Abstract
Riportiamo un romanzo adattamento del dosaggio migrazione cellulare Monolayer radiale, prima riferito a misurare la migrazione radiale delle cellule tumorali aderenti su proteine della matrice extracellulare, per misurare la motilità, umane non aderente o effettrici murine cellule immunitarie fluorescenza marcata. Questa tecnica utilizza un collettore in acciaio inox e 10 ben scorrevole in Teflon per depositare focally cellule T non aderenti nei pozzetti preparati sia con monostrati confluenti di cellule tumorali o proteine della matrice extracellulare. Luce e / o multicanale microscopia a fluorescenza viene utilizzato per monitorare il movimento e il comportamento delle cellule effettrici nel tempo. Coloranti fluorescenti e / o vettori virali che codificano per transgeni fluorescenti sono usati per etichettare in modo differenziato i tipi di cellule per l'imaging. Questo metodo è distinto da simile tipo in vitro che traccia orizzontale o verticale migrazione / invasione utilizzando camere di diapositive, agar o transwell piatti. Il test permette di dati dettagliati di imaging a Be raccolti con differenti tipi cellulari caratterizzati da marcatori fluorescenti specifici; anche sottopopolazioni di cellule specifiche (ad esempio, trasdotte / nontransduced) possono essere monitorati. Superficie trame fluorescenza intensità vengono generati utilizzando i canali di fluorescenza specifici corrispondenti al tipo di cellula migrazione. Questo permette una migliore visualizzazione della mobilità non aderenti delle cellule immunitarie in momenti specifici. È possibile raccogliere prove di altre funzioni delle cellule effettrici, quali citotossicità o il trasferimento di vettori virali da effettore alle cellule bersaglio, pure. Così, il metodo permette ai ricercatori di documentare microscopicamente cellula-cellula interazioni di differenzialmente-marcato, non aderente con cellule aderenti di vario tipo. Tali informazioni possono essere particolarmente rilevanti nella valutazione di tipi di cellule immunitarie biologicamente manipolati o attivati, in cui la prova visiva della funzionalità si desideri con cellule bersaglio tumorale prima di utilizzarli per la terapia del cancro.
Introduction
Il test di migrazione cellulare monostrato Radial è stato originariamente sviluppato per misurare le proprietà infiltrative delle cellule tumorali aderenti 1-4 su vetrini rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine 5-7 o con i componenti ECM individuali, come la fibronectina o laminina 1,2. La tecnica coinvolto seminare una sospensione di cellule singole cellule tumorali nel centro di pozzetti usando un collettore sedimentazione cellulare acciaio inossidabile (CSM). Dopo sedimentazione, le cellule tumorali sarebbero aderire al fondo del pozzo e la variazione del diametro della popolazione cellulare iniziale nel tempo usato per stabilire un tasso di motilità orizzontale. Il test di migrazione cellulare monostrato Radial ha fornito un vantaggio visivo rispetto ad altri metodi esistenti che impiegavano transwell piastre per saggio le capacità migratorie in vitro di cellule; questi test non sono favorevoli alla formazione immagine 8. Come pure, ha fornito anche una grande quantità di libertà nella scelta del timepoints in sede di valutazione della migrazione, senza alcun limite al numero di timepoints un ricercatore potrebbe scegliere di immagine dopo la sedimentazione.
Poiché la capacità di migrare è una funzionalità importante per le cellule non aderenti, soprattutto nella zona di immunoterapia o dove possono essere utilizzate come veicoli di consegna per vettori virali, abbiamo adattato l'uso del CSM per valutare la migrazione di cellule non aderenti tipi su monostrati di cellule tumorali, in aggiunta alle proteine ECM. Il vantaggio di microscopicamente visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti su monostrati di cellule tumorali vitali, il ECM complesso isolato dal tumore, o sui componenti ECM singoli rende questo test versatile. Saggi che utilizzano pozzi rivestiti con una singola proteina extracellulare non riflettono accuratamente il substrato tessuti ECM o tumore delle cellule sarebbero migrare attraverso in vivo.
