Abstract
Nous rapportons une nouvelle adaptation du dosage Cell Migration radiale monocouche, d'abord rapporté pour mesurer la migration radiale des cellules tumorales adhérentes sur les protéines de la matrice extracellulaire, pour la mesure de la motilité de cellules immunitaires marquées par fluorescence, les droits non adhérente ou effectrices murin. Cette technique utilise un collecteur en acier inoxydable et lame de Téflon 10 puits à déposer focalement cellules T non adhérentes dans des puits préparés soit avec des monocouches de cellules tumorales confluentes ou des protéines de la matrice extracellulaire. La microscopie par fluorescence de lumière et / ou multi-canal est utilisé pour suivre le mouvement et le comportement des cellules effectrices dans le temps. Les colorants fluorescents et / ou des vecteurs viraux qui codent pour des transgènes fluorescents sont utilisés pour marquer de manière différentielle les types de cellules pour l'imagerie. Cette méthode est distincte de type semblable dans des essais in vitro qui suivent horizontale ou verticale migration / invasion utilisant des chambres de diapositives, l'agar ou transwell plaques. Le test permet aux données d'imagerie détaillées à Be recueillies avec différents types de cellules qui se distinguent par des marqueurs fluorescents spécifiques; même sous-populations spécifiques de cellules (ce est à dire, une transduction / nontransduced) peuvent être surveillés. Surface parcelles de fluorescence d'intensité sont générées en utilisant des canaux de fluorescence spécifiques qui correspondent au type de cellule en cours de migration. Cela permet une meilleure visualisation de la mobilité immunitaire non-adhérent cellulaire à des moments précis. Il est possible de recueillir des preuves d'autres fonctions des cellules effectrices, telles que la cytotoxicité ou le transfert des vecteurs viraux de l'effecteur aux cellules cibles, aussi bien. Ainsi, le procédé permet aux chercheurs de documenter les interactions de microscope marqués de façon différentielle, non adhérente de cellule à cellule avec les cellules adhérentes de différents types. Ces informations peuvent être particulièrement pertinent dans l'évaluation de types de cellules immunitaires biologiquement actif ou manipulées, où une preuve visuelle de la fonctionnalité est recherchée avec les cellules cibles de tumeur avant leur utilisation pour le traitement du cancer.
Introduction
Le dosage migration cellulaire Radial monocouche a été initialement développé pour mesurer les propriétés d'infiltration de cellules tumorales adhérentes 1-4 sur des lames revêtues de la matrice extracellulaire (ECM) protéines 5-7 ou avec des composants ECM individuelles, telles que la fibronectine ou la laminine 1,2. La technique implique l'ensemencement d'une suspension cellulaire unique de cellules tumorales dans le centre du puits en utilisant un collecteur de cellules sédimentation en acier inoxydable (CSM). Après sédimentation, les cellules tumorales se conformer au fond du puits et de la variation dans le diamètre de la population initiale de cellules au cours du temps a été utilisée pour établir un taux de mobilité horizontale. Le dosage migration cellulaire Radial monocouche fourni un avantage visuel sur les autres méthodes existantes qui emploient transwell plaques pour doser les capacités migratoires in vitro de cellules; ces tests sont non-propice à l'imagerie 8. En outre, il a également fourni une grande liberté dans le choix du timepoints lorsque la migration est évalué, sans aucune limite sur le nombre de points dans le temps un chercheur pourrait choisir d'image après la sédimentation.
Étant donné que la capacité de migrer est une fonctionnalité importante pour les cellules non adhérentes, en particulier dans le domaine de l'immunothérapie ou où ils peuvent être utilisés comme véhicules de délivrance de vecteurs viraux, nous avons adapté l'utilisation du CSM afin d'évaluer la migration des cellules non-adhérentes types sur des monocouches de cellules tumorales, en plus des protéines de la MEC. L'avantage supplémentaire de la visualisation au microscope la migration de cellules non-adhérentes sur des monocouches de cellules viables de la tumeur, sur ECM complexe isolé de la tumeur, ou sur des composants individuels de l'ECM rend ce test polyvalent. Les dosages qui utilisent des puits revêtus avec une seule protéine extracellulaire ne reflètent pas de façon précise le substrat de tissu ou de tumeur ECM les cellules migrer à travers seraient in vivo.
