रेडियल गतिशीलता और रेट्रोवायरल नकल वेक्टर transduced, गैर-पक्षपाती Alloresponsive टी lymphocytes की साइटोटोक्सिक समारोह
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
हम पहले fluorescently लेबल, गैर पक्षपाती मानव या murine प्रेरक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता को मापने के लिए, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन पर पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं के रेडियल प्रवास को मापने के लिए सूचना दी, रेडियल Monolayer सेल प्रवास परख के एक उपन्यास अनुकूलन रिपोर्ट। इस तकनीक को एक स्टेनलेस स्टील कई गुना और 10 अच्छी तरह से Teflon स्लाइड focally मिला हुआ ट्यूमर सेल monolayers या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ या तो तैयार कुओं में गैर पक्षपाती टी कोशिकाओं जमा करने के लिए कार्यरत हैं। लाइट और / या मल्टी चैनल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी समय के साथ प्रेरक कोशिकाओं के आंदोलन और व्यवहार पर नज़र रखने के लिए किया जाता है। फ्लोरोसेंट रंजक और / या फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन के लिए कोड विभिन्न इमेजिंग के लिए सेल प्रकार लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है कि वायरल वैक्टर। इस विधि स्लाइड कक्षों, अगर या transwell प्लेटों का उपयोग क्षैतिज या खड़ी माइग्रेशन / आक्रमण कि ट्रैक विट्रो assays में भी इसी प्रकार से अलग है। परख विस्तृत इमेजिंग डेटा ख के लिए अनुमति देता हैविशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों द्वारा प्रतिष्ठित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ एकत्र ई; कोशिकाओं के भी विशिष्ट उप-जनसंख्या (यानी, nontransduced / transduced) पर नजर रखी जा सकती है। भूतल तीव्रता प्रतिदीप्ति भूखंडों पलायन सेल प्रकार के अनुरूप है कि विशिष्ट प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। इस विशिष्ट समय में गैर-पक्षपाती प्रतिरक्षा सेल गतिशीलता के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह रूप में अच्छी तरह से, कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इस तरह के cytotoxicity या प्रेरक से वायरल वैक्टर के हस्तांतरण के रूप में अन्य प्रेरक सेल काम करता है, के सबूत इकट्ठा करने के लिए संभव है। इस प्रकार, विधि शोधकर्ताओं microscopically विभिन्न प्रकार के पक्षपाती कोशिकाओं के साथ विभिन्न लेबल, गैर पक्षपाती की सेल करने वाली सेल बातचीत करने के लिए दस्तावेज़ की अनुमति देता है। इस तरह की सूचना कार्यक्षमता का दृश्य सबूत कैंसर के उपचार के लिए उनके उपयोग से पहले ट्यूमर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ वांछित है जहां जैविक रूप से छेड़छाड़ या सक्रिय प्रतिरक्षा सेल प्रकार के मूल्यांकन में विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है।
Introduction
रेडियल Monolayer सेल प्रवास परख मूल रूप से बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन 5-7 से या ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन या laminin के 1,2 के रूप में व्यक्तिगत ईसीएम घटकों के साथ लेपित स्लाइड्स पर पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं को 1-4 की infiltrative गुणों को मापने के लिए विकसित किया गया था। तकनीक एक स्टेनलेस स्टील सेल अवसादन कई गुना (सीएसएम) का उपयोग कुओं के केंद्र में ट्यूमर कोशिकाओं के एक एकल कोशिका निलंबन बोने शामिल किया गया। अवसादन के बाद, ट्यूमर कोशिकाओं क्षैतिज गतिशीलता की दर से स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अच्छी तरह से और समय के साथ प्रारंभिक सेल की आबादी के व्यास में परिवर्तन के नीचे का पालन करना होगा। रेडियल Monolayer सेल प्रवास परख कोशिकाओं की इन विट्रो प्रवासी क्षमताओं परख transwell प्लेटें कार्यरत कि अन्य मौजूदा तरीकों पर एक दृश्य लाभ प्रदान की; इन assays इमेजिंग से 8 गैर अनुकूल हैं। साथ ही, यह भी timepoint चुनने में स्वतंत्रता की एक बड़ी राशि प्रदान कीप्रवास, मूल्यांकन किया है timepoints की संख्या पर कोई सीमा के साथ एक शोधकर्ता अवसादन के बाद छवि के लिए चुन सकता है जब है।