Qui, abbiamo usato alloreattivi linfociti T citotossici (alloCTL), sensibilizzati ai principali histocompcomplesso atibilità (MHC) proteine utilizzando reazioni a senso unico di cellule tumorali linfocitaria mista (MLTR) o reazioni linfociti misti (MLR) 9, come il nostro tipo di cella non aderente rappresentante. Abbiamo testato le celle sia di origine umana e murina. Quando la migrazione è stata misurata su monostrati tumorali, le cellule tumorali sono state impiegate obiettivi parzialmente rilevanti, mostrando alcune delle stesse proteine MHC presenti nella popolazione cellulare utilizzato per sensibilizzare gli effettori, o obiettivi pienamente rilevanti, con una serie completa di molecole MHC che la effettori erano stati sensibilizzati verso. In alcuni esperimenti, abbiamo usato CellTracker fluorescente Red CMPTX o proliferazione cellulare dye eFluor 670 di distinguere tra cellule effettrici e di destinazione. Abbiamo anche utilizzato la trasduzione con codifica vettori virali per proteine fluorescenti come un ulteriore modo per visualizzare le cellule. Per alcuni test, abbiamo transdotte la alloCTL con vettori retrovirali replicanti (RRV) che codificano per Emerald Green (EMD) proteina fluorescente 10,11; per OTHERS, le cellule tumorali sono state trasdotte con vettori lentivirali codificanti per mStrawberry.
Il alloCTL sono stati seminati attraverso un canale del collettore al centro di entrambi i monostrati di cellule tumorali o ECM raccolti da monostrati cellulari tumorali. Interazioni delle cellule aderenti e non aderenti sono state visualizzate mediante luce e / o mediante microscopia a fluorescenza nel tempo. Turbativa in monostrato cellula tumorale a bassa potenza, o tumore cellule con nuclei frammentati ad alta potenza sono indicatori di danno cellulare da lisi e apoptosi, rispettivamente. Abbiamo creato digitalmente mappe fluorescenti di intensità superficie che mostrano la migrazione di cellule fluorescenti T non aderenti sulle colture monostrato. Abbiamo notato anche la citotossicità generato per l'aderente monostrato cellulare glioma dopo la formazione di cluster del sovrapposto alloCTL non aderente. Come pure, è stato osservato trasduzione orizzontale RRV-EMD dalla alloCTL al monostrato glioma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Far scorrere Preparazione
- Inserire sedimentazione cellulare slide collettore in sacchetti di sterilizzazione e sigillare con nastro autoclave. Affrontare il lato rivestito di teflon della slitta della carta lato del sacchetto per evitare depositi di plastica sui pozzetti.
- Sacchetti autoclave per 15 min a 121 ° C.
- Rimuovere il vetrino dalla busta di sterilizzazione in un armadio biosicurezza e posto in un 150 x 15 mm piastra di Petri sterile sterile. Fino a quattro diapositive può andare bene per ogni piatto. Inserire un piatto 35 x 10 mm Petri accanto alle diapositive. Aggiungere 2-3 ml di H 2 O sterile per fornire umidificazione.
- Vetrini pre-cappotto con poli-D-lisina a 100 mcg / ml usando un volume sufficiente per coprire bene l'intero. Dopo un ora a RT, aspirare la soluzione e risciacquare la superficie del pozzetto due volte pipettando 1x PBS sulla superficie dei pozzetti.
- Facoltativamente, aggiungere fibronectina o altri componenti ECM per garantire maggiore aderenza del tumore delle cellule. Aggiungi fibronectina a 5 mg / ml in un volume sufficiente that pozzetti non sarà asciutto entro un breve periodo di tempo a temperatura ambiente.
- Dopo 1 ora, aspirare la soluzione rimanente e lavare due volte pipettando su e giù con 1x PBS.
- Mantenere PBS sui pozzetti fino tumore è pronta per la placcatura. Utilizzare scorre lo stesso giorno.
- Raccolto un pallone confluente del aderenti tipo cellula tumorale desiderato. Contare cellule vitali utilizzando Trypan Blue dye esclusione di microscopia ottica e risospendere a 5 x 10 6 cellule / ml in crescita esempio medio per adeguatamente-buffered, mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino 10% (FBS), L- glutamina e piruvato di sodio.
- Se si desidera l'imaging fluorescente della popolazione di cellule aderenti, etichettare la popolazione di cellule aderenti con un colorante fluorescente vitale o un colorante proliferazione cellulare seguendo i protocolli forniti dal produttore.
- Uniformemente pipetta 10 ml di terreno completo in ogni pozzetto della cura slitta prendere per evitare di creare bolle in wells, in quanto questi può prevenire uniforme adesione delle cellule tumorali.
- Aggiungere 2,5-5,0 x 10 4 cellule (5-10 microlitri di sospensione cellulare) al mezzo in ogni pozzetto (Figura 1A). Regolare il numero ottimale a seconda del tipo di cellule tumorali e il numero di giorni di crescita desiderati. Cellule tumorali più grandi o cellule in rapida crescita potrebbero richiedere un minor numero di cellule inizialmente. Portare il volume ben fino a 40 microlitri aggiungendo medio e pipetta su e giù per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule.
