Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

Published: February 11, 2015 doi: 10.3791/52416
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1,2, 1,4,5, 3,5, 1,4,5
1Department of Neurosurgery, UCLA David Geffen School of Medicine, 2Department of Molecular and Medical Pharmacology, UCLA David Geffen School of Medicine, 3Department of Medicine, UCLA David Geffen School of Medicine, 4Brain Research Institute, UCLA David Geffen School of Medicine, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA David Geffen School of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

אנו מדווחים הסתגלות רומן של assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי, שפורסם לראשונה למדוד את הגירת רדיאלי של תאים סרטניים חסיד על חלבוני מטריצת חוץ תאיים, למדידת תנועתיות של תאי מערכת חיסון שכותרתו fluorescently, אדם שאינו חסיד או מפעיל עכברי. טכניקה זו מעסיקה סעפת נירוסטה ולהחליק טפלון 10 היטב להפקיד focally תאי T שאינם חסיד לתוך הבארות מוכנות עם שני monolayers תאים סרטניים ומחוברות או חלבוני מטריקס. מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור ו / או רב-ערוצית משמש כדי לעקוב אחר התנועה וההתנהגות של תאי מפעיל לאורך זמן. צבעי ניאון ו / או וקטורים ויראליים שהקוד לtransgenes ניאון משמש תווית באופן דיפרנציאלי סוגי התאים להדמיה. שיטה זו שונה מדומה מסוג במבחני חוץ גופית העוקבים אחר הגירה / פלישה אופקית או אנכית ניצול תאי שקופיות, אגר או transwell צלחות. Assay מאפשר הדמיה נתונים מפורטים לbדואר שנאסף עם סוגי תאים שונים נבדלים בסמני ניאון ספציפיים; אפילו תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים (כלומר, transduced / nontransduced) יכולות להיות במעקב. מגרשי הקרינה בעוצמה משטח נוצרים באמצעות ערוצי הקרינה ספציפיים שמתאימים לסוג התא הנודד. זה מאפשר להדמיה טובה יותר של ניידות תא החיסון שאינו חסיד בזמנים מסוימים. ניתן לאסוף ראיות של פונקציות תא מפעיל אחרות, כגון cytotoxicity או העברה של וקטורים ויראליים ממפעיל למקד תאים, כמו גם. לכן, השיטה מאפשרת לחוקרים לתעד מיקרוסקופיים אינטראקציות תא אל התא של דיפרנציאלי שכותרתו, שאינו חסיד עם תאים חסיד מסוגים שונים. מידע זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד בהערכת סוגים ביולוגי מניפולציות או הופעלו תאים חיסוניים, שבו הוכחה ויזואלית של פונקציונליות רצויה עם תאי מטרה סרטנית לפני השימוש בם לטיפול בסרטן.

Introduction

Assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי פותח במקור כדי למדוד את תכונות infiltrative של תאים סרטניים חסיד 1-4 בשקופיות מצופות במטריצה ​​תאית חלבונים (ECM) 5-7 או עם רכיבי ECM בודדים, כגון פיברונקטין או laminin 1,2. הטכניקה מעורבת זריעת השעיה תא בודדת של תאים סרטניים במרכז בארות באמצעות סעפת נירוסטה שקיעת תא (CSM). לאחר שקיעה, התאים הסרטניים היו לדבוק בתחתית הבאר והשינוי בקוטר של אוכלוסיית התא הראשונית לאורך הזמן שימש להקמת שיעור של תנועתיות אופקית. Assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי סיפק יתרון חזותי על פני שיטות קיימות אחרות שהעסיקו transwell צלחות לassay יכולות נדידה במבחנה של תאים; מבחני אלה אינם תורמים להדמיה 8. וכן, זה גם סיפק כמות גדולה של חופש בבחירת timepointזה כאשר הגירה נבחנת, ללא הגבלה על מספר הנקודות זמן חוקר יכול לבחור תמונה לאחר שקיעה.