Ici, nous avons utilisé alloréactives lymphocytes T cytotoxiques (alloCTL), sensibilisés aux histocomp majeureatibility complexe (MHC) des protéines en utilisant des réactions de cellules tumorales de lymphocytes mixtes à une voie (MLTR) ou des réactions lymphocytaires mixtes (RLM) 9, comme notre type cellulaire non adhérente représentant. Nous avons testé les cellules d'origine tant humaine et murine. Lorsque la migration a été mesurée sur des monocouches tumorales, les cellules tumorales employées étaient des cibles partiellement pertinentes, l'affichage de certaines des mêmes protéines CMH trouvés sur la population de cellules utilisé pour sensibiliser les effecteurs, ou des cibles totalement pertinentes, avec un ensemble complet de molécules du CMH que le effecteurs avaient été sensibilisés envers. Dans certaines expériences, nous avons utilisé CellTracker fluorescent ou un colorant rouge CMPTX de prolifération cellulaire eFluor 670 pour différencier entre les cellules effectrices et cibles. Nous avons également utilisé transduction avec des vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes comme un moyen supplémentaire pour visualiser les cellules. Pour certains essais, nous transduites l'alloCTL avec des vecteurs de réplication rétroviraux (VRR) de codant pour Emerald Green (EMD) de la protéine fluorescente 10,11; pour OTHteurs, les cellules tumorales ont été transduites avec les vecteurs lentiviraux codant pour mStrawberry.
Le alloCTL ont été ensemencées à travers un canal du collecteur dans le centre de soit des monocouches de cellules tumorales ou ECM récoltées à partir de monocouches de cellules tumorales. Les interactions des cellules adhérentes et non adhérentes ont été visualisées par lumière et / ou par microscopie de fluorescence au cours du temps. Perturbation dans la monocouche de cellules tumorales à faible puissance, ou les cellules tumorales avec des noyaux fragmentés à forte puissance étaient indicateurs de dommage cellulaire par lyse et l'apoptose, respectivement. Nous numériquement créé cartes fluorescentes d'intensité de surface montrant la migration des cellules T fluorescent non-adhérentes sur les cultures en monocouche. Nous avons également noté la cytotoxicité engendré à la monocouche cellulaire de gliome adhérente après la formation du groupe de l'alloCTL non adhérente superposée. En outre, la transduction horizontal de RRV-EMD de la alloCTL à la monocouche de gliome a été observée.
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Protocol
1. Préparation de la lame
- Insérer des diapositives de Manifold cellule de sédimentation dans des sachets de stérilisation et sceller avec du ruban autoclave. La face avec revêtement téflon de la lame du côté papier de la poche pour éviter les dépôts de plastique sur les puits.
- Sachets autoclave pendant 15 min à 121 ° C.
- Sortir les lames du sachet de stérilisation à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique et placer dans un 150 x 15 mm boîte de Petri stériles. Jusqu'à quatre diapositives peut se adapter par plat. Placez un plat de 35 x 10 mm Petri à côté des diapositives. Ajouter 2-3 ml de H 2 O stérile pour procurer une humidification.
- Diapositives pré-enduire les poly-D-lysine à 100 pg / ml en utilisant un volume suffisant pour bien couvrir l'ensemble. Après une heure à température ambiante, aspirer la solution et rincer la surface du puits deux fois par du PBS 1x pipetage sur la surface des puits.
- Eventuellement, ajoutez la fibronectine ou d'autres composants de l'ECM pour assurer plus forte adhésion des cellules tumorales. Ajouter à la fibronectine 5 ug / ml dans tha assez de volumet les puits ne sèche pas dans un court laps de temps à la température ambiante.
- Après 1 h, aspirer la solution restes et laver deux fois par pipetage de haut en bas avec 1x PBS.
- Gardez PBS sur les puits jusqu'à ce que la tumeur est prêt pour le placage. Utilisation glisse le même jour.
- Récolter un flacon confluent du type de cellules tumorales adhérentes souhaitée. Compter les cellules viables à l'aide de bleu Trypan exclusion de colorant par microscopie optique et remettre en suspension à 5 x 10 6 cellules / ml en croissance par exemple de taille de manière adéquate tamponnée, milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), L- glutamine et pyruvate de sodium.
- Si l'imagerie de fluorescence de la population de cellules adhérentes est souhaitée, l'étiquette de la population de cellules adhérentes avec un colorant fluorescent ou un colorant vital de prolifération de cellules en suivant les protocoles fournis par le fabricant.
- Pipette en douceur 10 pi de milieu complet dans chaque puits de la prise en charge de diapositives prendre pour éviter la formation de bulles dans le wells, car ils peuvent empêcher l'adhérence uniforme des cellules tumorales.
- Ajouter 2,5 à 5,0 x 10 4 cellules (5-10 ul de suspension cellulaire) dans le milieu dans chaque puits (figure 1A). Ajuster le nombre optimal selon le type de cellule tumorale et le nombre de jours de croissance souhaités. Cellules tumorales ou des cellules plus grandes croissance rapide peuvent exiger moins de cellules initialement. Amener le volume du puits à 40 pi par addition de milieu et de la pipette de haut en bas pour assurer une distribution uniforme de cellules.