- Dopo tutti i pozzetti sono teste di serie, permette alle cellule tumorali di aderire a RT, quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri di 150 x 15 mm e con attenzione spostare il piatto per un 37 ° C / 5% di CO 2 incubatore umidificato per almeno 24 ore.
- Cambiare il terreno di coltura quotidiano. Pipettare attentamente una porzione del mezzo esaurito dal monostrato e sostituirlo con terreno fresco completa.
NOTA: A causa di evaporazione, più volume dovrà essere aggiunto che è stato tolto. Wells sarà pronto per il dosaggio quando ancora, conflconfluente strato di cellule è presente. Questo è in genere 1-3 giorni dopo la semina iniziale. - Lavare monostrato delicatamente una volta con PBS come descritto al punto 1.4 e sia passare al punto 2, se si desiderano monostrati, o al punto 1.13 sotto per estrarre proteine ECM dal monostrato.
- Fare un (v / v) 0,5% Triton-X in mezzo completo e aggiungere 30 microlitri di ogni bene. Lasciate monostrato digerire in cappuccio per 2 minuti, poi lavare due volte con terreno completo pipettando come descritto sopra.
NOTA: Lo strato ECM può essere visibile al microscopio ottico (Figura 2). Utilizzare vetrini subito, o di tenere in terreno completo in umidificata CO 2 incubatore per 1-2 giorni. Evitare che i pozzetti si asciughino.
2. La sedimentazione di cellule T non aderenti su diapositive
- Se si desidera l'imaging a fluorescenza della popolazione di cellule non-aderenti, etichettare le popolazioni di cellule non-aderenti con un colorante fluorescente vitale, come CFSE, Tracker Red Cell CMPTX, o eFluor670 seguendo i protocolli forniti dal produttore di almeno 1 ora prima del test. In alternativa, manipolare le cellule di esprimere proteine fluorescenti codificate dai vettori virali.
- Autoclavare collettore sedimentazione delle cellule in un sacchetto autoclave descritta sopra 1.2.
- Rimuovere la camera umidificata contenente vetrini rivestiti in teflon dal termostato e posto in cella di sicurezza biologica.
- Lavare i pozzetti con PBS 1x pipettando su e giù, poi aggiungere 45 ml di terreno completo contenente% di siero di almeno 10.
- Rimuovere il collettore dalla busta di sterilizzazione e far scorrere con attenzione in oltre pozzetti fino al 'gancio' alla fine del collettore tocca la parte inferiore della slitta (Figura 1B).
- Assicurarsi che il terreno di coltura è visibile in ciascuno dei canali. Se non si vede, togliere il collettore e aggiungere più medio corrispondente bene, quindi sostituire e controllare di nuovo.
- Ripetere il passaggio 2.5 per ogni chanNel del collettore, o a molti pozzi lo desideri.
- Contare le cellule non aderenti e risospendere a non meno di 1,0-2,0 x 10 5 / ml. Redigere 1 ml di cellule e lentamente li pipetta nel canale (Figura 1C). Fate questo per ogni bene desiderato.
- Lasciare l'intera cella apparecchiatura caricata, cioè, collettore e scorrevole, all'interno della bio-cappuccio per 20-30 minuti per consentire alle cellule nel canale di stabilirsi.
- Rimuovere il collettore toccando entrambe le estremità e delicatamente sollevandolo verso l'alto dalla slitta in modo da non disturbare le cellule focally seminate nel centro dei pozzi (Figura 1D).
- Controllare ciascun pozzetto per assicurare che le cellule non aderenti sono state seminate con successo al centro del pozzo rimanere all'interno della circonferenza del canale collettore. Le cellule non aderenti saranno idealmente leggermente aderire al monostrato o ECM e tra loro, quindi spostando delicatamente il vetrino attorno non causerà la pelle cellulet per disperdere. Non jostle la diapositiva.
3. microscopia a fluorescenza
- Con adeguate attrezzature sperimentali, eseguire imaging dopo sedimentazione è confermato. Idealmente, utilizzare un microscopio che è dotato di una camera di CO 2 e umidità. Immagine a bassa potenza, cioè, 4X o 10X, per consentire più immagini da prendere di un'area più grande in modo che la totalità del pozzo può essere visto.
- Acquisire le immagini digitali utilizzando il software di acquisizione delle immagini. Eseguire campo chiaro e / o multi-canale di imaging di fluorescenza.
- Se lo si desidera, impostare un time-lapse di registrare immagini in canali diversi su una determinata zona, o mantenere la diapositiva umidificata e in un / 5% di CO 2 incubatore 37 ° C e manualmente togliere all'immagine nei momenti desiderati (Figura 1E e F, consigliato per i punti di tempo più lungo).
