
  7. प्रत्येक चान के लिए दोहराएँ कदम 2.5नेल कई गुना की, या के रूप में कई कुओं के लिए वांछित के रूप में।
  8. कोई कम से कम / 5 10 एक्स 1.0-2.0 से μl में गैर पक्षपाती कोशिकाओं और resuspend गणना। कोशिकाओं के एक μl ड्रा और धीरे धीरे चैनल (चित्रा 1C) में उन्हें विंदुक। अच्छी तरह से वांछित प्रत्येक के लिए यह करो।
  9. चैनल में कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए 20-30 मिनट के लिए जैव-हुड के अंदर यानी, कई गुना और स्लाइड पूरे सेल भरी हुई तंत्र,, छोड़ दो।
  10. Focally कुओं (चित्रा -1) के केंद्र में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को परेशान नहीं करने के लिए इतनी के रूप में स्लाइड से सीधे ऊपर उठाने धीरे दोनों सिरों को छू और से कई गुना निकालें।
  11. गैर पक्षपाती कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अच्छी तरह से कई गुना चैनल की परिधि के भीतर रहने के केंद्र में वरीयता प्राप्त किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक का निरीक्षण किया। गैर पक्षपाती कोशिकाओं आदर्श रूप से थोड़ा इसलिए धीरे सेल पेले के कारण नहीं होगा चारों ओर स्लाइड चलती है, monolayer या ईसीएम करने के लिए और एक दूसरे का पालन करना होगाटी फैलाने के लिए। स्लाइड झटका मत करो।

3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. अवसादन की पुष्टि की है के बाद उचित प्रायोगिक उपकरण के साथ, इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं। आदर्श रूप में, एक सीओ 2 और आर्द्रता चैम्बर के साथ सुसज्जित है कि एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। अच्छी तरह से की संपूर्णता में देखा जा सकता है कि इतनी एकाधिक छवियों के लिए अनुमति देने के लिए कम बिजली, यानी, 4X या 10X, पर छवि एक बड़े क्षेत्र के लिए ले जाया जा सके।
  2. छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिजिटल छवियों मोल। Brightfield और / या मल्टी चैनल प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन।
  3. अगर वांछित, एक दिए गए क्षेत्र से अधिक विभिन्न चैनलों में छवियों को रिकार्ड, या humidified स्लाइड रखने के लिए और एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में और स्वयं (वांछित समय बिंदुओं पर छवि के लिए चित्र लेने के लिए बाहर एक समय चूक की स्थापना अब समय बिंदुओं के लिए सिफारिश की 1E एंड एफ)।

4. विश्लेषण और प्रदर्शन

  1. छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग, प्रकाश और फ्लोरिडा विलयएक परत तो कई प्रकार की कोशिकाओं और मार्कर में uorescent छवियों को एक ही छवि में देखा जा सकता है। खींचें और प्रत्येक व्यक्ति के कार्यक्रम में रंग और, जब प्रेरित, कई परतों के साथ एक छवि फ़ाइल बनाने के लिए 'लेयर जोड़ें' विकल्प का चयन करने के लिए छवि फ़ाइलों को छोड़।
    1. उच्च बढ़ाई, ले संरेखित, और डिजिटल एक साथ अच्छी तरह से भर छवियों सिलाई। दो छवियों के बीच संरक्षित क्षेत्रों में देख रहे हैं और एक पूरी तस्वीर उत्पन्न होता है जब तक दूसरे के शीर्ष पर एक छवि overlaying द्वारा फाइलों संरेखित करें।
  2. व्यक्ति की कोशिकाओं में चले गए हैं दूरी तय करने के लिए कब्जा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहण के दौरान छवियों माइक्रोन सलाखों जोड़ें।
  3. , विभिन्न समय पर सेल प्रवास का निर्धारण फ्लोरोसेंट टी सेल एकत्रीकरण या समय के साथ फैल यों, यानी छवि सॉफ्टवेयर, ImageJ के साथ सतह तीव्रता प्रतिदीप्ति नक्शे बनाने के लिए।
    1. , सतह भूखंडों उत्पन्न कदम 4.1 में और परतें खिड़की के नीचे उत्पन्न एक स्तरित छवि लेने के लिए,वांछित चैनल के लिए इसी लोगों को छोड़कर सभी परतों अचयनित। एक सतह साजिश ईएमडी अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए वांछित है अगर उदाहरण के लिए, इस मार्कर के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर करने के लिए इसी केवल 'हरी' परतें दिखाई जानी चाहिए।
    2. छवि को समतल और कार्यक्रम में छवि (जैसे, .png) से मान्यता प्राप्त एक फ़ाइल स्वरूप में इसे बचाने और लोड। सतह साजिश उत्पन्न करने के लिए, 8 बिट करने के लिए छवि प्रकार बदल पृष्ठभूमि को कम करने की जरूरत के रूप में चमक / विपरीत बदलने के लिए, और '/ भूतल प्लॉट का विश्लेषण करें' विकल्प का चयन करें। चित्रा 5 में छवियों को 'छाया', 'एक्सिस ड्रा', 'एक बहुभुज प्रति लाइन', और 'चिकनी' चेक बॉक्स की जाँच करके उत्पन्न किया गया।
    3. वैकल्पिक रूप से, बार शून्य पर फोकल सेल जमा से त्रिज्या या व्यास का उपयोग कर माप लेने के लिए और अलग अलग समय पर सबसे बाहरी बिंदु पर कोशिकाओं की तुलना करें। Teflon के कुओं का व्यास 6.0 मिमी है।