- Après tous les puits sont ensemencées, permettre aux cellules tumorales d'adhérer à la température ambiante, puis placez le couvercle sur le plat 150 x 15 mm Petri et soigneusement déplacer le plat à un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant au moins 24 h.
- Changer le milieu de culture quotidienne. Pipetter prudemment une partie du milieu usé de la monocouche et le remplacer par un milieu complet frais.
NOTE: En raison de l'évaporation, plus de volume devra être ajouté que ce qui était sorti. Wells sera prêt pour le dosage lorsqu'un même, confluent couche de cellules est présent. Ce est typiquement de 1 à 3 jours après l'ensemencement initial. - Lavez délicatement monocouche une fois avec PBS comme décrit dans l'étape 1.4 et soit passer à l'étape 2 si monocouches sont souhaitées, ou à l'étape 1.13 ci-dessous pour extraire les protéines d'ECM de la monocouche.
- Ajouter un Triton-X (v / v) solution à 0,5% dans du milieu complet et ajouter 30 ul à chaque puits. Soit en monocouche digérer hotte pendant 2 min, puis laver deux fois avec du milieu complet par pipetage tel que décrit ci-dessus.
NOTE: La couche d'ECM peut être visible par microscopie optique (figure 2). Utilisez diapositives tout de suite, ou de garder dans un milieu complet dans le humidifié incubateur à CO 2 pendant 1-2 jours. Ne pas laisser sécher les puits.
2. La sédimentation des cellules T non adhérentes sur la glissière
- Si l'imagerie de fluorescence de la population de cellules non-adhérentes est souhaitée, étiqueter les populations de cellules non-adhérentes avec un colorant fluorescent vitale, comme CFSE, Cell Tracker Rouge CMPTX ou eFluor670 en suivant les protocoles fournis par le fabricant au moins 1 heure avant l'essai. Alternativement, manipuler des cellules pour exprimer des protéines fluorescentes codées par des vecteurs viraux.
- Autoclave le collecteur de sédimentation des cellules dans un sachet en autoclave comme décrit au point 1.2 ci-dessus.
- Retirer la chambre humidifié contenant des lamelles recouvertes de Teflon de l'incubateur et le placer dans une enceinte de sécurité biologique.
- Laver les puits avec PBS 1x par pipetage de haut en bas, puis ajouter 45 ul de milieu complet contenant au moins 10% de sérum.
- Enlever le collecteur de l'enveloppe de stérilisation et soigneusement coulisser dans les puits au cours jusqu'à ce que le «crochet» à la fin de la rampe touche le fond de la glissière (figure 1B).
- Se assurer que le milieu de culture est visible dans chacun des canaux. Si aucun ne est considéré, enlever le collecteur et ajouter plus de support pour le bien correspondant, puis remplacer et vérifier de nouveau.
- Répétez l'étape 2.5 pour chaque channel du collecteur, ou pour autant de puits désiré.
- Compter les cellules non-adhérentes et remettre à pas moins de 1,0 à 2,0 x 10 5 / ul. Dresser une pi de cellules et de les introduire à la pipette dans le canal (figure 1C) lentement. Pour ce faire, pour chaque puits désiré.
- Laisser l'ensemble du dispositif chargé de la cellule, ce est-collecteur et glissière, l'intérieur de la bio-hotte pendant 20-30 minutes pour permettre aux cellules dans le canal de se déposer.
- Déposer le collecteur en touchant deux extrémités et doucement la soulevant de la lame afin de ne pas déranger les cellules focalement ensemencées dans le centre des puits (figure 1D).
- Inspecter chaque puits pour se assurer que les cellules non adhérentes ont été ensemencées avec succès au centre du puits en respectant la circonférence du canal collecteur. Les cellules non adhérentes seront idéalement légèrement adhérer à la monocouche ou ECM et à l'autre, donc déplacer doucement autour de la glissière ne entraînera pas la pelle cellulairet se disperser. Ne pas bousculer la diapositive.
3. Fluorescence Microscopy
- Avec un équipement expérimental approprié, effectuer l'imagerie après la sédimentation est confirmée. Idéalement, utiliser un microscope équipé d'une chambre de CO 2 et de l'humidité. L'image à faible puissance, ce est-4X ou 10X, afin de permettre plusieurs images à prendre une plus grande surface de telle sorte que la totalité du puits peut être vu.
- Acquérir des images numériques en utilisant un logiciel de capture d'image. Effectuer clair et / ou l'imagerie de fluorescence multi-canal.
- Si vous le souhaitez, mettre en place un time-lapse pour enregistrer des images de différents canaux sur une zone donnée, ou garder la diapositive humidifié et dans un / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C et manuellement prendre à l'image aux points de temps souhaités (Figure 1E & F, recommandée pour les points de temps plus longues).