4. Analisi e display
- Utilizzando immagini software di editing, fondere luce e flimmagini fluorescenti in un livello in modo più tipi di cellule e marcatori possono essere visti nella stessa immagine. Trascinare i file di immagine per ogni singolo colore nel programma e, quando richiesto, selezionare l'opzione 'Aggiungi Layer' per creare un file immagine con più livelli.
- A maggiore ingrandimento, prendere, allineare e cucire insieme le immagini di tutto il bene digitale. Allineate file cercando in regioni conservate tra due immagini e sovrapponendo un'immagine sopra l'altra fino viene generato un quadro completo.
- Aggiungere bar micron alle immagini durante l'acquisizione utilizzando il software di cattura per determinare la distanza singole celle sono migrati.
- Per determinare la migrazione delle cellule in vari momenti, fare mappe fluorescenza intensità superficie con software di immagini, cioè, ImageJ, per quantificare l'aggregazione delle cellule T fluorescente o diffusi nel corso del tempo.
- Per generare grafici di superficie, prendere un'immagine stratificata generato nella fase 4.1 e sotto la finestra Livelli,deselezionare tutti i livelli tranne quelle corrispondenti al canale desiderato. Per esempio, se un grafico della superficie si desidera visualizzare espressione EMD, solo gli strati "verdi" corrispondenti al filtro utilizzato per questo marcatore dovrebbero essere visibili.
- Appiattire l'immagine e salvarla in un formato di file riconosciuti (ad esempio, .png) e caricare l'immagine nel programma. Per generare la trama della superficie, modificare il tipo di immagine a 8-bit, modificare la luminosità / contrasto come necessario per ridurre il fondo, e selezionare l'opzione 'Analizza / Surface Plot'. Le immagini in figura 5 sono stati generati controllando il 'Ombra', 'Draw Axis', 'un poligono Per Line', e caselle di controllo 'liscio'.
- In alternativa, prendere misurazioni utilizzando il raggio o il diametro dal deposito cellulare focale al tempo zero e confrontarle con le cellule al punto più esterno in tempi diversi. Il diametro del Teflon pozzi è del 6,0 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vettori virali codificanti per proteine fluorescenti possono essere utilizzati in aggiunta o al posto di, colorante fluorescente. Trasduzione virale deve essere eseguita prima del dosaggio motilità. Entrambi i tipi di cellule aderenti e non aderenti possono essere differenzialmente etichettati. Il protocollo per la trasduzione dipenderà dal tipo di vettore impiegato. Qui, trasdotte il alloCTL nelle figure 3, 5 e 6 con RRV-EMD almeno due giorni di anticipo del test utilizzando il protocollo descritto 12. Abbiamo anche usato un vettore lentivirale, CMV-fragola-IRES-FLUC2, per trasdurre le cellule tumorali per esprimere la proteina fluorescente rossa mStrawberry (Figura 4). Questo trasduzione stato realizzato aggiungendo il vettore al pallone di cellule per 48 ore, a questo punto, è stato aggiunto mezzo fresco. Dopo permettendo alle cellule di recuperare per due giorni, limitando la diluizione è stata eseguita per generare una popolazione di cellule trasdotte 100%.
(figure 3 e 5). La microscopia a fluorescenza mostra cellule, inizialmente seminate al centro del pozzo, migrano dal centro nel tempo. La formazione di aggregati alloCTL dopo 4 ore (Figura 3, frecce bianche) è probabile riflesso di modelli di crescita autocrini esposti da attivato, IL-2 produttori di popolazioni di cellule T 13.
In un altro esperimento, effettrici murino alloCTL sono state fatte da una via MLR con aplotipo H-2d Balb / c splenociti risponditore e aplotipo H-2b / k splenociti stimolatore da topi B6C3F1, il ceppo a cui il glioma TU-2449 è singenico. Immediatamente prima della semina attraverso il canale di tegli molteplice sul monostrato di cellule tumorali, il alloCTL sono stati colorati con eFluor 670. La alloCTL (cellule viola) sono stati seminati nel centro di monostrati consolidati di cellule di glioma TU-2449 (rosso) che erano al 100% trasdotto con il CMV-paglierino IRES-FLUC2 vettore virale, e placcato in pozzi il giorno prima del test. Figura 4A e B mostrano immagini microscopiche prese dello stesso quadrante dello stesso bene a 1 e 48 ore. Figura 4C e D sono stati generati utilizzando ImageJ per convertire digitalizzata fluorescenza viola intensità nelle trame di superficie quantitativi che vengono visualizzate in formato tridimensionale.