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Representative Results

फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग वायरल वैक्टर, या बजाय फ्लोरोसेंट रंजक, के लिए इसके अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है। वायरल पारगमन गतिशीलता परख के अग्रिम में किया जाना चाहिए। दोनों पक्षपाती और गैर पक्षपाती सेल प्रकार के विभिन्न लेबल हो सकता है। पारगमन के लिए प्रोटोकॉल कार्यरत वेक्टर के प्रकार पर निर्भर करेगा। यहाँ, हम 12 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग परख के अग्रिम में आंकड़े RRV-ईएमडी के साथ 3, 5 और 6 में कम से कम दो दिनों में alloCTL transduced। हम यह भी mStrawberry लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 4) को व्यक्त करने के ट्यूमर कोशिकाओं transduce करने के लिए, एक lentiviral वेक्टर, सीएमवी-स्ट्राबेरी-IRES-FLUC2 इस्तेमाल किया। इस पारगमन बिंदु, ताजा माध्यम जोड़ा गया है, जिस पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं की कुप्पी, वेक्टर जोड़कर पूरा किया गया था। कमजोर पड़ने सीमित कोशिकाओं दो दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति के बाद 100% transduced कोशिकाओं की आबादी उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन किया था।

(आंकड़े 3 और 5)। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शुरू में अच्छी तरह के केंद्र में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं, समय के साथ दूर केंद्र से विस्थापित पता चलता है। alloCTL के गठन के चार घंटा (चित्रा 3, सफेद तीर) सक्रिय, टी सेल आबादी 13 आईएल -2 उत्पादक द्वारा प्रदर्शित autocrine विकास पैटर्न की संभावना को प्रतिबिंबित करता है के बाद समुच्चय।

एक अन्य प्रयोग में, murine प्रेरक alloCTL, B6C3F1 चूहों से haplotype एच 2 डी / Balb सी प्रत्युत्तर splenocytes और haplotype एच -2 बी / कश्मीर उत्तेजक splenocytes का उपयोग कर एक तरह से एमएलआर द्वारा टीयू-2449 तंत्रिकाबंधार्बुद syngeneic है जो करने के लिए तनाव किए गए थे। इसके तत्काल बाद टी के चैनल के माध्यम से बोने से पहलेवह ट्यूमर सेल monolayer पर कई गुना, alloCTL eFluor 670. alloCTL (बैंगनी कोशिकाओं) के साथ दाग थे 100% सीएमवी-Straw- साथ transduced थे कि टीयू-2449 तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं (लाल) की स्थापना की monolayers के केंद्र में वरीयता प्राप्त कर रहे थे IRES-FLUC2 वायरल वेक्टर, और कुओं पर चढ़ाया चित्रा 4C और डी डिजीटल बैंगनी प्रतिदीप्ति कन्वर्ट करने के लिए ImageJ का उपयोग उत्पन्न किया गया पहले परख। एक और 48 घंटा में एक ही अच्छी तरह का एक ही वृत्त का चतुर्थ भाग लिया। चित्रा -4 ए और बी शो सूक्ष्म छवियों दिन तीन आयामी स्वरूप में प्रदर्शित कर रहे हैं कि मात्रात्मक सतह भूखंडों में तीव्रता।