4. Analyse et affichage
- En utilisant le logiciel de retouche d'image, de fusionner la lumière et flimages fluorescents en types de cellules une couche de sorte que plusieurs marqueurs et peut être vu dans la même image. Glissez et déposez les fichiers d'image pour chaque couleur dans le programme et, lorsque vous êtes invité, sélectionnez l'option «Ajouter un calque" pour créer un fichier d'image avec de multiples couches.
- A plus fort grossissement, prendre, aligner et assembler des images sur le bien numérique. Alignez fichiers en regardant les régions conservées entre deux images et de superposer une image sur le dessus de l'autre jusqu'à ce qu'une image complète est générée.
- Ajouter des barres de micron aux images lors de l'acquisition en utilisant le logiciel de capture pour déterminer la distance des cellules individuelles ont migré.
- Pour déterminer la migration des cellules à différents moments, faire des cartes de fluorescence d'intensité de surface avec le logiciel d'image, ce est à dire, ImageJ, de quantifier l'agrégation des cellules T fluorescent ou étalée dans le temps.
- Pour générer des parcelles de surface, prendre une image en couches généré à l'étape 4.1 et sous la fenêtre Calques,décochez toutes les couches sauf ceux correspondant à la chaîne souhaitée. Par exemple, si une parcelle de surface on souhaite visualiser l'expression EMD, seules les couches «verts» correspondant au filtre utilisé pour ce marqueur doit être visible.
- Aplatir l'image et l'enregistrer dans un format de fichier reconnu (par exemple, .png) et charger l'image dans le programme. Pour générer le tracé de la surface, changer le type d'image à 8 bits, modifier la luminosité / contraste nécessaire pour réduire fond, et sélectionnez l'option «Analyser Terrain / Surface. Les images de la figure 5 ont été générés par la vérification de la 'Ombre', 'Dessiner Axe »,« un polygone par ligne », et des cases à cocher« lisse ».
- Sinon, prendre des mesures en utilisant le rayon ou le diamètre du dépôt de la cellule focale au temps zéro et comparer aux cellules au point le plus extérieur à des moments différents. Le diamètre du puits est de Teflon 6,0 mm.
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Representative Results
Les vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes peuvent être utilisées en plus ou à la place de, un colorant fluorescent. Transduction virale doit être effectuée à l'avance de l'essai de motilité. Les deux types de cellules adhérentes et non adhérentes peuvent être différentiellement étiquetés. Le protocole de transduction dépendra du type de vecteur utilisé. Ici, nous transduites l'alloCTL dans les figures 3, 5 et 6 avec RRV-EMD au moins deux jours à l'avance de l'essai utilisant le protocole décrit 12. Nous avons également utilisé un vecteur lentiviral, CMV-fraise-IRES-FLUC2, pour la transduction de cellules tumorales pour exprimer la protéine fluorescente rouge mStrawberry (figure 4). Cette transduction a été réalisée en ajoutant le vecteur de la fiole de cellules pendant 48 heures, après quoi, du milieu frais a été ajouté. Après avoir laissé les cellules se rétablir pendant deux jours, une dilution limitante a été effectué pour générer une population de 100% de cellules transduites.
(figures 3 et 5) La microscopie à fluorescence. montre des cellules, initialement ensemencées au centre du puits, se éloignent du centre au fil du temps. La formation de alloCTL agrège après 4 heures (Figure 3, flèches blanches) reflète probablement des modèles de croissance autocrine exposées par activé, IL-2-production populations de cellules T 13.
Dans une autre expérience, effecteur murin alloCTL ont été faites par une voie MLR utilisant haplotypes H-2d Balb / c splénocytes répondeurs et haplotype H-2b / k splénocytes stimulatrices de souris B6C3F1, la souche à laquelle le gliome TU-2449 est syngénique. Immédiatement avant l'ensemencement par le canal de til manifold sur la monocouche de cellules tumorales, la alloCTL ont été colorées avec eFluor 670. Le alloCTL (cellules violets) ont été ensemencées dans le centre de monocouches établies de cellules de gliome TU-2449 (rouge) qui étaient 100% transduite avec le CMV-paille IRES-FLUC2 vecteur viral, et étalées sur des puits le jour avant le dosage. Figure 4A et B montrent des images microscopiques prises de la même quadrant du même bien à l'une et 48 h. Figure 4C et D ont été générés en utilisant ImageJ pour convertir la fluorescence violet numérisée intensités en parcelles de surface quantitatives qui sont affichées en format tridimensionnel.