בגלל היכולת להעביר היא פונקציונלי חשובה לתאים שאינם חסיד, במיוחד בתחום של טיפול חיסוני או שבו הם יכולים לשמש ככלי רכב משלוח לוקטורים ויראליים, התאמנו השימוש בCSM להעריך את ההגירה של תאים שאינם חסיד סוגים על משטחי תאים סרטניים, בנוסף לחלבוני ECM. יתרון הנוסף של מיקרוסקופי לדמיין את הנדידה של תאים שאינם חסיד בmonolayers תאים סרטניים קיימא, על ECM המורכב מבודד מהגידול, או על רכיבי ECM פרט הופך assay זה צדדי. מבחני שמעסיקים בארות מצופים בחלבון תאי יחיד אינם משקפים במדויק את מצע רקמת ECM או גידול התאים היו להעביר דרך in vivo.

כאן, אנו משמשים alloreactive לימפוציטים ציטוטוקסיות T (alloCTL), רגיש לhistocomp הגדולחלבונים מורכבים atibility (MHC) באמצעות תגובות תאים הסרטניים מעורבים הלימפוציטים בכיוון אחד (MLTR) או תגובות מעורבות הלימפוציטים (הקה"ע) 9, כסוג התא שלנו נציג שאינו חסיד. בדקנו תאים של שני מוצא האדם והעכברי. כאשר הגירה נמדדה על משטחי גידול, תאי הגידול המועסקים היו מטרות או רלוונטיות באופן חלקי, בו מוצגות חלק מאותם החלבונים MHC מצאו על אוכלוסיית התאים המשמשת לרגישות effectors, או מטרות רלוונטיות באופן מלא, עם סט מלא של מולקולות MHC ש effectors היה רגיש כלפי. בחלק מהניסויים, שנהגנו CellTracker הניאון האדום CMPTX או צבע התפשטות תאי eFluor 670 להבחין בין תאי מפעיל והיעד. כמו כן נעשה שימוש התמרה עם קידוד וקטורים ויראליים לחלבוני ניאון כדרך נוספת כדי להמחיש את התאים. עבור מבחני מסוימים, אנחנו transduced alloCTL עם וקטורי retroviral המשכפלים (RRV) קידוד לאמרלד גרין (EMD) חלבון פלואורסצנטי 10,11; לothers, תאים סרטניים היו transduced עם וקטורי lentiviral הקידוד לmStrawberry.

AlloCTL היה זרע דרך ערוץ של הסעפת למרכז או monolayers גידול תא או ECM נקטף מן monolayers תאים סרטניים. אינטראקציות תא חסיד ולא חסיד היו דמיינו ידי אור ו / או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן. תאי הפרעה בשכבת התאים הסרטניים בצריכת חשמל נמוך, או גידול עם גרעינים מקוטעים בהספק גבוה היו אינדיקטורים של פגיעה בתא על ידי תמוגה ואפופטוזיס, בהתאמה. אנו דיגיטליים יצרנו מפות ניאון עוצמת המשטח מראים את הנדידה של תאי T fluorescing לא חסיד על תרבויות monolayer. אנחנו גם ציינו cytotoxicity הולידה לmonolayer תא גליומה חסיד לאחר היווצרות אשכול alloCTL לא חסיד שמעליו. כמו כן, התמרה אופקית של RRV-EMD מalloCTL לmonolayer גליומה נצפתה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. החלק הכנה

