Abstract
Presentamos una adaptación de la novela del ensayo de migración celular Radial monocapa, informó por primera vez para medir la migración radial de las células tumorales adherentes en las proteínas de la matriz extracelular, para la medición de la motilidad de las células marcadas con fluorescencia, humanos no adherente o efectoras inmunes murino. Esta técnica emplea un colector de acero inoxidable y 10 pocillos deslizante de Teflon para depositar focalmente células T no adherentes en los pocillos preparadas con monocapas confluentes de células tumorales o proteínas de la matriz extracelular. Microscopía de fluorescencia de luz y / o multi-canal se utiliza para seguir el movimiento y comportamiento de las células efectoras con el tiempo. Los colorantes fluorescentes y / o vectores virales que codifican para transgenes fluorescentes se utilizan para etiquetar diferencialmente los tipos de células para la imagen. Este método es distinto del de tipo similar en ensayos in vitro que el seguimiento de la migración / invasión horizontal o vertical utilizando cámaras de diapositivas, agar o transwell placas. El ensayo permite que los datos detallados de imagen para Be recogido con diferentes tipos de células que se distinguen por marcadores fluorescentes específicos; incluso subpoblaciones específicas de células (es decir, transducidas / nontransduced) pueden ser monitoreados. Parcelas de superficie intensidad de fluorescencia se generan utilizando canales específicos de fluorescencia que se corresponden con el tipo de célula que migra. Esto permite una mejor visualización de la movilidad de las células inmunes no adherente en momentos específicos. Es posible reunir pruebas de otras funciones de células efectoras, tales como la citotoxicidad o la transferencia de vectores virales de efector a células diana, también. Por lo tanto, el método permite a los investigadores documentan microscópicamente-célula a célula interacciones de diferencialmente marcado con, no adherente con células adherentes de diferentes tipos. Dicha información puede ser especialmente relevante en la evaluación de tipos de células inmunes biológicamente manipuladas o activados, cuando se desea una prueba visual de la funcionalidad con las células diana tumorales antes de su uso para la terapia del cáncer.
Introduction
El ensayo de migración de células Radial monocapa se desarrolló originalmente para medir las propiedades infiltrantes de células tumorales adherentes 1-4 en portaobjetos recubiertos con matriz extracelular (ECM), las proteínas 5-7 o con componentes de ECM individuales, tales como fibronectina o laminina 1,2. La técnica involucrada sembrar una suspensión de células individuales de células tumorales en el centro de pozos utilizando un colector de células de sedimentación de acero inoxidable (CSM). Después de la sedimentación, las células tumorales se adherirá a la parte inferior del pozo y el cambio en el diámetro de la población celular inicial en el tiempo se utilizó para establecer una tasa de movilidad horizontal. El ensayo de migración de células Radial Monocapa proporciona una ventaja visual sobre otros métodos existentes que emplean transwell placas de ensayo de las capacidades migratorias in vitro de células; estos ensayos no son propicias para la imagen 8. Además, también proporciona una gran cantidad de libertad en la elección del punto de tiempos cuando se evalúa la migración, sin límite en el número de puntos de tiempo un investigador podría elegir a la imagen después de la sedimentación.
Debido a que la capacidad de migrar es una funcionalidad importante para las células no adherentes, especialmente en el área de la inmunoterapia o donde pueden ser utilizados como vehículos de administración para los vectores virales, se adaptó el uso de la CSM para evaluar la migración de células no adherentes tipos en monocapas de células tumorales, además de las proteínas de ECM. El beneficio añadido de microscópicamente la visualización de la migración de las células no adherentes en monocapas de células tumorales viables, en ECM complejo aislado del tumor, o en los componentes de ECM individuales hace que este ensayo versátil. Los ensayos que emplean pocillos recubiertos con una sola proteína extracelular no reflejan con exactitud el sustrato tejido o tumor ECM las células se migrar a través in vivo.