अंत में, मानव alloCTL MLTR द्वारा मेटास्टैटिक स्तन ट्यूमर सेल लाइन एमडीए MB-231BR से निकाली गई निष्क्रिय उत्तेजक मानव मस्तिष्क रेखा कोशिकाओं के साथ किए गए थे। आंशिक रूप से, गैर पक्षपाती CMPTX लेबल alloCTL के समय के साथ प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों से पता चलता है 6 आंकड़ा , RRV-ईएमडी के साथ transduced च निकाले ईसीएम प्रोटीन पर पलायनउन ट्यूमर कोशिकाओं रोम। (ए) में उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ तुरंत अवसादन के बाद alloCTL का केन्द्र नियुक्ति से पता चलता है। (बी और एफ) में उज्ज्वल क्षेत्र photomicrographs 4 और 8 घंटा में, क्रमशः alloCTL त्रिज्यात ईसीएम पर पलायन, दिखाते हैं। alloCTL घनत्व अच्छी तरह के केन्द्र से दूरी के साथ कम हो जाती है (अच्छी तरह से केंद्र द्विपक्षीय में क्षेत्र के ऊपरी बाएँ कोने है)। पैनल (C और D) शो CMTPX के साथ दाग पूरी alloCTL तैयारी, (घ और एच) (ई और मैं) ईएमडी + टी कोशिकाओं की कम संख्या से संकेत के रूप RRV-ईएमडी के साथ alloCTL के आंशिक पारगमन दिखाने के लिए, और RRV-ईएमडी के विलय छवियों को दिखाने alloCTL transduced untransduced alloCTL के साथ ईसीएम पर पलायन।