Enfin, alloCTL humain ont été effectuées avec des cellules de cerveau-tropique humains stimulatrices inactivé provenant de la lignée cellulaire de tumeur du sein métastatique MDA-MB-231BR par MLTR. La figure 6 montre des images de microscopie optique et la fluorescence au cours du temps de non-adhérente alloCTL CMPTX marqué, partiellement transduites avec RRV-EMD, la migration sur les protéines ECM extraites felon les cellules tumorales. Dans (A) le domaine microphotographie lumineuse montre le placement focal de alloCTL immédiatement après la sédimentation. En (B et F) photomicrographies à fond clair montrent, à 4 et 8 h, respectivement, le alloCTL migration radialement à l'ECM. La densité alloCTL diminue avec la distance du centre du puits (centre de bien est coin supérieur gauche de champ dans BI). Panneaux (C et G) show la préparation de alloCTL toute tachée de CMTPX; (D et H) montrent transduction partielle de la alloCTL avec RRV-EMD comme indiqué par un petit nombre de cellules EMD + T, et (E et I) montrer les images fusionnées de la RRV-EMD transduction alloCTL la migration sur l'ECM avec le alloCTL non transduites.
Figure 2. monocouches de cellules tumorales et ECM étalées sur CSM puits de la lame. Photomicrographies de puits de diapositives préparéesavec des monocouches de cellules de gliome (A) U-confluente 87 mg, ou des protéines (B) de l'ECM extraites de confluence 87 mg U-colorées avec du colorant bleu de Coomassie. Bar = 200 um. Cliquez ici pour une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La migration et la cytotoxicité des DEC-EMD lymphocytes transduits au centre et le bord d'attaque du dépôt de cellules au fil du temps. Photomicrographies fluorescentes prises à divers moments au bord d'attaque et au centre de alloCTL-DEC-EMD suivante sédimentation sur une monocouche de cellules de gliome U-87 mg adhérentes. Effecteur alloCTL ensemencé les cellules simples, forment des grappes sphériques dans les 4 heures (flèches blanches) du placement. Simple marqué par fluorescence CTL ont migré du centre du puits unes le temps progresse. Après 24 h, les patchs de cellules vides dans la monocouche adhérente sont visibles probablement en raison de alloCTL cytolyse des cellules cibles tumorales (voir la zone au sein de tirets). Bar = 200 um. Cliquez ici pour une version plus grande de cette figure.
Figure 4. migration radiale des alloCTL murin colorées avec eFluor 670 sur les cellules de gliome mStrawberry marquées indiquées à 1 et 48 h. Photomicrographies fluorescentes d'un quadrant du même puits à (A) 1 h et (B) 48 heures après la sédimentation de fluorescence marqué au alloCTL non adhérente sur une monocouche de cellules de gliome TU-2449. Les microphotographies de faible puissance reflètent la zone comprise dans un quadrant de la CSM ainsi (rayon de 3 mm). A forte puissance (A et B, encarts) alloCTL (flèches blanches) sont présentées à proximité de ou associée à des cellules tumorales individuelles; on a une apparence désintégré avec des noyaux fragmentés et est apoptotique. cartes de fluorescence d'intensité (C et D) de surface respectives obtenues en utilisant le logiciel ImageJ montrant des valeurs de pixel des images fluorescentes pourpre numérisées sous forme graphique en trois dimensions et placés sur une grille représentant le rayon du puits de 3 mm. Bar = 500 um. Cliquez ici pour une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Migration des alloCTL et la propagation horizontale de DEC-EMD de alloCTL transduction des cellules tumorales. Photomicrographies fluorescentes série cousues ensemble pour couvrir le rayon du logiciel de retouche d'image et l'aide. Migration des DEC-EMD transductionalloCTL (flèches blanches) se affiche sur une monocouche de cellules tumorales U-87 mg à 0 et 72 h suivant la sédimentation. RRV-EMD transduction de cellules tumorales dans la monocouche est également apparent à 72 h après l'addition de la alloCTL EMD-transduites, ce qui indique que la transmission horizontale de RRV infectieux à partir de lymphocytes à des cellules tumorales a eu lieu (zone blanche, et encadré). Bar = 200 um. Cliquez ici pour une version plus grande de cette figure.