Aquí, utilizamos alorreactivas linfocitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a gran histocompcomplejo atibility (MHC) de proteínas utilizando reacciones unidireccional de células tumorales de linfocitos mixtos (MLTR) o reacciones de linfocitos mixtos (MLR) 9, como nuestro representante tipo de células no adherentes. Hemos probado células tanto de origen humano y murino. Cuando la migración se midió en monocapas tumorales, las células tumorales empleadas eran objetivos, ya sea parcial pertinentes, se presentan algunas de las mismas proteínas MHC se encuentran en la población de células utilizado para sensibilizar a los efectores, o metas plenamente pertinentes, con un conjunto completo de moléculas del MHC que el efectores habían sensibilizado hacia. En algunos experimentos, se utilizó CellTracker fluorescente de color rojo CMPTX o tinte proliferación celular eFluor 670 para diferenciar entre las células efectoras y diana. También utilizamos la transducción con codificación de vectores virales para proteínas fluorescentes como una forma adicional de visualizar las células. Para ciertos ensayos, transduced la alloCTL con vectores retrovirales de replicación (RRV) que codifican para el verde esmeralda (EMD) de la proteína fluorescente 10,11; para othres, las células tumorales fueron transducidas con vectores lentivirales que codifican mStrawberry.
El alloCTL se sembraron a través de un canal del colector en el centro de cualquiera de las monocapas de células tumorales o ECM cosechadas a partir de monocapas de células tumorales. Interacciones de las células adherentes y no adherentes se visualizaron por la luz y / o por microscopía de fluorescencia con el tiempo. Interrupción en la monocapa de células tumorales a baja potencia, o tumorales células con núcleos fragmentados a alta potencia fueron los indicadores de lesión celular por lisis y la apoptosis, respectivamente. Hemos creado digitalmente mapas fluorescentes intensidad superficie que muestran la migración de las células fluorescentes T no adherentes en los cultivos en monocapa. También notamos la citotoxicidad engendró a la monocapa de células de glioma adherente después de la formación de agrupaciones de la alloCTL no adherente superpuesto. Además, se observó la transducción horizontal de RRV-EMD desde el alloCTL a la monocapa de glioma.
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Protocol
1. Preparación de los portaobjetos
- Insertar diapositivas colector de sedimentación celular en bolsas de esterilización y selle con cinta de autoclave. Oriente el lado recubierto de teflón de la corredera del lado del papel de la bolsa para evitar los depósitos de plástico en los pozos.
- Bolsas de autoclave durante 15 min a 121 ° C.
- Saque los portaobjetos de la bolsa de esterilización dentro de una cabina de bioseguridad y colocar en un 150 x 15 mm placa de Petri estéril estéril. Hasta cuatro diapositivas puede caber por plato. Colocar una placa de 35 x 10 mm Petri junto a las diapositivas. Añadir 2-3 ml de H2O estéril para proporcionar humidificación.
- Diapositivas pre-capa con poli-D-lisina en 100 g / ml mediante el uso de un volumen suficiente para cubrir la totalidad de bien. Después de una hora a RT, aspirar la solución y enjuague la superficie del pozo dos veces pipeteando 1x PBS sobre la superficie de los pocillos.
- Opcionalmente, añadir fibronectina u otros componentes de ECM para asegurar más fuerte adherencia de las células del tumor. Añadir fibronectina a 5 g / ml en un volumen suficiente That los pozos no se secará dentro de un período corto de tiempo a temperatura ambiente.
- Después de 1 hora, aspirar la solución sobrante y lavar dos veces con la pipeta hacia arriba y abajo con 1x PBS.
- Mantenga PBS en los pozos hasta que el tumor está listo para la siembra. Uso desliza el mismo día.
- Cosecha de un matraz confluente de el tipo de célula tumoral adherente deseado. Contar las células viables mediante exclusión con colorante azul de tripano por microscopía de luz y resuspender en 5 x 10 6 células / ml en el ejemplo medio para el crecimiento adecuadamente tamponada con, medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS), L- glutamina y piruvato de sodio.
- Si se desea imágenes fluorescentes de la población de células adherentes, etiquetar la población celular adherente con un colorante fluorescente vital o un colorante de la proliferación de células siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante.
- Suavemente pipeta de 10 l de medio completo en cada pocillo de la atención de diapositivas tomar para evitar la creación de burbujas en el wells, ya que estos pueden prevenir uniforme adherencia de las células del tumor.
- Añadir 2,5-5,0 x 10 4 células (5-10 l de suspensión celular) al medio en cada pocillo (Figura 1A). Ajuste el número óptimo dependiendo del tipo de célula tumoral y el número de días de crecimiento deseados. Las células tumorales más grandes o células de crecimiento rápido pueden requerir un menor número de células inicialmente. Aumentar el volumen así hasta 40 l mediante la adición de medio y pipeta de arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme de las células.
- Después de todos los pozos se siembran, permitir que las células tumorales se adhieran a temperatura ambiente, a continuación, coloque la tapa en el 150 x 15 mm placa de Petri y se mueven con cuidado el plato a un incubador humidificado 37 ° C / 5% de CO 2 durante al menos 24 horas.