विस्थापित करने की क्षमता विशेष रूप से वे वायरल वैक्टर के लिए प्रसव के वाहन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रतिरक्षा चिकित्सा या जहां के क्षेत्र में, गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण कार्यक्षमता है, क्योंकि हम गैर-पक्षपाती सेल के पलायन का मूल्यांकन करने के सीएसएम के उपयोग के लिए अनुकूलित ट्यूमर सेल monolayers पर प्रकार, ईसीएम प्रोटीन के अलावा। Microscopically, या अलग-अलग ईसीएम घटकों पर ट्यूमर से अलग जटिल ईसीएम पर, व्यवहार्य ट्यूमर सेल monolayers पर गैर पक्षपाती कोशिकाओं के प्रवास visualizing का जोड़ा लाभ इस परख बहुमुखी बनाता है। एक भी कोशिकी प्रोटीन के साथ लेपित कुओं कि रोजगार assays सही रूप में कोशिकाओं vivo में के माध्यम से विस्थापित होता ईसीएम ऊतक सब्सट्रेट या ट्यूमर को प्रतिबिंबित नहीं करते।
यहाँ, हम प्रमुख histocomp को अवगत alloreactive साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (alloCTL), प्रयोगहमारे प्रतिनिधि गैर पक्षपाती सेल प्रकार के रूप में, एक तरह से मिश्रित लिम्फोसाइट ट्यूमर सेल प्रतिक्रियाओं (MLTR) या मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं (एमएलआर) 9 का उपयोग कर atibility परिसर (एमएचसी) प्रोटीन। हम दोनों मानव और murine मूल की कोशिकाओं का परीक्षण किया। माइग्रेशन ट्यूमर monolayers पर मापा गया था, नियोजित ट्यूमर कोशिकाओं को या तो आंशिक रूप से प्रासंगिक लक्ष्य एमएचसी अणुओं का एक पूरा सेट के साथ प्रभावोत्पादक, या पूरी तरह से प्रासंगिक लक्ष्य, संवेदनशील बनाने के लिए प्रयोग किया जाता सेल की आबादी पर पाया वही एमएचसी प्रोटीन के कुछ प्रदर्शित किया गया है कि प्रभावोत्पादक की ओर अवगत कर दिया गया था। कुछ प्रयोगों में, हम प्रेरक और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए फ्लोरोसेंट CellTracker लाल CMPTX या सेल प्रसार डाई eFluor 670 का इस्तेमाल किया। हम यह भी कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक अतिरिक्त मार्ग के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए वायरल वैक्टर एन्कोडिंग के साथ पारगमन का इस्तेमाल किया। कुछ assays के लिए, हम पन्ना ग्रीन (ईएमडी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन 10,11 के लिए कोडिंग रेट्रोवायरल नकल वैक्टर (RRV) के साथ alloCTL transduced; अन्य संगठनों के लिएनेताओं, ट्यूमर कोशिकाओं mStrawberry के लिए कोडिंग lentiviral वैक्टर के साथ transduced थे।
alloCTL ट्यूमर सेल monolayers से काटा ट्यूमर सेल monolayers या ईसीएम या तो केंद्र में कई गुना का एक चैनल के माध्यम से वरीयता प्राप्त थे। पक्षपाती और गैर पक्षपाती सेल बातचीत प्रकाश द्वारा और / या समय के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना थे। उच्च शक्ति में खंडित नाभिक के साथ कम बिजली में ट्यूमर सेल monolayer में व्यवधान, या ट्यूमर कोशिकाओं को क्रमश: सेल और apoptosis द्वारा सेल चोट के संकेतक थे। हम डिजिटल monolayer संस्कृतियों से अधिक गैर-पक्षपाती fluorescing टी कोशिकाओं के प्रवास दिखा सतह तीव्रता फ्लोरोसेंट नक्शे बनाया। हम यह भी cytotoxicity मढ़ा गैर पक्षपाती alloCTL के समूह गठन के बाद पक्षपाती तंत्रिकाबंधार्बुद सेल monolayer को engendered का उल्लेख किया। साथ ही, तंत्रिकाबंधार्बुद monolayer के लिए alloCTL से RRV-ईएमडी की क्षैतिज पारगमन मनाया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक एकल कक्ष निलंबन में ट्यूमर कोशिकाओं को एक Teflon नकाबपोश स्लाइड के कुओं में pipetted थे। कोशिकाओं पालन करने की अनुमति दी और फिर एक humidified 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (चित्रा 1 ए) में monolayers गठन किया…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, एनआईएच / NCATS यूसीएलए CTSI अनुदान संख्या UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, और जोआन एस होम्स मेमोरियल रिसर्च फंड द्वारा समर्थित। MJH और GCO यूसीएलए में जोआन एस होम्स मेमोरियल Postdoctoral फैलोशिप से समर्थित प्राप्त किया। सीएसएम डिवाइस क्रिएटिव वैज्ञानिक तरीकों से प्राप्त किया गया था: www.creative-sci.com। lentiviral वेक्टर इलाज / P30 DK041301 द्वारा समर्थित है जो यूसीएलए वेक्टर कोर, से प्राप्त किया गया था।
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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