Infine, alloCTL umana stata fatta con cellule cerebrali-tropico umani stimolatore inattivato derivate dalla linea cellulare di tumore metastatico della mammella MDA-MB-231BR da MLTR. Figura 6 mostra immagini chiare e microscopia a fluorescenza nel tempo di non aderente CMPTX marcato alloCTL, parzialmente trasdotte con RRV-EMD, migrazione sulle proteine estratte ECM fROM quelle cellule tumorali. In (A) il campo microfotografia luminoso mostra il posizionamento focale alloCTL subito dopo la sedimentazione. In (B e F) microfotografie campo luminose mostrano, a 4 e 8 ore, rispettivamente, la migrazione alloCTL radialmente sul ECM. La densità alloCTL diminuisce con la distanza dal centro del pozzo (centro di pozzo è alto a sinistra di campo in BI). Pannelli (C e G) spettacolo l'intera preparazione alloCTL colorate con CMTPX, (D e H) mostrano trasduzione parziale del alloCTL con RRV-EMD come indicato da un piccolo numero di cellule EMD + T, e (E e I) mostrano le immagini unite della RRV-EMD trasduzione alloCTL migrazione sul ECM insieme al alloCTL non trasdotte.
Figura monostrati di cellule tumorali e 2. ECM placcato sui pozzetti dei vetrini CSM. Microfotografie di pozzetti dei vetrini preparaticon (A) confluenti U-87MG monostrati cellulari di glioma, o proteine (B) ECM estratti da confluenti U-87MG colorati con Coomassie colorante blu. Bar = 200 micron. Fai clic qui per una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Migrazione e citotossicità di RRV-EMD linfociti trasdotti al centro e bordo anteriore del deposito di cellule nel tempo. Microfotografie fluorescenti adottate varie volte all'avanguardia e al centro di alloCTL-RRV-EMD seguente sedimentazione su un monostrato di cellule di glioma U-87MG aderenti. Effector alloCTL testa di serie come singole cellule, formano ammassi sferici all'interno di 4 ore (frecce bianche) di posizionamento. Singolo fluorescenza marcata CTL sono migrati dal centro del pozzo untempo s progredisce. Dopo 24 ore, le patch cella vuota nella monostrato aderenti sono visibili presumibilmente a causa di alloCTL citolisi delle cellule bersaglio tumorale (vedi area all'interno trattini). Bar = 200 micron. Fai clic qui per una versione più grande di questa figura.
Figura 4. migrazione radiale di alloCTL murino macchiato di eFluor 670 su cellule di glioma mStrawberry-etichettati mostrato a 1 e 48 ore. Microfotografie fluorescenti di un quadrante della stessa pozzo a (A) 1 ora e (B) 48 ore dopo la sedimentazione di fluorescenza -labeled alloCTL non aderente su un monostrato di cellule di glioma TU-2449. Le microfotografie bassa potenza riflettono l'area contenuta all'interno di un quadrante della CSM ben (raggio 3 mm). Ad alta potenza (A e B, inserti) alloCTL (frecce bianche) sono presenti in prossimità o associato con le cellule tumorali singole; uno ha un aspetto disintegrata con nuclei frammentati ed è apoptotico. rispettiva superficie mappe fluorescenza intensità (C e D) ottenuti utilizzando il software ImageJ mostrando valori di pixel delle immagini fluorescenti viola digitalizzate in forma grafica tridimensionale e posti su una griglia che rappresenta il raggio ben di 3 mm. Bar = 500 micron. Fai clic qui per una versione più grande di questa figura.
Figura 5. La migrazione di alloCTL e la diffusione orizzontale delle RRV-EMD dal alloCTL trasdotte alle cellule tumorali. Fotomicrografie fluorescenti in serie cucita insieme per coprire il raggio del pozzo utilizzando un software di editing delle immagini. Migrazione di RRV-EMD trasduzionealloCTL (frecce bianche) è mostrato su un monostrato di cellule tumorali U-87MG a 0 e 72 ore dopo la sedimentazione. RRV-EMD trasduzione di cellule tumorali nel monostrato è evidente anche a 72 ore dopo l'aggiunta del alloCTL EMD-trasdotte, che indica che la trasmissione orizzontale di RRV infettiva dai linfociti per le cellule tumorali si è verificato (scatola bianca, e nel riquadro). Bar = 200 micron. Fai clic qui per una versione più grande di questa figura.