- Cambie el medio de cultivo a diario. Pipetear con cuidado una porción del medio gastado de la monocapa y reemplazar con medio completo fresco.
NOTA: Debido a la evaporación, será necesario añadir que fue tomada más volumen. Wells estará listo para el ensayo cuando un par, confluente capa de células está presente. Esto es típicamente 1-3 días después de la siembra inicial. - Lave suavemente monocapa una vez con PBS como se describe en el paso 1.4 y, o bien continúe con el paso 2 si se desean monocapas, o al paso por debajo de 1,13 para extraer proteínas ECM de la monocapa.
- Hacer una Triton-X (v / v) solución al 0,5% en medio completo y añadir 30 l a cada pocillo. Deje monocapa digerir en campana durante 2 min, luego lavar dos veces con medio completo mediante pipeteo como se describe anteriormente.
NOTA: La capa de ECM puede ser visible al microscopio óptico (Figura 2). Utilice diapositivas de inmediato, o mantener en medio completo en el humidificado incubadora de CO 2 durante 1-2 días. No permita que los pocillos se sequen.
2. La sedimentación de las células T no adherentes en un portaobjetos
- Si se desea una imagen fluorescente de la población de células no adherentes, etiquetar las poblaciones de células no adherentes con un tinte fluorescente de vital importancia, como la CFSE, Cell Rastreador Red CMPTX o eFluor670 siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante al menos 1 hr antes de la prueba. Alternativamente, manipular las células para expresar proteínas fluorescentes codificadas por los vectores virales.
- Autoclave el colector de sedimentación celular en una bolsa de autoclave como se describe en 1.2 anteriormente.
- Retire la cámara de humidificado contiene diapositivas recubiertos de teflón de la incubadora y el lugar en el gabinete de seguridad biológica.
- Lavar los pocillos con PBS 1x pipeteando arriba y abajo, a continuación, añadir 45 l de medio completo que contiene al menos 10% de suero.
- Retire el colector de la envoltura de esterilización y deslice cuidadosamente en más de los pocillos hasta que el "gancho" en el extremo del colector toca la parte inferior de la corredera (Figura 1B).
- Asegúrese de que el medio de cultivo es visible en cada uno de los canales. Si ninguno se ve, quitarse el colector y añadir más medio al pocillo correspondiente, luego vuelva a colocar y puedes volver a intentarlo.
- Repita el paso 2.5 para cada channel del colector, o para tantos pozos como se desee.
- Contar las células no adherentes y volver a suspender a no menos de 1,0 a 2,0 x 10 5 / l. Elaborar 1 l de células y lentamente la pipeta ellos en el canal (Figura 1C). Haga esto para cada bien deseado.
- Deja todo el aparato cargado célula, es decir, del colector y de diapositivas, dentro de la bio-campana durante 20-30 min para permitir que las células en el canal se asienten.
- Retire el colector al tocar ambos extremos y levantando suavemente de él hacia arriba de la diapositiva con el fin de no molestar a las células focalmente sembradas en el centro de los pozos (Figura 1D).
- Inspeccionar cada pocillo para asegurar que las células no adherentes se han sembrado con éxito en el centro de la así permanecer dentro de la circunferencia del canal colector. Las células no adherentes se adhieran idealmente ligeramente a la monocapa o ECM y entre sí, por lo tanto, moviendo suavemente el portaobjetos alrededor no causará la pelle celulart para dispersar. No empujar la diapositiva.
3. Microscopía de Fluorescencia
- Con el equipo experimental apropiado, realizar la proyección de imagen después de que se confirmó la sedimentación. Lo ideal es utilizar un microscopio que está equipado con una cámara de CO 2 y la humedad. Imagen a baja potencia, es decir, 4X o 10X, para permitir múltiples imágenes para ser tomado de un área más grande para que la totalidad del bien puede ser visto.
- Adquirir imágenes digitales usando el software de captura de imágenes. Realizar campo claro y / o imágenes de fluorescencia multi-canal.
- Si lo desea, configure una de lapso de tiempo para grabar imágenes en diferentes canales sobre un área determinada, o mantener la diapositiva humidifica y en un / 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C y manualmente sacar a la imagen en los puntos de tiempo deseados (Figura 1E y F, se recomienda para los puntos de tiempo más largos).