  1. הכנס שקופיות סעפת שקיעה סלולארי לשקיות עיקור וחותם עם קלטת החיטוי. להתמודד עם הצד מצופה טפלון של שקופית נייר בצד של הנרתיק כדי למנוע פיקדונות פלסטיק על הבארות.
  2. שקיות החיטוי במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
  3. הסר שקופיות מכיס עיקור בתוך ארון בטיחות ביולוגי ומקום בצלחת פטרי סטרילית סטרילי 150 x 15 מ"מ. עד ארבע שקופיות יכולה להתאים לכל צלחת. מניחים צלחת פטרי 35 x 10 מ"מ בסמוך לשקופיות. להוסיף 2-3 מיליליטר של H 2 O סטרילי כדי לספק לחלוח.
  4. שקופיות טרום מעיל עם פולי-D ליזין ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות נפח מספיק כדי לכסות את כל היטב. לאחר שעה אחת בRT, לשאוב את הפתרון ולשטוף את פני השטח של באר פעמיים על ידי pipetting 1x PBS על פני השטח של הבארות.
  5. לחלופין, להוסיף פיברונקטין או רכיבי ECM אחרים, כדי להבטיח עמידה בתאים סרטניים חזקות. להוסיף פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח מספיק that הבארות יהיו לא יבש בתוך פרק זמן קצר בRT.
    1. אחרי שעה 1, לשאוב את פתרון השאריות ולשטוף פעמיים על ידי pipetting מעלה ומטה עם 1x PBS.
  6. שמור PBS על הבארות עד הגידול מוכן לציפוי. שימוש מחליק באותו היום.
  7. קציר בקבוק ומחוברות מסוג התאים סרטניים חסיד הרצוי. ספירת תאי קיימא באמצעות הדרת צבע Trypan הכחולה על ידי מיקרוסקופ וresuspend אור ב 5 x 10 6 תאים / מיליליטר בדוגמא בינונית לצמיחה נאותה נאגרה, בינוני של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), L- גלוטמין ופירובט נתרן.
  8. אם הדמיה ניאון של אוכלוסיית התאים חסיד היא רצויה, לתייג אוכלוסיית תאים חסיד עם פלורסנט לצבוע חיוני או צבע התפשטות תאים על ידי ביצוע הפרוטוקולים מסופקים על ידי היצרן.
  9. בצורה חלקה פיפטה 10 μl של מדיום שלם לבאר כל טיפול השקופיות לוקחים כדי למנוע יצירת בועות בwells, כמו אלה יכולים למנוע דבקות של תאי גידול אחיד.
  10. להוסיף 2.5-5.0 x 10 4 תאים (5-10 μl של השעיה תא) למדיום בכל טוב (איור 1 א). התאם את המספר האופטימלי בהתאם לסוג התאים סרטני ואת מספר הימים של צמיחה הרצויה. תאי גידול גדולים יותר או תאים גדלו במהירות עשויים לדרוש פחות תאים בתחילה. להביא גם נפח של עד 40 μl על ידי הוספה בינונית ופיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים.
  11. אחרי הכל הבארות הם זורעים, לאפשר לתאים הסרטניים לדבוק בRT, ואז למקם את המכסה על צלחת פטרי 150 x 15 מ"מ ובזהירות להעביר את הצלחת לחממת humidified CO / 5% 37 ° C 2 לפחות 24 שעות.
  12. לשנות את מדיום התרבות יומי. זהירות פיפטה חלק של המדיום בילה מmonolayer ולהחליף עם מדיום מלא טרי.
    הערה: בגלל ההתאדות, יותר נפח תצטרך להוסיף יותר מהוצא. ולס יהיה מוכן לassay כאשר אפילו, conflהשכבה של תאי uent היא הווה. זה בדרך כלל 1-3 ימים לאחר זריעה ראשונית.
  13. לשטוף בעדינות monolayer פעם עם PBS כמתואר בשלב 1.4 וגם המשך לשלב 2 אם monolayers הוא רצויים, או לשלב 1.13 להלן כדי לחלץ חלבוני ECM מהשכבה.
  14. הפוך 0.5% Triton-X (v / v) פתרון בינוני מלא ולהוסיף 30 μl היטב כל אחד. בואו monolayer לעכל במכסת מנוע למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם מדיום שלם על ידי pipetting כפי שתואר לעיל.
    הערה: שכבת ECM יכולה להיות גלויה על ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). השתמש בשקופיות מייד, או לשמור במדיום מלא בCO 2 באינקובטור humidified במשך 1-2 ימים. אל תאפשר בארות להתייבש.