Figure 6. migration radiale des alloCTL transduction avec RRV-EMD et coloré avec CellTracker Rouge CMTPX. Les cellules ont été sédimentées sur ECM extraits provenant de cellules MDA-MB-231BR. Migration des alloCTL a été imagée par microscopie lumineuse de la lumière de champ à 0, 4 et 8 h (A, B, F colonne 1, respectivement). Fluoreimages de parfum de la CMPTX (rouge) étiquetés alloCTL (C, G, colonne 2), le RRV-EMD (vert) transduction alloCTL (D, H, colonne 3), et les images fusionnées (E, I, colonne 4) sont montré à 4 et 8 h. Bars = 200 um; Bar montré en B applicable aux images CI. Cliquez ici pour une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les cellules tumorales dans une suspension de cellules uniques ont été introduits à la pipette dans les puits d'une lame de téflon masqué. Les cellules ont été laissées à adhérer et ensuite formé des monocouches dans un humidifiée à 5% de CO2, 37 ° C incubateur (figure 1A). Monocouches établies ou des protéines de la MEC dérivés de la monocouche peuvent être récoltées pour ces dosages (figure 1B). Lymphocytes T effecteurs marqués avec des colorants fluorescents vitaux ou transduites avec des vecteurs codant pour des EMD ont été ensemencées dans le centre du puits en utilisant un CSM. La capacité des lymphocytes T effecteurs non-adhérentes à migrer sur la monocouche ou ECM protéines au fil du temps a ensuite été évalué et quantifié avec la lumière et la microscopie à fluorescence. Ici, nous avons évalué la migration et la cytotoxicité des effecteur non adhérente alloCTL sur une monocouche de cellules U-87 mg gliome cibles partiellement pertinente (figures 3 et 5). Ces cellules cibles, afficher seulement une partie de l'antigène d'histocompatibilité humain(HLA) molécules (HLA-A2, B44) figurant sur les originaux, les stimulateurs ont été utilisés pour réduire l'activité lytique puissant qui serait affichée par l'alloCTL aux cellules cibles de 13 à 06 MG-compétentes (HLA-B44 et A1,2 , 57). Nous avons également observé la mobilité de la alloCTL sur ECM récoltées à partir d'une monocouche de cellules de tumeur du sein MDA-MB-231BR (figure 6). Le alloCTL ont été généré par une voie MLTR selon des méthodes déjà publiées neuf. Effecteur alloCTL ont été récoltés après 4 à 5 jours à sens unique et MLTR transduite avec RRV-GS4-EMD (figures 3 et 5) ou RRV-EMD-ACE (figure 6) 10,11. Les niveaux de transduction élevées ont été obtenus avec le vecteur en utilisant un GS4 enveloppe du virus de la leucémie singe Gibbon qu'avec le vecteur amphotrope de l'ECA. L'utilisation de ce test de migration radiale, nous avons constaté que les deux transduites et nontransduced marqué par fluorescence alloCTL avait la capacité migratoire. Nous démontrons également qu'ils conservent leur capacité à être CYTotoxic après avoir subi une transduction manipulations pour RRV.
La capacité de migrer à alloCTL murin a également été évaluée (figure 4). alloCTL sensibilisés à l'haplotype H-2b / k affichée par les cellules TU-2449 ont été colorées avec eFluor 670 (violet) et un essai de migration a été réalisée à l'aide TU-2449 transduite avec CMV-paille-IRES-FLUC2 (rouge). Lors de l'utilisation cible entièrement échéant, une diminution du nombre de cellules effectrices ont été ensemencées alloCTL pour empêcher la lyse rapide des cibles de cellules tumorales. Utilisation de 1 h comme base de référence, les cellules T sont en grande partie localisés à haute densité dans le centre du puits comme une suspension cellulaire unique. Les 48 micrographies h montrent vaste migration des cellules vers le bord extérieur du puits et le regroupement de la alloCTL T est évident avec la destruction des cellules tumorales sur le site de leur dépôt initial. La prolifération des cellules TU-2449 est mis en évidence que la mStrawberry cellules marquées augmentation de la densité sur le puits. Ce est mieux vu dans la surfaceTerrain de fluorescence qui ont été générés pour visualiser la distribution des cellules dans les puits pourpre (Figure 4, panneau inférieur). AlloCTL mobilité est beaucoup plus évident dans le puits à 48 h par rapport à la ligne de base de 1 h. Similaires à ce qui a été vu dans les essais utilisant des cellules de gliome humain et alloCTL, un dégagement de cellules tumorales autour de la zone du dépôt initial d'effecteurs est perceptible à 48 h, ce qui suggère la lyse des cellules cibles tumorales.