4. Análisis y Visualización
- El uso de software de edición de imagen, combinar la luz y la flimágenes fluorescentes en una sola capa para múltiples tipos de células y los marcadores se pueden ver en la misma imagen. Arrastre y suelte los archivos de imagen para cada color individual en el programa y, cuando se le solicite, seleccione la opción "Añadir Capa" para crear un archivo de imagen con múltiples capas.
- A mayor aumento, tomar, alinear y unir juntos las imágenes de todo el bien digitalmente. Alinear archivos mirando a regiones conservadas entre dos imágenes y la superposición de una imagen en la parte superior de la otra hasta que una imagen completa se genera.
- Añadir bares micras a las imágenes durante la adquisición usando el software de captura para determinar la distancia células individuales han migrado.
- Para determinar la migración de células en diversos momentos, hacer mapas de intensidad de fluorescencia superficie con la imagen del software, es decir, ImageJ, para cuantificar la agregación de células T fluorescente o extendido en el tiempo.
- Para generar representaciones gráficas de superficie, tomar una imagen con capas generada en el paso 4.1 y bajo la ventana de capas,desactive todas las capas excepto las correspondientes al canal deseado. Por ejemplo, si se desea un gráfico de superficie para visualizar la expresión de EMD, sólo las capas "verdes" que corresponde al filtro utilizado para este marcador debe ser visible.
- Aplanar la imagen y guardarla en un formato de archivo reconocido (por ejemplo, .png) y cargar la imagen en el programa. Para generar el gráfico de superficie, cambiar el tipo de imagen de 8 bits, cambiar el brillo / contraste, según sea necesario para reducir el fondo, y seleccione la opción "Analizar / Superficie Terreno». Las imágenes de la Figura 5 se generaron mediante la comprobación de la 'sombra', 'Dibuja Axis', 'Un polígono por línea ", y casillas de verificación" suave ".
- Otra opción es tomar mediciones utilizando el radio o el diámetro del depósito de células focal en el tiempo cero y comparar a las células en el punto más exterior en diferentes momentos. El diámetro de los pozos de teflón es 6,0 mm.
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Representative Results
Los vectores virales que codifican para las proteínas fluorescentes se pueden utilizar además de, o en lugar de, tinte fluorescente. Transducción viral se debe realizar antes de el ensayo de motilidad. Ambos tipos de células adherentes y no adherentes pueden ser marcados de forma diferencial. El protocolo para la transducción dependerá del tipo de vector utilizado. Aquí, transduced la alloCTL en las figuras 3, 5 y 6 con RRV-EMD al menos dos días de anticipación de la prueba utilizando el protocolo descrito 12. También se utilizó un vector lentiviral, CMV-fresa-IRES-FLUC2, para transducir las células tumorales para expresar la proteína fluorescente de color rojo mStrawberry (Figura 4). Esta transducción se llevó a cabo mediante la adición del vector al matraz de células durante 48 horas, momento en el cual, se añadió medio fresco. Después de permitir que las células se recuperen durante dos días, limitando la dilución se realizó para generar una población de 100% de células transducidas.
(Figuras 3 y 5). La microscopía de fluorescencia muestra células sembradas inicialmente, en el centro del pozo, migran lejos del centro con el tiempo. La formación de alloCTL agregados después de 4 h (figura 3, flechas blancas) es probable reflejo de los patrones de crecimiento autocrinos exhibidos por activada, IL-2 que producen poblaciones de células T 13.
En otro experimento, efector murino alloCTL fueron realizadas por un solo sentido MLR utilizando haplotipo H-2d esplenocitos BALB / c respondedoras y estimuladoras esplenocitos haplotipo H-2b / k de ratones B6C3F1, la cepa a la que el glioma TU-2449 es singénico. Inmediatamente antes de la siembra a través del canal de tque el colector sobre la monocapa de células tumorales, la alloCTL se tiñeron con eFluor 670. El alloCTL (células púrpura) se sembraron en el centro de monocapas establecidas de células de glioma TU-2449 (rojo), que fueron 100% transducidas con el CMV-pajizo IRES-FLUC2 vector viral, y chapada en pozos el día antes del ensayo. Figura 4A y B muestran imágenes microscópicas tomadas del mismo cuadrante del mismo bien en 1 y 48 horas. Figura 4C y D se generaron utilizando ImageJ para convertir digitalizados fluorescencia violeta intensidades en parcelas de superficie cuantitativos que se muestran en formato tridimensional.