2. שקיעה של תאי T שאינם חסיד על שקופיות

  1. אם הדמיה ניאון של אוכלוסיית תאים שאינם חסיד היא רצויה, לתייג אוכלוסיות שאינן חסיד תא עם צבע פלואורסצנטי חיוני, כגון CFSE, Cell Tracker האדום CMPTX, או eFluor670 על ידי ביצוע הפרוטוקולים מסופקים על ידי יצרן השעה לפחות 1 מראש של assay. לחלופין, לתפעל תאים לבטא חלבוני ניאון המקודדים על ידי וקטורים ויראליים.
  2. החיטוי סעפת שקיעת תא בכיס החיטוי כמתואר ב1.2 לעיל.
  3. הסר את תא humidified המכיל שקופיות מצופים טפלון מן החממה והמקום בארון בטיחות ביולוגית.
  4. לשטוף בארות עם 1x PBS על ידי pipetting מעלה ומטה, ולאחר מכן להוסיף 45 μl של מדיום שלם המכיל לפחות 10% בסרום.
  5. הסר את הסעפת ממעטפת העיקור ולהחליק בזהירות בלמעלה מ הבארות עד 'הוו' בסוף הסעפת נוגע התחתון של השקופית (איור 1).
  6. ודא שמדיום התרבות גלוי בכל אחד מהערוצים. אם אף נראה, תוריד את הסעפת ולהוסיף עוד מדיום למתאים היטב, ולאחר מכן להחליף ולבדוק שוב.
  7. חזור על שלב 2.5 עבור כל channel של הסעפת, או לבארות רבות ככל רצוי.
  8. ספירת תאים וגלול שאינם חסיד בלא פחות מ 1.0-2.0 x 10 5 / μl. צייר את 1 μl של תאים ולאט לאט פיפטה אותם לערוץ (איור 1 ג). לעשות את זה עבור כל רצוי גם.
  9. השאר את כל מנגנון התא טעון, כלומר, סעפת ושקופיות, בתוך מכסה המנוע ביו-20-30 דקות, כדי לאפשר את התאים בערוץ להתיישב.
  10. הסר את הסעפת על ידי הנגיעה בשני הקצוות ובעדינות להרים אותו ישר מהשקופית כדי לא להפריע לתאים שנזרעו focally במרכז הבארות (1D איור).
  11. בדוק היטב כל אחד כדי להבטיח שאינם חסיד התאים כבר זורעים בהצלחה במרכז גם להישאר בתוך ההיקף של ערוץ הסעפת. אינם חסיד התאים יהיו באופן אידיאלי מעט לדבוק monolayer או ECM וזה לזה, ולכן בעדינות נעו סביב השקופיות לא יגרמו Pelle התאt להתפזר. לא להדחף השקופיות.

3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. עם ציוד מתאים ניסיוני, לבצע ההדמיה לאחר שקיעה הוא אישר. באופן אידיאלי, להשתמש במיקרוסקופ המצויד בתא CO 2 ולחות. תמונה בצריכת חשמל נמוך, כלומר, 4X או 10X, כדי לאפשר למספר רב של תמונות שיש לנקוט משטח גדול יותר, כך שהשלמות של הבאר ניתן לראות.
  2. לרכוש תמונות דיגיטליות באמצעות תוכנה ללכידה תמונה. בצע brightfield ו / או הדמיה הקרינה רבת-ערוצית.
  3. אם תרצה, להגדיר זמן לשגות להקליט תמונות בערוצים שונים על פני שטח נתון, או לשמור את שקופיות humidified וב/ 5% חממת 37 ° C CO 2 וידניות להוציא לתמונה בנקודות הזמן הרצויה (איור 1E & F, מומלץ לנקודות זמן ארוכות יותר).

4. ניתוח ותצוגה

  1. שימוש בתוכנת עריכת תמונות, למזג אור וflתמונות uorescent לסוגי תאי שכבה אחת כל כך מרובים וסמנים שניתן לראות באותה התמונה. גרור ושחרר את קבצי תמונה לכל צבע פרט לתכנית ו, כאשר תתבקשו לעשות זאת, בחר באפשרות "הוסף Layer 'כדי ליצור קובץ תמונה עם מספר שכבות.
    1. בהגדלה גבוהה יותר, לקחת, ליישר, ולתפור תמונות ברחבי גם באופן דיגיטלי. יישר קבצים ע"י הסתכלות באזורים שמורים בין שתי תמונות וכיסו תמונה אחת על גבי השני עד תמונה שלמה נוצרה.
  2. להוסיף ברים מיקרון לתמונות במהלך רכישה באמצעות התוכנה ללכידה כדי לקבוע מרחק תאים בודדים היגרו.
  3. כדי לקבוע את נדידת התאים בזמנים שונים, להפוך את מפות הקרינה בעוצמה משטח עם תוכנת תמונה, כלומר, ImageJ, לכמת צבירת תא T ניאון או משתרעים על פני זמן.
    1. כדי ליצור חלקות פני השטח, לקחת תמונה שכבתית שנוצרה בשלב 4.1 ומתחת לחלון השכבות,בטל את סימון כל השכבות מלבד אלה המקביל לערוץ הרצוי. לדוגמא, אם עלילת משטח רצויה לדמיין ביטוי EMD, רק השכבות "הירוקות" המתאימות למסנן המשמש לסמן זה צריכה להיות גלויות.
    2. לשטח את התמונה ולשמור אותו בפורמט קובץ המוכר (לדוגמא, png) ולטעון את התמונה לתכנית. על מנת ליצור את עלילת המשטח, לשנות את סוג התמונה ל8-bit, לשנות את הבהירות / ניגודיות לפי צורך כדי להפחית את הרקע, ובחר באפשרות 'לנתח מגרש / שטח'. התמונות באיור 5 נוצרו על ידי בדיקת 'הצל', 'צייר ציר "," אחת מצולע לקו', ותיבות סימון 'Smooth ".
    3. לחלופין, לקחת מדידות באמצעות הרדיוס או קוטר מהפקדת תא המוקד בזמן אפס ולהשוות לתאים בנקודה המרוחקת ביותר בזמנים שונים. הקוטר של בארות הטפלון הוא 6.0 מ"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