Figura 6. migrazione radiale di alloCTL trasdotto con RRV-EMD e macchiato con CellTracker Red CMTPX. Le cellule sono state sedimentate sul ECM estratti derivati da cellule MDA-MB-231BR. Migrazione di alloCTL è stato ripreso dal campo chiaro microscopia ottica a 0, 4 e 8 ore (A, B, F colonna 1, rispettivamente). Fluoreimmagini profumo del CMPTX (rosso) etichettati alloCTL (C, G, colonna 2), il RRV-EMD (verde) trasduzione alloCTL (D, H, colonna 3), e le immagini fuse (E, I, colonna 4) sono mostrato a 4 e 8 ore. Bar = 200 micron; Bar mostrato in B applicabile alle immagini CI. Fai clic qui per una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le cellule tumorali in una sospensione di cellule singole sono stati pipettati nei pozzetti di una slitta Teflon mascherato. Le cellule potevano aderire e poi formate monostrati in un umidificata al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore (Figura 1A). Monostrati affermati o proteine ECM derivati dal monostrato potrebbero essere raccolti per questi test (Figura 1B). T effettrici linfociti marcati con coloranti fluorescenti vitali o trasdotte con vettori codificanti per EMD sono stati seminati nel centro del pozzetto usando un CSM. La capacità di non-aderenti linfociti T effettori a migrare sulle monostrato o ECM proteine nel tempo è stata poi valutata e quantificata con la luce e la microscopia a fluorescenza. Qui, abbiamo valutato la migrazione e la citotossicità di effettori non aderente alloCTL su un monostrato di Obiettivo parzialmente rilevanti cellule U-87MG glioma (figure 3 e 5). Queste cellule bersaglio, mostrando solo alcuni dei antigene leucocitario umano(HLA) molecole (HLA-A2, B44), trovati sulle stimolatori originali, sono stati usati per ridurre l'attività litica potente che verrebbe visualizzato dal alloCTL alle relative cellule bersaglio 13-06-MG (HLA-B44 e A1,2 , 57). Abbiamo anche osservato la mobilità del alloCTL su ECM raccolte da un monostrato di cellule tumorali del seno MDA-MB-231BR (Figura 6). Il alloCTL sono stati generati da una via MLTR secondo metodi precedentemente pubblicati 9. Effector alloCTL sono state raccolte 4-5 giorni dopo a senso unico MLTR e trasdotto con RRV-GS4-EMD (figure 3 e 5) o RRV-ACE-EMD (Figura 6) 10,11. Livelli più elevati di trasduzione sono stati raggiunti con il vettore GS4 utilizzando una leucemia ape busta virus Gibbon che con il amphotropic ACE vettoriale. Usando questo test migrazione radiale, abbiamo notato che entrambi trasdotta e nontransduced fluorescenza marcata alloCTL aveva la capacità migratoria. Abbiamo inoltre dimostrato che essi mantengano la loro capacità di essere Cytotoxic dopo aver subito manipolazioni per RRV trasduzione.
La capacità di alloCTL murino di migrare è stata valutata anche (Figura 4). alloCTL sensibilizzati a aplotipo H-2b / k mostrata dalle cellule TU-2449 sono stati colorati con eFluor 670 (viola) e un test di migrazione è stata effettuata utilizzando TU-2449 trasdotte con CMV-Straw-IRES-FLUC2 (rosso). Quando si utilizza destinazione pienamente pertinenti, un minor numero di cellule effettrici alloCTL sono state seminate per impedire rapida lisi dei bersagli cellulari tumorali. Uso 1 hr come base, le cellule T sono largamente localizzati ad alta densità al centro del pozzo come una sospensione di cellule singole. Le micrografie 48 hr mostrano vasta migrazione delle cellule T verso il bordo esterno del pozzo e il raggruppamento della alloCTL è evidente con distruzione delle cellule tumorali nel sito del loro deposito iniziale. Proliferazione delle cellule TU-2449 è evidenziato come mStrawberry cellule marcate aumento della densità del pozzo. Questo è meglio visto in superficietrame fluorescenza che sono stati generati per visualizzare la distribuzione delle cellule viola nei pozzetti (figura 4, pannello inferiore). Mobilità AlloCTL è molto più evidente nel pozzo a 48 ore rispetto alla linea di base 1 hr. Simile a quello che è stato visto nei test che utilizzano cellule alloCTL e glioma umano, uno spazio di cellule tumorali intorno alla zona del deposito iniziale di effettori è evidente a 48 ore, suggerendo lisi delle cellule bersaglio tumorale.