चित्र 1
सेल अवसादन प्रक्रिया। (ए) वेल्स, (बी) के एक स्लाइड पर रखा एक सेल अवसादन कई गुना, (सी) गैर पक्षपाती प्रेरक लिम्फोसाइटों कई गुना में लोड किया जा रहा है, अवसादन के लिए तैयार किया जा रहा (डी) मैनुअल हटाने सेल अवसादन कई गुना, (ई) एक आर्द्रता चैम्बर, (एफ) humidified इनक्यूबेटर में रखा जा रहा है स्लाइड। यह आंकड़ा क्रिएटिव वैज्ञानिक (http://www.creative-sci.com/) से कॉपीराइट अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ट्यूमर सेल monolayers और ईसीएम सीएसएम स्लाइड कुओं पर चढ़ाया। स्लाइड कुओं की photomicrographs तैयारCoomassie नीले रंग के साथ दाग मिला हुआ यू-87MG से निकाले (ए) मिला हुआ यू-87MG तंत्रिकाबंधार्बुद सेल monolayers, या (ख) ईसीएम प्रोटीन के साथ। बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रवासन और केंद्र में RRV-ईएमडी transduced लिम्फोसाइटों के cytotoxicity और समय के साथ सेल जमा की अग्रणी बढ़त मिली है। अग्रणी धार पर और पक्षपाती यू-87MG तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं की एक monolayer पर अवसादन निम्नलिखित alloCTL-RRV-ईएमडी के केंद्र में विभिन्न समय पर लिया फ्लोरोसेंट photomicrographs। एकल कक्षों, नियुक्ति के 4 घंटा (सफेद तीर) के भीतर गोलाकार समूहों फार्म के रूप में प्रेरक alloCTL वरीयता प्राप्त। एकल fluorescently लेबल सीटीएल अच्छी तरह से एक के केंद्र से चले गएएस समय की प्रगति। 24 घंटे के बाद, पक्षपाती monolayer में खाली सेल पैच संभवतः ट्यूमर लक्ष्य कोशिकाओं के alloCTL cytolysis (डैश के भीतर क्षेत्र देखें) की वजह से दिखाई दे रहे हैं। बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एक और 48 घंटा में दिखाया mStrawberry लेबल तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं पर eFluor 670 के साथ दाग murine alloCTL चित्रा 4. रेडियल माइग्रेशन। (ए) एक घंटा और (बी) fluorescently की अवसादन के बाद 48 घंटे में एक ही अच्छी तरह से एक वृत्त का चतुर्थ भाग की फ्लोरोसेंट photomicrographs टीयू-2449 तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं की एक monolayer पर गैर पक्षपाती alloCTL -labeled। कम बिजली photomicrographs एक सीएसएम के वृत्त का चतुर्थ भाग अच्छी तरह से (त्रिज्या 3 मिमी) के भीतर निहित क्षेत्र को दर्शाते हैं। उच्च शक्ति (ए और बी, insets) allo परसीटीएल (सफेद तीर) के लिए निकटता में दिखाया गया है या व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं के साथ जुड़े रहे हैं; एक खंडित नाभिक के साथ एक विघटित रूप दिया है और apoptotic है। (सी और डी) संबंधित सतह तीव्रता प्रतिदीप्ति नक्शे तीन आयामी ग्राफिक रूप में डिजीटल बैंगनी फ्लोरोसेंट छवियों के पिक्सेल मूल्यों दिखा ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त की है और अच्छी तरह से त्रिज्या का प्रतिनिधित्व एक ग्रिड पर रखा गया 3 मिमी की। बार = 500 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
AlloCTL और ट्यूमर कोशिकाओं को transduced alloCTL से RRV-ईएमडी की क्षैतिज प्रसार की चित्रा 5. प्रवासन। फ्लोरोसेंट photomicrographs क्रमानुसार अच्छी तरह से उपयोग कर छवि संपादन सॉफ्टवेयर की त्रिज्या को कवर करने के साथ सिले। RRV-ईएमडी के प्रवासन transducedalloCTL (सफेद तीर) अवसादन निम्नलिखित 0 और 72 घंटा में यू-87MG ट्यूमर कोशिकाओं की एक monolayer पर दिखाया गया है। Monolayer में ट्यूमर कोशिकाओं के RRV-ईएमडी पारगमन ट्यूमर कोशिकाओं को लिम्फोसाइटों से संक्रामक RRV की क्षैतिज संचरण (सफेद बॉक्स, और इनसेट) हुआ है यह दर्शाता है कि ईएमडी-transduced alloCTL के अलावा के बाद 72 घंटे में भी स्पष्ट है। बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
AlloCTL चित्रा 6. रेडियल प्रवास RRV-ईएमडी के साथ transduced और CellTracker लाल CMTPX के साथ दाग। प्रकोष्ठों एमडीए MB-231BR कोशिकाओं से व्युत्पन्न ईसीएम निष्कर्षों पर sedimented थे। AlloCTL के प्रवासन 0, 4 और 8 घण्टे में उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोपी ने उतारी थी (ए, बी, क्रमशः एफ स्तंभ 1,)। FluoreCMPTX (लाल) की गंध छवियों alloCTL (सी, जी, स्तंभ 2) लेबल, RRV-ईएमडी (हरा) alloCTL (डी, एच, कॉलम 3), और विलय छवियों (ई, मैं, स्तंभ 4) हैं transduced 4 और 8 घंटा में दिखाया गया है। बार्स 200 माइक्रोन =; बार छवियों सीआई के लिए लागू बी में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक एकल कक्ष निलंबन में ट्यूमर कोशिकाओं को एक Teflon नकाबपोश स्लाइड के कुओं में pipetted थे। कोशिकाओं पालन करने की अनुमति दी और फिर एक humidified 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (चित्रा 1 ए) में monolayers गठन किया गया। Monolayer से व्युत्पन्न स्थापित monolayers या ईसीएम प्रोटीन इन assays (चित्रा 1 बी) के लिए काटा जा सकता है। ईएमडी के लिए कोडिंग वैक्टर के साथ महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल या transduced effector टी लिम्फोसाइटों अच्छी तरह से एक सीएसएम का उपयोग करने के केंद्र में वरीयता प्राप्त कर रहे थे। समय के साथ monolayer या ईसीएम प्रोटीन पर विस्थापित करने के लिए गैर-पक्षपाती प्रेरक टी lymphocytes की क्षमता का आकलन और प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मात्रा निर्धारित किया गया था। यहाँ, हम आंशिक रूप से प्रासंगिक लक्ष्य यू-87MG तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं की एक monolayer पर गैर पक्षपाती प्रेरक alloCTL के प्रवास और cytotoxicity का मूल्यांकन (आंकड़े 3 और 5)। केवल मानव ल्युकोसैट प्रतिजन के कुछ प्रदर्शित ये लक्ष्य कोशिकाओं,मूल stimulators पर पाया (एचएलए) अणुओं (एचएलए-ए 2, B44), प्रासंगिक 13-06 एमजी लक्ष्य कोशिकाओं (एचएलए A1,2 और B44 के लिए alloCTL द्वारा प्रदर्शित किया जाएगा कि शक्तिशाली अपघट्य गतिविधि को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया , 57)। हम यह भी एमडीए MB-231BR स्तन ट्यूमर कोशिकाओं की एक monolayer (चित्रा 6) से काटा ईसीएम पर alloCTL की गतिशीलता मनाया। alloCTL पहले से 9 प्रकाशित तरीकों के अनुसार एक तरह से MLTR द्वारा उत्पन्न कर रहे थे। प्रेरक alloCTL एक तरह से MLTR के बाद 4-5 दिन काटा और (आंकड़े 3 और 5) या RRV-ऐस-ईएमडी (चित्रा 6) 10,11 RRV-GS4-ईएमडी के साथ transduced थे। हायर पारगमन के स्तर amphotropic ऐस वेक्टर के साथ की तुलना में एक गिब्बन बंदर ल्यूकेमिया वायरस लिफाफा उपयोग GS4 वेक्टर के साथ प्राप्त किया गया। इस रेडियल प्रवास परख का प्रयोग, हम दोनों transduced और fluorescently लेबल alloCTL प्रवासी क्षमता थी nontransduced कि उल्लेख किया। हम यह भी है कि वे CYT जा करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने को दिखाना है किRRV पारगमन के लिए जोड़तोड़ के दौर से गुजर के बाद otoxic।