וקטורים ויראליים קידוד לחלבוני ניאון יכולים לשמש בנוסף ל, או במקום, צבע ניאון. התמרה ויראלית צריכה להתבצע מראש של assay תנועתיות. שני סוגים חסיד ולא חסיד תא יכולים להיות דיפרנציאלי שכותרתו. הפרוטוקול עבור התמרה יהיה תלוי בסוג של וקטור המועסק. כאן, אנו transduced alloCTL באיורים 3, 5 ו -6 עם RRV-EMD לפחות יומיים מראש של assay באמצעות הפרוטוקול מתואר 12. כמו כן השתמשנו וקטור lentiviral, CMV-התות-IRES-FLUC2, לtransduce תאים הסרטניים להביע חלבון mStrawberry האדום ניאון (איור 4). התמרה זו הושגה על ידי הוספת הווקטור לבקבוק של תאים במשך 48 שעות, ובשלב זה, מדיום חדש נוספו. אחרי שמאפשר לתאים להתאושש במשך יומיים, הגבלת דילול בוצע כדי ליצור אוכלוסייה של תאי transduced 100%.

"Jove_content"> alloCTL האדם נעשה עם תאי ממריץ מומת אנושיים 13-06-MG ממאירים גליומה ידי MLTR. AlloCTL אז היו transduced עם קידוד RRV לEMD (RRV-EMD) ולאחר מכן זורעים לתוך מרכז monolayers הוקם תאי גליומה U-87MG עם MHC-התאמה חלקית ל13-06-MG (איורים 3 ו -5). מיקרוסקופ פלואורסצנטי תערוכות תאים, בתחילה זרעו במרכז הבאר, להעביר מהמרכז לאורך זמן. ההיווצרות של alloCTL צוברת לאחר 4 שעות (איור 3, חצים לבנים) עשוי שיקוף של דפוסי צמיחת autocrine הוצגו על ידי פעיל, IL-2-ייצור אוכלוסיות תאי T 13.

בניסוי אחר, מפעיל עכברי alloCTL נעשה על ידי בכיוון אחד קווים קדמיים באמצעות splenocytes haplotype H-2 BALB / ג מגיב וsplenocytes ממריץ H-2B haplotype / k מעכברי B6C3F1, להתאמץ כדי שגליומה TU-2,449 היא syngeneic. מייד לפני זריעה דרך הערוץ של tהוא הסעפת על monolayer התאים הסרטניים, alloCTL הוכתמו eFluor 670. alloCTL (תאים סגולים) היו זורעים למרכז monolayers הוקם תאי TU-2,449 גליומה (אדום) שהיו 100% transduced עם CMV-Straw- IRES-FLUC2 וקטור נגיפי, ומצופה בבארות היום לפני assay. איור 4 א 'וב' תכנית תמונות מיקרוסקופיות נלקחו מאותו רבע מאותו גם בשעה 1 ו -48. איור 4C וD נוצרו באמצעות ImageJ להמיר הקרינה סגולה דיגיטציה עוצמות לחלקות פני השטח כמותיים המוצגות בפורמט תלת-ממדי.