Une étape critique dans cet essai est la croissance de monocouches sains et la récolte ultérieure de ECM 'squelette'. Ensemencement des cellules tumorales à 2,5 à 5,0 x 10 4 cellules par puits, selon l'étape 1.9 ci-dessus, généralement entraîné une monocouche à peu près, même pour les types de cellules tumorales, nous avons utilisé. Nous avons trouvé qu'il est essentiel pour permettre aux cellules tumorales d'adhérer à la température ambiante, sinon la convection qui se produit à 37 ° C va pousser les cellules vers le centre du puits. Ainsi, pré-revêtement du puits wie poly-D-lysine et / ou une protéine d'ECM tels que la fibronectine ou le collagène peut augmenter considérablement le taux de réussite. En outre, nous avons eu plus de succès avec ces tests utilisant ECM monocouche dérivés 'du squelette »que les différents composants de l'ECM (ie., La fibronectine, collagène), qui se sont avérés beaucoup moins fiables. Il est important de tester le nombre de cellules non adhérentes de déposer à travers le collecteur de sédimentation ainsi, et si l'on utilise un type cellulaire pure, on pourrait théoriquement être en mesure de définir un coefficient de motilité avec ce dosage. Parce que le volume du puits est faible et évaporation du milieu certains cas, la monocouche doit être réapprovisionné chaque jour avec du milieu frais. remplacement des médias empêche également l'accumulation de lactate toxiques que les cellules croissent et se divisent. Le défaut de cultiver une monocouche saine peut entraîner une perte de la monocouche ou ECM de la surface du puits.
Les bleus protéines ECM colorés Coomassie provenant de la cellule de gliome li U-87 mgNE conformément à l'étape 1.13 ci-dessus sont indiqués à titre d'exemple visuel de la couche adhérente de substrat laissé après digestion avec du Triton X-100 (figure 1B). production d'ECM d'une lignée cellulaire de carcinome du sein, des cellules MDA-MB-231BR, était souvent inégale et mince, ayant pour résultat une couche d'ECM qui est plus faiblement adhérente et parfois soulevé de la glissière pendant le test. La protéine ECM adhérence améliorée à la lame lorsque les cellules tumorales ont été maintenues sous forme de monocouches confluentes pendant 1-2 jours avant la digestion. Tout au long du procédé, le maintien de la garniture en Teflon entourant le puits est également importante. Maintenir le volume bas et en minimisant l'exposition du Téflon à la solution de Triton-X100 atténué atteinte à l'intégrité du joint d'étanchéité en téflon.
Une adaptation de ce protocole pourrait être l'utilisation d'une matrice extracellulaire tridimensionnelle récoltées à partir de sections de l'OCT tissu tumoral embarqué 14. Toutefois, il convient de noter que la distance entre le plat Bottainsi OMED à la surface de glissement est seulement 1 mm; Ainsi, rubriques dépassant cette épaisseur peuvent être perturbés par le placement collecteur. En outre, un procédé devrait être conçu pour réaliser un léger trou de trépan dans le tissu à accepter la goutte de milieu contenant les cellules non adhérentes.
Préparation d'une suspension cellulaire unique bien dispersé des lymphocytes T effecteurs à l'avance de sédimentation était également impératif. Trituration douce des cellules T non-adhérentes à disperser les agrégats à une suspension de cellule unique était une étape essentielle avant de charger le droit alloCTL dans les canaux de la CSM. L'utilisation de tampons non enzymatiques de dissociation cellulaire devrait être utilisé si nécessaire. En outre, la densité des lymphocytes effecteurs devrait être d'environ 1,0 à 2,0 x 10 5 cellules / ul de sédimentation, comme décrit à l'étape 2.8 ci-dessus. Le faible nombre de cellules peut entraîner aucune sédimentation, tandis que le nombre de cellules plus élevées peuvent causer un grand dépôt qui est facile à perturber lors du déplacement duglisser. Il est également recommandé que la concentration de sérum dans le milieu soit au moins 10% de fournir la tension de surface adéquate du ménisque qui réduit la possibilité de débordement.
Un microscope optique inversé avec des capacités d'imagerie à fluorescence et un 4x ou 10x objectifs est optimale pour ce dosage. Les points de temps pour l'imagerie peuvent être déterminées selon des enquêtes expérimentales individuelles et types de cellules. Les CTL anti-adhérent en particulier migrent à partir du centre de la sédimentation vers le bord du puits plus rapidement sur les protéines d'ECM (4-8 hr) que sur une monocouche de cellules (12 à 72 h). Les cellules cibles pertinentes partiellement CMH sont préférables à des cibles pertinentes pour notre essai de alloCTL pour favoriser la visualisation de la motilité et de réduire la cytolyse à médiation cellulaire des monocouches avant la migration significative peut se produire; l'utilisation d'une faible effecteur de cibler rapport ralentit également la lyse. L'utilisation de cibles partiellement appariées permet une meilleure visualisation des RRVtransmission de cellules tumorales aussi bien.
Utilisation d'un microscope inversé offre plusieurs avantages par rapport à une étendue verticale. Un champ inversé permet pour l'imagerie à travers la chambre humidifiée de sorte que les diapositives ne ont pas à être dérangé, tout en maintenant un environnement stérile pour les cellules. En outre, l'imagerie à travers la chambre fournit une barrière entre l'échantillon et le technicien, ce qui permet le respect de niveau de biosécurité II directives (LSB II) lorsque l'on travaille avec des tissus d'origine humaine 15.