murine alloCTL की क्षमता भी (चित्रा 4) मूल्यांकन किया गया था विस्थापित करने के लिए। alloCTL टीयू-2449 कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित haplotype एच -2 बी / कश्मीर को अवगत (बैंगनी) eFluor 670 के साथ दाग रहे थे और एक प्रवास परख सीएमवी-भूसे IRES-FLUC2 (लाल) के साथ transduced टीयू-2449 का उपयोग किया गया था। पूरी तरह से प्रासंगिक लक्ष्य का उपयोग करते समय, alloCTL प्रेरक कोशिकाओं की एक कम संख्या ट्यूमर सेल लक्ष्य का तेजी से सेल को रोकने के लिए वरीयता प्राप्त थे। एक आधार रेखा के रूप में 1 घंटा का उपयोग करना, टी कोशिकाओं मोटे तौर पर एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में अच्छी तरह के केंद्र में उच्च घनत्व में अनुवादित हैं। 48 घंटा micrographs उनकी प्रारंभिक जमा के स्थल पर ट्यूमर कोशिकाओं के विनाश के साथ आसानी से स्पष्ट है अच्छी तरह से और alloCTL की क्लस्टरिंग के बाहरी छोर की ओर टी कोशिकाओं की व्यापक प्रवास दिखा। टीयू-2449 कोशिकाओं के प्रसार को लेबल कोशिकाओं अच्छी तरह से अधिक घनत्व में वृद्धि mStrawberry के रूप में इसका सबूत है। यह बेहतर सतह में देखा जाता हैकुओं में बैंगनी कोशिकाओं (चित्रा 4, नीचे पैनल) के वितरण कल्पना करने के लिए उत्पन्न किया गया कि प्रतिदीप्ति भूखंडों। AlloCTL गतिशीलता और अधिक स्पष्ट 1 घंटा आधारभूत की तुलना में 48 घंटा में अच्छी तरह से है। मानव alloCTL और तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं का उपयोग assays में देखा गया था क्या करने के लिए भी इसी तरह, प्रभावोत्पादक की प्रारंभिक जमा के क्षेत्र के आसपास ट्यूमर कोशिकाओं के एक निकासी ट्यूमर लक्ष्य कोशिकाओं के lysis सुझाव, 48 घंटा में ध्यान देने योग्य है।

इस परख में एक महत्वपूर्ण कदम स्वस्थ monolayers और 'कंकाल' ईसीएम के बाद फसल की वृद्धि है। 2.5 पर ट्यूमर कोशिकाओं के सीडिंग - ऊपर 1.9 कदम के अनुसार अच्छी तरह से प्रति 5.0 एक्स 10 4 कोशिकाओं, आमतौर पर हम इस्तेमाल ट्यूमर सेल प्रकार के लिए एक मोटे तौर पर भी monolayer में हुई। हम, ट्यूमर कोशिकाओं आरटी पर पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए यह महत्वपूर्ण कुओं के केंद्र की ओर कोशिकाओं धक्का होगा 37 डिग्री सेल्सियस पर होता है कि अन्यथा संवहन पाया। कुओं वाई के रूप में अच्छी तरह से, पूर्व कोटिंगवें पाली-डी-लाइसिन और / या बहुत सफलता की दर को बढ़ा सकते हैं फ़ाइब्रोनेक्टिन या कोलेजन के रूप में इस तरह के एक ईसीएम प्रोटीन। इसके अतिरिक्त, हम बहुत कम विश्वसनीय साबित कर दिया है, जो अलग-अलग ईसीएम घटकों (अर्थात्।, फ़ाइब्रोनेक्टिन, मज्जा), के साथ तुलना में monolayer के व्युत्पन्न 'कंकाल' ईसीएम का उपयोग कर इन assays के साथ बेहतर सफलता मिली। यह रूप में अच्छी तरह से अवसादन कई गुना के माध्यम से जमा करने के लिए गैर पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या के साथ प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, और एक शुद्ध सेल प्रकार का उपयोग करते हैं, तो एक सैद्धांतिक रूप से इस परख के साथ एक गतिशीलता गुणांक परिभाषित करने में सक्षम हो सकता है। अच्छी तरह से मात्रा छोटा है और मध्यम के कुछ वाष्पीकरण होता है क्योंकि, monolayer की ताजा माध्यम के साथ दैनिक मंगाया जाना चाहिए। मीडिया प्रतिस्थापन भी विषाक्त लैक्टेट का संचय कोशिकाओं के विकास के रूप में और विभाजन को रोकता है। एक स्वस्थ monolayer की खेती करने में विफलता अच्छी तरह से सतह से monolayer या ईसीएम के छप्पर में परिणाम कर सकते हैं।