Finalmente, alloCTL humana se realizaron con células cerebrales trópico humanos estimulador inactivados derivados de la línea celular de tumor de mama metastásico MDA-MB-231BR por MLTR. La Figura 6 muestra la luz y las imágenes de microscopía de fluorescencia con el tiempo de no adherente alloCTL marcado con CMPTX, parcialmente transducidas con RRV-EMD, la migración de las proteínas ECM extraídos fesde esas células tumorales. En (A) la brillante microfotografía campo muestra la colocación focal de alloCTL inmediatamente después de la sedimentación. En (B y F) microfotografías de campo claro se muestran, a las 4 y 8 horas, respectivamente, el alloCTL migrar radialmente en el ECM. La densidad alloCTL disminuye con la distancia desde el centro del pozo (centro de pozo es esquina superior izquierda de campo en BI). Paneles espectáculo (C y G) toda la preparación alloCTL teñido con CMTPX; (D y H) muestran la transducción parcial de la alloCTL con RRV-EMD como se indica por un pequeño número de células T EMD +, y (E y I) muestran las imágenes fusionadas de la RRV-EMD transduce alloCTL la migración en el ECM junto con el alloCTL transducido.
Figura monocapas de células tumorales y 2. ECM sembraron en pocillos del portaobjetos CSM. Las microfotografías de pozos de diapositivas preparadascon (A) confluente U-87MG monocapas celulares de glioma, o proteínas (B) ECM extraídos de confluente U-87MG se tiñeron con colorante azul de Coomassie. Bar = 200 micras. Haga clic aquí para una versión más grande de esta cifra.
Figura 3. Migración y citotoxicidad de RRV-EMD linfocitos transducidos en el centro y el borde delantero del depósito de células en el tiempo. Microfotografías fluorescentes tomadas en distintos momentos en el borde de ataque y en el centro de alloCTL-RRV-EMD siguiente sedimentación en una monocapa de células de glioma U-87MG adherentes. Efector alloCTL sembró como células individuales, forman agrupaciones esféricas dentro de 4 horas (flechas blancas) de la colocación. Individual con fluorescencia marcado CTL han emigrado desde el centro del pozo uns tiempo avanza. Después de 24 horas, los parches de células vacías en la monocapa adherente son visibles presumiblemente debido a alloCTL citolisis de las células diana tumorales (véase área dentro de guiones). Bar = 200 micras. Haga clic aquí para una versión más grande de esta cifra.
Figura 4. Radial migración de alloCTL murino se tiñeron con eFluor 670 en células de glioma marcadas con mStrawberry mostrados en 1 y 48 hr. Fotomicrografías de fluorescencia de un cuadrante de la misma bien en (A) 1 hr y (B) 48 horas después de la sedimentación de fluorescencia marcada con alloCTL no adherente sobre una monocapa de células de glioma TU-2449. Las fotomicrografías de baja potencia reflejan el área contenida dentro de un cuadrante de la CSM bien (radio de 3 mm). En alta potencia (A y B, inserciones) alloCTL (flechas blancas) se muestran en la proximidad de o asociada con células tumorales individuales; uno tiene una apariencia desintegrado con núcleos fragmentados y es apoptótica. (C y D) de la superficie respectiva de mapas de intensidad de fluorescencia obtenidos usando el software ImageJ que muestra valores de píxeles de las imágenes fluorescentes de color púrpura digitalizadas en forma gráfica en tres dimensiones y se colocan en una cuadrícula que representa el radio así de 3 mm. Bar = 500 micras. Haga clic aquí para una versión más grande de esta cifra.
Figura 5. La migración de alloCTL y la propagación horizontal de RRV-EMD de alloCTL transducidas a las células tumorales. Fotomicrografías fluorescentes en serie cosen para cubrir el radio del pozo utilizando el software de edición de imágenes. Migración de RRV-EMD transdujoalloCTL (flechas blancas) se muestra en una monocapa de células tumorales U-87MG a 0 y 72 h después de la sedimentación. RRV-EMD transducción de células tumorales en la monocapa es también evidente a las 72 h después de la adición de la alloCTL transducidas-EMD, lo que indica que la transmisión horizontal de RRV infecciosa de los linfocitos a las células tumorales se ha producido (caja blanca, y el recuadro). Bar = 200 micras. Haga clic aquí para una versión más grande de esta cifra.