Un passo fondamentale in questo saggio è la crescita di monostrati sani e la successiva raccolta di ECM 'scheletro'. Semina delle cellule tumorali a 2,5-5,0 x 10 4 cellule per pozzetto, secondo punto 1.9 sopra, generalmente determinato un monostrato all'incirca anche per i tipi di cellule tumorali abbiamo usato. Abbiamo trovato essenziale per consentire alle cellule tumorali di aderire a RT, altrimenti la convezione che avviene a 37 ° C le cellule spingerà verso il centro dei pozzi. Come pure, pre-rivestimento del pozzo with poli-D-lisina e / o una proteina ECM quali fibronectina o collagene può aumentare notevolmente tasso di successo. Inoltre, abbiamo avuto più successo con questi test utilizzando monostrato di derivazione ECM 'scheletrica' che con i singoli componenti ECM (es., La fibronectina, collagene), che si è rivelato molto meno affidabile. È importante sperimentare con il numero di cellule non aderenti a depositare attraverso il collettore di sedimentazione pure, e se si utilizza un tipo di cellula pura, si potrebbe teoricamente in grado di definire un coefficiente motilità con questo saggio. Poiché il volume ben è piccolo e alcuni evaporazione del mezzo si verifica, il monostrato deve essere rifornito giornalmente con terreno fresco. Sostituzione supporti impedisce anche l'accumulo di lattato tossici come le cellule crescono e si dividono. Il mancato di coltivare un monostrato sano può provocare spargimento del monostrato o ECM dalla superficie bene.
I Coomassie blu macchiati proteine ECM derivati dalla U-87MG li cell gliomane secondo la fase 1.13 sopra sono mostrate come esempio visivo dello strato di substrato aderente lasciati dopo digestione con Triton X-100 (Figura 1B). Produzione ECM da una linea di cellule di carcinoma della mammella, le cellule MDA-MB-231BR, spesso era incerto e sottile, con un conseguente livello di ECM che era più poco aderenti e talvolta sollevato dalla diapositiva durante il dosaggio. La proteina ECM rispetto alla slitta migliorata quando le cellule tumorali sono state mantenute come monostrati confluenti per 1-2 giorni prima digestione. Durante tutto il processo, la manutenzione della guarnizione Teflon circonda il pozzo era importante. Mantenere il volume basso e minimizzare l'esposizione del Teflon alla soluzione Triton-X100 mitigato lesione all'integrità della guarnizione Teflon.
Un adattamento di questo protocollo potrebbe essere l'uso di un tridimensionale matrice extracellulare raccolto dalle sezioni di ottobre incorporato tessuto tumorale 14. Tuttavia, va notato che la distanza dal bott piattaOMED bene alla superficie di scorrimento è soltanto 1 mm; quindi, le sezioni superiori questo spessore potrebbe essere disturbato dal collettore di collocamento. Inoltre, un metodo dovrebbe essere concepito per fare un leggero buco bava nel tessuto di accettare la goccia di mezzo contenente le cellule non aderenti.
Preparazione di una sospensione singola cella ben disperso-dei linfociti T effettori in anticipo di sedimentazione era imperativo. Tituration Gentle delle cellule T non aderenti per disperdere aggregati a una sospensione di cellule singole era un passo essenziale destra prima di caricare il alloCTL nei canali del CSM. Uso di non enzimatici buffer di dissociazione cellulare dovrebbe essere impiegato se necessario. Inoltre, la densità di linfociti effettori dovrebbe essere circa 1,0-2,0 x 10 5 cellule / ml per sedimentazione, come descritto al punto 2.8. Numeri Low cellulari possono causare alcun sedimentazione, mentre i numeri di cellule superiori possono causare un grande deposito che è facile da interrompere quando si sposta lafar scorrere. Si raccomanda inoltre che la concentrazione di siero nel mezzo di almeno il 10% per fornire un'adeguata tensione superficiale del menisco positivo che riduce la possibilità di fuoriuscite.
Un microscopio ottico invertito con funzionalità di imaging di fluorescenza ea 4x o 10x obiettivi è ottimale per questo test. I punti di tempo per l'imaging possono essere determinati in base alle singole richieste sperimentali e tipi di cellule. Il non aderente CTL in particolare migrare dal centro della sedimentazione verso il bordo del pozzo più rapidamente proteine ECM (4-8 hr) che su un monostrato di cellule (12-72 ore). Parzialmente MHC importanti cellule bersaglio erano preferibile obiettivi rilevanti per il nostro test alloCTL per favorire la visualizzazione della motilità e ridurre citolisi cellulo-mediata dei monostrati prima della migrazione significativa può accadere; all'uso di una bassa effettori di indirizzare il rapporto rallenta anche la lisi. L'uso di obiettivi parzialmente appaiati consente una migliore visualizzazione di RRVtrasmissione alle cellule tumorali pure.