यू-87MG तंत्रिकाबंधार्बुद सेल ली से निकाली गई Coomassie नीले दाग ईसीएम प्रोटीनपूर्वोत्तर के ऊपर ट्राइटन X-100 (चित्रा 1 बी) के साथ पाचन के बाद पीछे छोड़ दिया पक्षपाती सब्सट्रेट परत के एक दृश्य उदाहरण के रूप में दिखाया जाता है 1.13 कदम के अनुसार। एक स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन से ईसीएम उत्पादन, एमडीए MB-231BR कोशिकाओं, अक्सर अधिक खराब पक्षपाती और कभी कभी परख के दौरान स्लाइड से हटा लिया गया था कि एक ईसीएम परत है, जिसके परिणामस्वरूप बद और पतली थी। ट्यूमर कोशिकाओं पाचन से पहले 1-2 दिनों के लिए मिला हुआ monolayers के रूप में बनाए रखा गया है जब स्लाइड को ईसीएम प्रोटीन पालन में सुधार हुआ। प्रक्रिया के दौरान अच्छी तरह से आसपास के Teflon के मुहर के रखरखाव के लिए भी महत्वपूर्ण था। कम मात्रा में रखते हुए और ट्राइटन-X100 के समाधान के लिए Teflon के जोखिम को कम Teflon सील की अखंडता को नुकसान को कम किया।

इस प्रोटोकॉल में से एक अनुकूलन अक्टूबर एम्बेडेड ट्यूमर के ऊतक 14 के वर्गों से काटा एक तीन आयामी बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग हो सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फ्लैट Bott से दूरीस्लाइड सतह के लिए अच्छी तरह से omed केवल 1 मिमी है; इस प्रकार, इस मोटाई से अधिक वर्गों कई गुना नियुक्ति से बाधित हो सकता है। इसके अलावा, एक विधि गैर पक्षपाती कोशिकाओं से युक्त मध्यम की छोटी बूंद को स्वीकार करने के ऊतकों में एक मामूली गड़गड़ाहट छेद बनाने के लिए तैयार करने की आवश्यकता होगी।

अवसादन के अग्रिम में प्रेरक टी lymphocytes की एक अच्छी तरह छितरी एकल कक्ष निलंबन की तैयारी भी जरूरी था। एक एकल कोशिका निलंबन के समुच्चय को तितर-बितर करने के लिए गैर-पक्षपाती टी कोशिकाओं की कोमल tituration सही सीएसएम के चैनलों में alloCTL लोड करने से पहले एक अनिवार्य कदम था। यदि आवश्यक हो तो गैर एंजाइमी सेल हदबंदी buffers के उपयोग नियोजित किया जाना चाहिए। ऊपर चरण 2.8 में वर्णित के रूप में, अवसादन के लिए 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / μl - इसके अलावा, प्रेरक लिम्फोसाइटों के घनत्व के आसपास 1.0 होना चाहिए। उच्च सेल नंबर जब चलती बाधित करने के लिए आसान है कि एक बड़े जमा पैदा कर सकता है, जबकि कम सेल नंबर, कोई अवसादन में हो सकता हैस्लाइड। यह भी माध्यम में सीरम एकाग्रता बाहर छलकते की संभावना को कम कर देता है कि सकारात्मक meniscus के पर्याप्त सतह तनाव प्रदान करने के लिए कम से कम 10% हो कि सिफारिश की है।