לבסוף, alloCTL אדם נעשה עם תאי מוח טרופי אדם ממריץ מומת נגזרים משורת תאי סרטן שד גרורתי מד"א-MB-231BR ידי MLTR. איור 6 מציג תמונות אור ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך הזמן של alloCTL כותרת CMPTX שאינו חסיד, באופן חלקי transduced עם RRV-EMD, נודד על חלבוני ECM חילוץ fROM תאים הסרטניים אלה. ב (א) photomicrograph השדה הבהיר מציג מיקום מוקד של alloCTL מייד לאחר שקיעה. ב( B ו- F) photomicrographs שדה הבהיר מראה, בשעה 4 ו -8 שעות, בהתאמה, alloCTL הנודד רדיאלית על ECM. צפיפות alloCTL יורדת עם מרחק מהמרכז היטב (מרכז גם הוא פינה השמאלית העליונה של שדה בBI). פנלים (C ו- G) תכנית הכנת כל alloCTL המוכתם בCMTPX; (ד 'ו-ח) מראים התמרה חלקית של alloCTL עם RRV-EMD כפי שצוינו על ידי מספר הקטן של תאי EMD + T, ו- (E ואני) להראות תמונות הממוזגות של RRV-EMD transduced alloCTL נודדים בECM יחד עם alloCTL untransduced.