Figura 6. Radial migración de alloCTL transducidas con RRV-EMD y se tiñó con CellTracker Red CMTPX. Las células se sedimentaron en extractos de ECM derivadas de células MDA-MB-231BR. La migración de alloCTL Se obtuvieron imágenes de campo brillante por microscopía de luz a los 0, 4 y 8 horas (A, B, columna F 1, respectivamente). Fluoreimágenes olor del CMPTX (rojo) etiquetados alloCTL (C, G, columna 2), la RRV-EMD (verde) transduce alloCTL (D, H, columna 3), y las imágenes fusionadas (E, I, columna 4) son muestra a las 4 y 8 horas. Bares = 200 micras; Bar se muestra en B aplicable a imágenes CI. Haga clic aquí para una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
Las células tumorales en una suspensión de células se pipetearon en los pocillos de un portaobjetos de Teflon-enmascarado. Las células se dejaron adherir y luego formaron monocapas en un humidificado 5% de CO 2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocapas establecidas o proteínas ECM derivados de la monocapa pueden ser cosechadas para estos ensayos (Figura 1B). Linfocitos T efectores marcados con colorantes fluorescentes vitales o transducidas con vectores que codifican para EMD se sembraron en el centro del pozo utilizando un CSM. Entonces la capacidad de no adherentes linfocitos T efectores para migrar en las proteínas monocapa o ECM lo largo del tiempo se evaluó y se cuantificó con la luz y microscopía de fluorescencia. Aquí, hemos evaluado la migración y la citotoxicidad del efector no adherente alloCTL en una monocapa de destino parcialmente relevante células de glioma U-87MG (Figuras 3 y 5). Estas células diana, mostrando sólo una parte del antígeno leucocitario humano(HLA) moléculas (HLA-A2, B44) que se encuentran en los estimuladores originales, fueron utilizados para reducir la actividad lítica potente que se visualiza por el alloCTL a las células diana relevantes 13-06-Mg (HLA-B44 y A1,2 , 57). También se observó la movilidad de la alloCTL en ECM cosechado de una monocapa de células de tumor de mama MDA-MB-231BR (Figura 6). El alloCTL fueron generados por una sola vía MLTR de acuerdo con métodos previamente publicados 9. Efector alloCTL se recogieron 4-5 días después de una sola vía MLTR y transducidas con RRV-GS4-EMD (Figuras 3 y 5) o RRV-ACE-EMD (Figura 6) 10,11. Niveles de transducción más altas se logran con el vector GS4 utilizando una envoltura del virus de la leucemia del mono Gibbon que con el vector anfotrópico ACE. El uso de este ensayo de migración radial, observamos que tanto transducidas y nontransduced marcado con fluorescencia-alloCTL tenía capacidad migratoria. También demuestran que conservan su capacidad de ser CYTotoxic después de someterse a las manipulaciones de la transducción RRV.
La capacidad de alloCTL murino para migrar también se evaluó (Figura 4). alloCTL sensibilizado a haplotipo H-2b / k mostrada por células TU-2449 se tiñeron con eFluor 670 (púrpura) y un ensayo de migración se realizó utilizando TU-2449 transducidas con CMV-paja-IRES-FLUC2 (rojo). Cuando se utiliza totalmente objetivo relevante, se sembraron un menor número de células efectoras alloCTL para prevenir la rápida lisis de las dianas celulares del tumor. Uso de 1 hr como una línea de base, las células T se localizan en gran medida a alta densidad en el centro de la así como una suspensión de células individuales. Las micrografías 48 hr muestran extensa migración de las células T hacia el borde exterior del pozo y la agrupación de la alloCTL es fácilmente evidente con la destrucción de las células tumorales en el sitio de su depósito inicial. La proliferación de las células TU-2449 se pone de manifiesto como el mStrawberry células marcadas aumento de la densidad sobre el pozo. Esto se ve mejor en la superficieparcelas de fluorescencia que se generaron para visualizar la distribución de células de color púrpura en los pozos (Figura 4, panel inferior). Movilidad AlloCTL es mucho más evidente en el pozo a 48 hr en comparación con la línea de base 1 hr. De manera similar a lo observado en los ensayos que utilizan células alloCTL y glioma humano, una separación de las células tumorales en todo el área del depósito inicial de efectores se nota en 48 horas, lo que sugiere la lisis de las células diana tumorales.