L'uso di un microscopio invertito offre molteplici vantaggi rispetto ad un campo di applicazione verticale. Un campo di applicazione invertito permette l'imaging attraverso la camera umidificata in modo che scivoli non devono essere disturbato, mantenendo un ambiente sterile per le cellule. Inoltre, immagini attraverso la camera fornisce una barriera tra il campione e il tecnico, consentendo l'adesione a (BSL II) le linee guida di biosicurezza di livello II quando si lavora con tessuti umani di derivazione 15.
Se si utilizza un campo di applicazione verticale, il più alto ingrandimento ottenibile senza disturbare il menisco positivo del pozzo è 20x. Purtroppo, l'uso di un coprioggetto, o kit accessori ottica al collettore di sedimentazione delle cellule, non è raccomandato, come l'interruzione di menisco in genere si traduce nella diffusione delle cellule non-aderenti sedimentate tutto il bene. Imaging per lunghi periodi di tempo può richiedere attenta aggiunta di medIUM di ogni bene per sostituire quello perso con l'evaporazione, anche se questo è più probabile che sia necessario durante l'imaging time-lapse.
Questo protocollo è distinto da metodi che misurano migrazione cellulare orizzontale di cellule aderenti in Zigmond Chambers 16,17, il cui disegno non consentire la visualizzazione di migrazione delle cellule non aderenti. Altri saggi che valutano la migrazione orizzontale verso un gradiente chemiotattico attraverso un substrato come agar sono generalmente utilizzati per studiare la migrazione di una cella tipo 18-20. L'uso della CSM fornisce diversi vantaggi questi metodi e metodi che misurano verticale migrazione / invasione delle cellule in coltura, come in camere di Boyden o piastre transwell Matrigel. In primo luogo, il contatto cellula-cellula consente la determinazione di interazione delle cellule bersaglio-effettrici e lesioni da cellule effettrici. La capacità citolitica di alloCTL-RRV-EMD inizialmente stimolato da una via MLTR con stimolatore cellule tumorali 13-06 mg alla partialleati MHC-matched linea cellulare U-87MG è evidente nel centro del monostrato a 24 e 72 ore dopo sedimentazione (figure 3 e 5, le linee tratteggiate). Inoltre, la degradazione delle cellule TU-2449 di alloCTL murino è visibile a 48 ore post-sedimentazione (Figura 4). Il monostrato è cancellato al centro del deposito alloCTL, ma si verifica più lentamente per il resto del monostrato, sia a causa della sovrapposizione nell'espressione HLA di 13-06-MG e U-87MG nei saggi con cellule umane 21 o bassa numero di cellule effettrici inizio del glioma murino. Inoltre, il effettrici di densità bersaglio è ridotta come effettori alloCTL migrare lontano dal sito di sedimentazione. Oltre alla migrazione e citolisi, questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare trasferimento di proteine fluorescenti codifica virus. Qui, il trasferimento di codifica RRV per EMD dalla alloCTL alle cellule tumorali è evidente dopo 72 ore (figura 5, nel riquadro).
Una limitazione di questo modello è che la migrazione può essere valutato solo in vitro, che non può essere veramente riflettente della migrazione in vivo. Un'altra limitazione è che gradienti recettore per chemochine / chemochine non possono essere fissati in base al modello. Mentre interazioni delle cellule immunitarie con ECM o cellule tumorali singole possono ancora verificarsi e dipenderà da ciò che quelle cellule secernono o esprimere, questa motilità assay non sarebbe rispondere a domande su se le cellule non aderenti migreranno specificamente o da fattori isolati.
Un vantaggio di questo saggio è la capacità di determinare se una popolazione di cellule non aderenti mantenere la funzionalità migratoria se i linfociti sono o non sono state trasdotte. Nel nostro esempio, la sottopopolazione trasdotte è visibile attraverso l'espressione proteica EMD, ed è chiaro che la funzionalità migratoria viene mantenuto in questa sottopopolazione. Un'applicazione più ampio potrebbe essere quello di verificare gli effetti di varie concentrazioni di agenti o farmaci che possono influenzare la migrazione non aderente cellule immunitarie. Inoltre, altre cellule ematopoietiche possono essere testati per la mobilità su vari substrati o cellule aderenti derivate da tessuto normale. Infine, anche se non viene fatto qui, semina una combinazione di tipi di cellule aderenti, cioè, cellule stromali o cellule dendritiche con tumore, può fornire analisi riflettente più complessa in ambienti vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Supportato in parte dal NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Concessione Numero UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e Joan S. Holmes Memorial Fund Research. MJH e GCO ricevuti sostenuto dalla Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship presso la UCLA. Il dispositivo CSM è stato ottenuto da creativi metodi scientifici: www.creative-sci.com. Il vettore lentivirale è stato ricevuto dal UCLA Vector core, che è supportato da CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