प्रतिदीप्ति इमेजिंग क्षमताओं और एक 4x या 10x उद्देश्यों के साथ एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप इस परख के लिए इष्टतम है। इमेजिंग के लिए समय अंक व्यक्तिगत प्रयोगात्मक जांच और सेल प्रकार के अनुसार निर्धारित किया जा सकता है। विशेष रूप से गैर-पक्षपाती सीटीएल एक सेल monolayer (12-72 घंटा) से अधिक से ईसीएम प्रोटीन (4-8 घंटा) पर और अधिक तेजी से अच्छी तरह से किनारे की ओर अवसादन के केंद्र से विस्थापित। आंशिक रूप से एमएचसी प्रासंगिक लक्ष्य कोशिकाओं गतिशीलता के दृश्य के लिए प्रोत्साहित करते हैं और महत्वपूर्ण प्रवास हो सकता है इससे पहले monolayers की सेल की मध्यस्थता cytolysis कम करने के लिए हमारे alloCTL परख के लिए प्रासंगिक लक्ष्य के लिए बेहतर थे; अनुपात भी सेल धीमा कर देती है लक्षित करने के लिए एक कम प्रेरक का उपयोग करें। आंशिक रूप से मिलान किया गया लक्ष्य का उपयोग RRV के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता हैके रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर कोशिकाओं को संचरण।

एक औंधा माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल की एक ईमानदार गुंजाइश पर कई फायदे देता है। स्लाइड भी कोशिकाओं के लिए एक बाँझ वातावरण बनाए रखते हुए, परेशान होने की जरूरत नहीं है कि इतनी एक औंधा गुंजाइश humidified कक्ष के माध्यम से इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, कक्ष के माध्यम से इमेजिंग मानव व्युत्पन्न ऊतक 15 के साथ काम कर रहा है जब जैव सुरक्षा स्तर द्वितीय (बीएसएल द्वितीय) के दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए अनुमति देता है, नमूना और तकनीशियन के बीच एक बाधा प्रदान करता है।

एक ईमानदार गुंजाइश का उपयोग करते हैं, तो अच्छी तरह से सकारात्मक meniscus के बिना परेशान प्राप्त उच्चतम बढ़ाई 20x है। Meniscus के लिए व्यवधान आम तौर पर अच्छी तरह से भर sedimented गैर पक्षपाती कोशिकाओं के प्रसार में परिणाम के रूप में दुर्भाग्य से, एक coverslip, या सेल अवसादन कई गुना करने के लिए प्रकाशिकी किट सामान का उपयोग करते हैं, की सिफारिश नहीं है। समय की लंबी अवधि में इमेजिंग मेड से सावधान अलावा आवश्यकता हो सकती हैइस समय चूक इमेजिंग के दौरान आवश्यक होने की संभावना है, हालांकि, कि वाष्पीकरण के लिए खो दिया बदलने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए IUM।

इस प्रोटोकॉल Zigmond मंडलों 16,17 में पक्षपाती कोशिकाओं की क्षैतिज सेल प्रवास को मापने के तरीकों कि से अलग है, जिनमें से डिजाइन गैर पक्षपाती सेल प्रवास के दृश्य के लिए अनुमति नहीं होगी। इस तरह अगर के रूप में एक सब्सट्रेट के माध्यम से एक chemotactic ढाल की ओर क्षैतिज प्रवास का मूल्यांकन कि अन्य assays आम तौर पर एक सेल प्रकार 18-20 के प्रवास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सीएसएम का प्रयोग कई इन तरीकों के लिए लाभ के रूप में भी इस तरह के Boyden कक्षों या Matrigel transwell प्लेटों के रूप में संवर्धित कोशिकाओं, के ऊर्ध्वाधर माइग्रेशन / आक्रमण को मापने के तरीकों कि प्रदान करता है। सबसे पहले, सेल सेल संपर्क प्रेरक कोशिकाओं द्वारा लक्ष्य-प्रेरक सेल बातचीत और चोट के निर्धारण के लिए अनुमति देता है। शुरू में गड्ड को उत्तेजक 13-06 एमजी ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक तरह से MLTR द्वारा प्रेरित alloCTL-RRV-ईएमडी के cytolytic क्षमतासहयोगी एमएचसी-मिलान यू-87MG सेल लाइन अवसादन निम्नलिखित 24 और 72 घंटा में monolayer के केंद्र में स्पष्ट है (आंकड़े 3 और 5, लाइनों धराशायी)। साथ ही, murine alloCTL द्वारा टीयू-2449 कोशिकाओं के क्षरण 48 घंटा के बाद अवसादन (चित्रा 4) में दिख रही है। monolayer alloCTL जमा के केंद्र में obliterated, लेकिन मानव कोशिकाओं 21 या कम से assays में 13-06 एमजी और यू-87MG की एचएलए अभिव्यक्ति में ओवरलैप करने के लिए या तो कारण monolayer के शेष पर अधिक धीरे धीरे होता है murine तंत्रिकाबंधार्बुद के लिए प्रेरक कोशिकाओं की संख्या शुरू। प्रेरक दूर अवसादन साइट से विस्थापित alloCTL के रूप में इसके अलावा, घनत्व लक्षित करने के लिए प्रेरक कम हो जाता है। प्रवास और cytolysis के अलावा, इस प्रोटोकॉल के वायरस एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के हस्तांतरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इधर, ट्यूमर कोशिकाओं को alloCTL से ईएमडी के लिए RRV कोडिंग के हस्तांतरण 72 घंटा (चित्रा 5, इनसेट) के बाद स्पष्ट है।