Un paso crítico en este ensayo es el crecimiento de monocapas sanos y posterior cosecha de ECM 'esqueleto'. Siembra de las células tumorales en 2,5 a 5,0 x 10 4 células por pocillo, según la etapa 1.9 anterior, por lo general como resultado una monocapa o menos, incluso para los tipos de células tumorales que utilizamos. Hemos encontrado que es crucial para permitir que las células tumorales se adhieran a TA, de lo contrario la convección que se produce a 37 ° C empujará las células hacia el centro de los pocillos. Además, pre-recubrimiento del wi pozosº poli-D-lisina y / o una proteína de ECM tales como fibronectina o colágeno puede aumentar en gran medida la tasa de éxito. Además, hemos tenido más éxito con estos ensayos usando monocapa derivado ECM 'esqueleto' que con los componentes de ECM individuales (es decir., Fibronectina, colágeno), que resultó mucho menos fiable. Es importante experimentar con el número de células no adherentes para depositar a través del colector de sedimentación, así, y si se utiliza un tipo de célula puro, se podría teóricamente ser capaz de definir un coeficiente de la motilidad con este ensayo. Debido a que el volumen bien es pequeño y algunos evaporación del medio se produce, la monocapa tiene que ser repuesto a diario con medio fresco. Reemplazo Media también previene la acumulación de lactato tóxicos a medida que crecen las células y dividir. La falta de cultivar una monocapa sana puede resultar en el desprendimiento de la monocapa o ECM de la superficie así.
Los azules proteínas ECM manchadas de Coomassie derivados de la li celular glioma U-87MGne acuerdo con la etapa 1.13 anteriormente se muestran como un ejemplo visual de la capa de sustrato adherente dejado atrás después de la digestión con Triton X-100 (Figura 1B). La producción de ECM de una línea celular de carcinoma de mama, las células MDA-MB-231BR, a menudo era irregular y delgado, resultando en una capa de ECM que era más pobremente adherente y, a veces levantado de la corredera durante el ensayo. La adherencia de proteínas ECM a la diapositiva mejoró cuando las células tumorales se mantuvieron como monocapas confluentes durante 1-2 días antes de la digestión. Durante todo el proceso, el mantenimiento de la junta de teflón que rodea el pozo era también importante. Mantener el volumen bajo y minimizar la exposición del Teflon a la solución de Triton-X100 mitigado el daño a la integridad de la junta de teflón.
Una adaptación de este protocolo podría ser el uso de una matriz extracelular tres dimensiones cosechadas a partir de secciones de octubre tejido tumoral embebido 14. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la distancia desde el plano BottOMED bien a la superficie de deslizamiento es sólo 1 mm; por lo tanto, las secciones de mayor grosor pueden ser interrumpidos por la colocación del colector. Además, tendría que ser diseñado para hacer un agujero ligera rebaba en el tejido para aceptar la gota de medio que contiene las células no adherentes un método.
Preparación de una suspensión de células individuales bien dispersada de los linfocitos T efectores antes de la sedimentación también era imperativo. La trituración suave de las células T no adherentes a dispersar los agregados a una suspensión de células fue un paso esencial derecha antes de cargar el alloCTL en los canales de la CSM. El uso de tampones de disociación de células no enzimáticos debe ser empleado si es necesario. Además, la densidad de linfocitos efectores debe ser alrededor de 1,0 a 2,0 x 10 5 células / l para la sedimentación, tal como se describe en el paso 2.8 anteriormente. Los números de células bajos pueden resultar en ningún sedimentación, mientras que el número de células más altas pueden causar un gran depósito que es fácil de perturbar al mover ladeslice. También se recomienda que la concentración de suero en el medio sea de al menos 10% para proporcionar la tensión superficial adecuada del menisco positivo que reduce la posibilidad de derrames.
Un microscopio de luz invertida con capacidades de imagen de fluorescencia y un 4x o 10x objetivos es óptimo para este ensayo. Los puntos de tiempo para las imágenes pueden ser determinadas de acuerdo a las investigaciones experimentales individuales y tipos de células. El CTL no adherente, en particular, migran desde el centro de la sedimentación hacia el borde del pozo más rápidamente en las proteínas ECM (4-8 hr) que a través de una monocapa de células (12-72 h). Parcialmente células diana relevantes MHC eran preferibles a los objetivos relevantes para nuestro ensayo alloCTL para alentar a la visualización de la motilidad y reducir la citólisis mediada por células de las monocapas antes de que ocurra la migración significativa; el uso de un generador de efectos de baja para apuntar relación también retrasa la lisis. El uso de objetivos parcialmente coincidentes, permite una mejor visualización del RRVla transmisión a las células tumorales también.
El uso de un microscopio invertido ofrece múltiples ventajas sobre un alcance vertical. Un ámbito de aplicación invertida permite la formación de imágenes a través de la cámara humidificada para que las diapositivas no tienen que ser molestado, al mismo tiempo mantener un entorno estéril para las células. También, de formación de imágenes a través de la cámara proporciona una barrera entre la muestra y el técnico, lo que permite la adhesión a nivel de bioseguridad II directrices (BSL II) cuando se trabaja con el tejido humano derivado 15.