Si vous utilisez un champ debout, le plus fort grossissement réalisable sans perturber le ménisque du puits est 20x. Malheureusement, l'utilisation d'une lamelle couvre-objet, ou des trousses pour l'optique de la tubulure de sédimentation des cellules, ne est pas recommandée, car la perturbation de la surface du bain se traduit généralement par l'étalement des cellules non adhérentes sédimentées dans l'ensemble du puits. Imagerie sur de longues périodes de temps peut exiger plus attentive de medium à chaque puits pour remplacer celle perdue par évaporation, mais ce ne est plus susceptible d'être requise lors de l'imagerie time-lapse.
Ce protocole est distincte de méthodes qui mesurent la migration cellulaire horizontale de cellules adhérentes dans Zigmond Chambers 16,17, la conception de ce qui ne permettrait pas pour la visualisation de la migration des cellules non-adhérentes. D'autres dosages qui évaluent la migration horizontale vers un gradient chimiotactique par l'intermédiaire d'un substrat tel que la gélose sont généralement utilisées pour étudier la migration d'un type de cellule de 18 à 20. Utilisation de la CSM fournit plusieurs avantages à ces méthodes, ainsi que des procédés qui mesurent vertical migration / invasion de cellules cultivées, par exemple dans des chambres de Boyden ou des plaques Transwell Matrigel. Tout d'abord, le contact cellule-cellule permet une détermination de l'interaction cible-effecteur cellulaire et les blessures par des cellules effectrices. La capacité cytolytique des alloCTL-RRV-EMD initialement stimulée par unidirectionnel MLTR avec des cellules tumorales 13 à 06 MG-stimulatrices de la partilignée cellulaire U-87 mg allié MHC-identifié est évident dans le centre de la monocouche à 24 et 72 heures suivant la sédimentation (figures 3 et 5, les lignes en pointillés). En outre, la dégradation des cellules TU-2449 par alloCTL murin est visible à 48 h post-sédimentation (Figure 4). La monocouche est oblitérée au centre de dépôt alloCTL, mais se produit plus lentement au cours du reste de la monocouche, soit en raison du chevauchement de l'expression de HLA de 13 à 06 mg et 87 mg de U dans les dosages avec des cellules humaines 21 ou le bas nombre de cellules effectrices de départ pour le gliome murin. En outre, l'effecteur à une cible, la densité est réduite par l'effecteur alloCTL migrer en dehors du site de sédimentation. En plus de la migration et de la cytolyse, ce protocole peut être utilisé pour visualiser le transfert des protéines fluorescentes de codage de virus. Ici, le transfert de RRV codant pour EMD de la alloCTL de cellules tumorales est évidente après 72 h (Figure 5, encadré).
Une limite de ce modèle est que la migration ne peut être évaluée in vitro, qui ne peut être réellement représentative de la migration in vivo. Une autre limitation est que les gradients de récepteurs de chimiokine / chimiokine ne peuvent être établies selon le modèle. Alors que les interactions des cellules immunitaires avec ECM ou des cellules tumorales individuelles peuvent encore se produire et dépendra de ce que ces cellules sécrètent ou d'exprimer, ce motilité culay ne serait pas répondre à des questions à savoir si les cellules non-adhérentes vont migrer spécifiquement ou plus loin de facteurs isolés.
Un avantage de ce test est la capacité de déterminer si une population de cellules non adhérentes maintenir la fonctionnalité de migration si les lymphocytes ont ou ne ont pas été transduites. Dans notre exemple, la sous-population transduite est visible à travers EMD expression de la protéine, et il est clair que la fonctionnalité de migration est maintenue dans cette sous-population. Une application plus large pourrait être de tester les effets de diverses concentrations d'agents ou de médicaments qui pourraient influer sur la migration cellulaire non adhérente immunitaire. En outre, d'autres cellules hématopoïétiques peuvent être testés pour la mobilité sur divers substrats ou des cellules adhérentes provenant de tissu normal. Enfin, même se il ne est pas fait ici, l'ensemencement d'une combinaison de types de cellules adhérentes, ce est à dire, les cellules stromales ou les cellules dendritiques avec la tumeur, peuvent fournir des analyses reflètent plus complexe dans des environnements in vivo.
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Acknowledgments
Soutenu en partie par NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / RNTAC UCLA CTSI Grant Nombre UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, et le Fonds de recherche Joan S. Holmes Memorial. MJH et GCO reçus soutenus de la Joan S. Holmes Memorial postdoctorale à l'UCLA. Le dispositif CSM a été obtenu à partir de Creative méthodes scientifiques: www.creative-sci.com. Le vecteur lentiviral a été reçue de la UCLA Vecteur de base, qui est soutenu par CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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