इस मॉडल की एक सीमा माइग्रेशन केवल इन विवो प्रवास का सही मायने में चिंतनशील नहीं हो सकता है, जो इन विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है। एक और सीमा केमोकाइन / केमोकाइन रिसेप्टर ढ़ाल मॉडल का उपयोग कर स्थापित नहीं किया जा सकता है। ईसीएम या व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत अभी भी पाए जाते हैं और निर्भर उन कोशिकाओं छिपाना क्या पर या, इस गतिशीलता गधा व्यक्त कर सकते हैंप्र गैर पक्षपाती कोशिकाओं दूर पृथक कारकों से करने के लिए विशेष रूप से विस्थापित या जाएगा पर सवालों का जवाब नहीं होता।

इस परख का एक लाभ यह लिम्फोसाइटों है या transduced नहीं किया गया है अगर गैर पक्षपाती कोशिकाओं की आबादी प्रवासी कार्यक्षमता को बनाए रखने अगर निर्धारित करने की क्षमता है। हमारे उदाहरण में, transduced उप-जनसंख्या ईएमडी प्रोटीन अभिव्यक्ति के माध्यम से दिखाई दे रहा है, और यह प्रवासी कार्यक्षमता इस उप-जनसंख्या में बनाए रखा है कि स्पष्ट है। एक व्यापक आवेदन गैर पक्षपाती प्रतिरक्षा सेल प्रवास को प्रभावित कर सकता है कि एजेंट या दवाओं के विभिन्न सांद्रता के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए हो सकता है। इसके अलावा, अन्य hematopoietic कोशिकाओं विभिन्न substrates या सामान्य ऊतकों से निकाली गई पक्षपाती कोशिकाओं पर गतिशीलता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। यह प्रदान कर सकता है, यानी पक्षपाती सेल प्रकार, stromal कोशिकाओं या ट्यूमर के साथ वृक्ष के समान कोशिकाओं का एक संयोजन बोने, यहां ऐसा नहीं किया है, हालांकि अंत में, विवो वातावरण में और अधिक जटिल की चिंतनशील का विश्लेषण करती है।

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Acknowledgments

एनआईएच R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, एनआईएच / NCATS यूसीएलए CTSI अनुदान संख्या UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, और जोआन एस होम्स मेमोरियल रिसर्च फंड द्वारा समर्थित। MJH और GCO यूसीएलए में जोआन एस होम्स मेमोरियल Postdoctoral फैलोशिप से समर्थित प्राप्त किया। सीएसएम डिवाइस क्रिएटिव वैज्ञानिक तरीकों से प्राप्त किया गया था: www.creative-sci.com। lentiviral वेक्टर इलाज / P30 DK041301 द्वारा समर्थित है जो यूसीएलए वेक्टर कोर, से प्राप्त किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-masked microscope slides Creative Scientific Methods CSM002
Cell Sedimentation Manifold Creative Scientific Methods CSM001
Petri Dish, 150mm Corning 430597
Petri Dish, 35mm Corning 430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Mediatech 21-040
20 μl Pipetman Gilson F123600
200 μl Pipetman Gilson F123601
200 μl pipette tips VWR 89003-060
Distilled, deionized water (sterile) Mediatech 25-055
Trypsin Mediatech 25-054-CL
Celltracker Red CMPTX Invitrogen C34552
TrypLE Express (optional) Gibco 12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM) Mediatech 10-013
AIM-V serum-free media Invitrogen 12055-083
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E
Fibronectin BD 354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches Crosstex SCXS2
Trypan Blue Mediatech 25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience 65-0840-85
ImageJ NIH

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 96 गैर पक्षपाती सेल प्रवास प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेल अवसादन कई गुना अल्लोजीनिक सीटीएल monolayer टी सेल बाह्य मैट्रिक्स gliom
रेडियल गतिशीलता और रेट्रोवायरल नकल वेक्टर transduced, गैर-पक्षपाती Alloresponsive टी lymphocytes की साइटोटोक्सिक समारोह
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