Si se utiliza un alcance vertical, el aumento más alto alcanzable sin perturbar el menisco positivo del pozo es de 20x. Desafortunadamente, el uso de un cubreobjetos, o accesorios del equipo para la óptica al colector de sedimentación celular, no es recomendable, ya que la interrupción en el menisco típicamente resulta en la propagación de las células no adherentes sedimentados a lo largo del pozo. Imaging durante largos períodos de tiempo puede requerir la adición cuidadosa de medIUM a cada pocillo para reemplazar esa pierde por evaporación, aunque esto es más probable que se requiera durante time-lapse.
Este protocolo es distinto de los métodos que miden la migración de células horizontal de células adherentes en Zigmond Cámaras 16,17, el diseño de los cuales no permiten la visualización de la migración de células no adherentes. Otros ensayos que evalúan la migración horizontal hacia un gradiente quimiotáctico a través de un sustrato tal como agar se utilizan generalmente para estudiar la migración de un tipo celular 18-20. El uso del CSM proporciona varias ventajas a estos métodos, así como los métodos que miden la migración / invasión vertical de células cultivadas, tales como en cámaras de Boyden o placas Transwell Matrigel. En primer lugar, el contacto célula-célula permite una determinación de la interacción célula diana efector y la lesión por células efectoras. La capacidad citolítica de alloCTL-RRV-EMD estimulada inicialmente por una sola vía MLTR con estimulador de las células tumorales 13-06-MG a la partiemparejado-MHC aliado línea celular U-87MG es evidente en el centro de la monocapa a 24 y 72 h después de la sedimentación (Figuras 3 y 5, las líneas de trazos). Además, la degradación de las células TU-2449 por alloCTL murino es visible en 48 horas después de la sedimentación (Figura 4). La monocapa se borra en el centro del depósito alloCTL, pero se produce más lentamente durante el resto de la monocapa, ya sea debido a la superposición en la expresión de HLA de 13-06-MG y U-87MG en los ensayos con células humanas 21 o la baja número de células efectoras de partida para el glioma murino. También, el efector a diana densidad se reduce a medida que el efector alloCTL migrar fuera del lugar de sedimentación. Además de la migración y la citólisis, este protocolo se puede utilizar para visualizar la transferencia de las proteínas fluorescentes de codificación de virus. Aquí, la transferencia de codificación RRV de EMD desde el alloCTL a las células tumorales es evidente después de 72 hr (Figura 5, recuadro).
Una limitación de este modelo es que la migración sólo puede ser evaluada in vitro, que puede no ser realmente un reflejo de la migración en vivo. Otra limitación es que los gradientes de los receptores de quimiocina / quimiocina no pueden establecerse utilizando el modelo. Mientras que las interacciones de las células inmunes con ECM o células tumorales individuales pueden todavía ocurrir y dependerá de lo que secretan las células o expresar, este culo motilidaday no responder a las preguntas sobre si las células no adherentes migrarán específicamente para o lejos de factores aislados.
Una ventaja de este ensayo es la capacidad para determinar si una población de células no adherentes mantener la funcionalidad migratoria si los linfocitos tienen o no han sido transducidas. En nuestro ejemplo, la subpoblación transducida es visible a través de EMD expresión de la proteína, y está claro que la funcionalidad migratoria se mantiene en esta subpoblación. Una aplicación más amplia, podría ser para probar los efectos de diversas concentraciones de agentes o fármacos que pueden afectar no adherente migración celular inmune. Además, otras células hematopoyéticas pueden ser probados para la movilidad en varios sustratos o células adherentes derivadas de tejido normal. Finalmente, aunque no se hace aquí, sembrando una combinación de tipos de células adherentes, es decir, las células estromales o células dendríticas con tumor, puede proporcionar análisis reflexivo de más compleja en entornos in vivo.
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Acknowledgments
Apoyado en parte por el NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI la subvención Número UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, y el Fondo de Investigación Joan S. Holmes Memorial. MJH y GCO recibieron el apoyo de la Joan S. Holmes Memorial beca posdoctoral en la UCLA. El dispositivo CSM se obtuvo de métodos científicos creativos: www.creative-sci.com. El vector lentiviral se recibió de la UCLA Vector Core, que es apoyado por DK041301 CURE / P30.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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