איור 1
() ולס להיות מוכן לשקיעה, סעפת שקיעת תא ממוקמת בשקופית (B), נטענים לימפוציטים מפעיל (C) לא חסיד לתוך הסעפת, (ד) תהליך שיקוע Cell 1. איור של סעפת שקיעת תא, תא לחות (E), (F) מגלשות שיוצב בחממת humidified. דמות זו משמשת באישור זכויות יוצרים מCreative המדעי (http://www.creative-sci.com/). לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
monolayers איור 2. גידול התא וECM מצופים על בארות שקופית CSM. Photomicrographs של בארות שקופיות שהוכןעם monolayers () מחוברות U-87MG תא גליומה, או חלבוני ECM (B) המופק מהמחוברות U-87MG מוכתם בצבע כחול Coomassie. בר = 200 מיקרומטר. לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הגירה וcytotoxicity של לימפוציטים transduced RRV-EMD במרכז ומוביל של הפקדת תא לאורך זמן. photomicrographs פלורסנט נלקח בזמנים שונים בחוד החנית ובמרכז alloCTL-RRV-EMD הבא שקיעה על monolayer של תאי גליומה U-87MG חסיד. מפעיל alloCTL זורעים כתאים בודדים, יצירת צבירים כדוריים בתוך 4 שעות (חצים לבנים) של מיקום. CTL fluorescently שכותרת היחיד היגרו מהמרכז גםהזמן של התקדמות. לאחר 24 שעות, תיקוני תא ריקים בשכבה חסיד גלויים ככל הנראה בשל cytolysis alloCTL של תאי המטרה סרטנית (ראה אזור בתוך מקפים). בר = 200 מיקרומטר. לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. הגירה רדיאליים של alloCTL העכברי מוכתם בeFluor 670 על תאי גליומה שכותרת mStrawberry הוצגו בשעת 1 ו -48. Photomicrographs פלורסנט של רבע אחד של אותו גם ב() 1 שעה ו -48 שעות לאחר שקיעה של fluorescently (B) שכותרתו alloCTL לא חסיד על monolayer של תאי גליומה TU-2,449. Photomicrographs החשמל הנמוך משקף את האזור הכלול ברבע אחד של CSM היטב (רדיוס של 3 מ"מ). בהספק גבוה (A ו- B, ריבועים) alloCTL (חצים לבנים) מוצג בסמיכות לאו הקשורים לתאים סרטניים בודדים; יש אחד מראה מפורר עם גרעינים מקוטעים והוא אפופטוטיים. מפות הקרינה בעוצמה משטח המתאים (C ו- D) שהושגו באמצעות תוכנת ImageJ מראה ערכי פיקסל של תמונות ניאון סגולות דיגיטציה בצורה גרפית תלת-ממדית והניחו על רשת המייצגת את הרדיוס ו של 3 מ"מ. בר = 500 מיקרומטר. לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. הגירה של alloCTL והתפשטות אופקית של RRV-EMD מalloCTL transduced לתאים סרטניים. Photomicrographs פלורסנט תפור באופן סדרתי יחד כדי לכסות הרדיוס של תוכנת עריכת תמונות באמצעות כן. הגירה של RRV-EMD transducedalloCTL (חצים לבנים) מוצג על monolayer של תאים סרטניים U-87MG ב0 ו -72 שעות הבאות שקיעה. התמרה RRV-EMD של תאים סרטניים בשכבה באה לידי הביטוי גם בשעות 72 הבאים תוספת של alloCTL transduced-EMD, מצביע על כך שהשידור אופקי של RRV המזהם לימפוציטים לתאי גידול התרחש (קופסא לבנה, והבלעה). בר = 200 מיקרומטר. לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. הגירה רדיאליים של alloCTL transduced עם RRV-EMD ומוכתם בCellTracker האדום CMTPX. תאים היו משקעים על תמציות ECM שמקורם בתאי מד"א-MB-231BR. הגירה של alloCTL הייתה צילמה על ידי מיקרוסקופ אור בהירה השדה ב 0, 4 ו -8 שעות (A, B, F עמודת 1, בהתאמה). Fluoreתמונות ריח של CMPTX (אדום) שכותרתו alloCTL (C, G, עמודה 2), RRV-EMD (הירוק) transduced alloCTL (D, H, טור 3), והתמונות הממוזגות (E, אני, טור 4) הוא מוצג ב 4 ו -8 שעות. ברים = 200 מיקרומטר; בר מוצג B החלים על CI תמונות. לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאי גידול בהשעית תא בודד היו pipetted לתוך הבארות של שקופיות-רעול פנים טפלון. התאים הורשו לדבוק ולאחר מכן יצרו monolayers בhumidified 5% CO 2, 37 ° C חממה (איור 1 א). monolayers הוקם או חלבוני ECM נגזר מmonolayer יכול להיות שנקטפו למבחנים אלה (איור 1). לימפוציטים מסוג T מפעיל שכותרתו עם צבעי ניאון חיוניים או transduced עם וקטורי קידוד עבור EMD היו זרע למרכז גם באמצעות CSM. היכולת של לימפוציטים מסוג T מפעיל שאינו חסיד להעביר על חלבוני monolayer או ECM לאורך זמן אז העריכה ולכמת עם אור ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן, אנו הערכנו את ההגירה וcytotoxicity של מפעיל שאינו חסיד alloCTL על monolayer של תאי גליומה U-87MG יעד באופן חלקי-רלוונטי (איורים 3 ו -5). תאי יעד אלה, בו מוצגות רק חלק מהאדם ליקוציט Antigenמולקולות (HLA) (HLA-A2, .44) נמצאו בגירוי המקורי, שמשו כדי להפחית את פעילות ממס החזקה שיוצגה על ידי alloCTL לתאים הרלוונטיים 13-06-MG היעד (HLA-A1,2 ו.44 , 57). אנו הבחנו גם הניידות של alloCTL על ECM נקטפה מן monolayer של תאי סרטן שד מד"א- MB-231BR (איור 6). AlloCTL נוצרו על ידי כיוון אחד MLTR על פי שיטות שפורסמו בעבר 9. מפעיל alloCTL נקצרו 4-5 ימים לאחר בכיוון אחד MLTR וtransduced עם RRV-GS4-EMD (איורים 3 ו -5) או RRV-ACE-EMD (איור 6) 10,11. רמות גבוהות התמרה הושגו עם וקטור GS4 ניצול מעטפת וירוס לוקמיה קוף גיבון מאשר עם וקטור ACE amphotropic. באמצעות assay הגירת רדיאלי זה, שציינו כי transduced שני וnontransduced הייתה alloCTL fluorescently שכותרתו יכולת נדידה. אנחנו גם מדגימים כי הם שומרים על היכולת שלהם להיות CYTotoxic לאחר שעבר מניפולציות עבור התמרה RRV.

היכולת של alloCTL העכברי להגר גם העריכה (איור 4). alloCTL רגיש לH-2B / k haplotype מוצג על ידי תאי TU-2,449 הוכתמו eFluor 670 (סגול) וassay הגירה בוצע באמצעות TU-2,449 transduced עם CMV-הקש-IRES-FLUC2 (אדום). בעת שימוש ביעד רלוונטי באופן מלא, מספר נמוך יותר של תאי מפעיל alloCTL היה זרע כדי למנוע תמוגה המהירה של מטרות תאים הסרטניים. שימוש בשעה 1 כבסיס, תאי T הם מקומיים בעיקר בצפיפות גבוהה במרכז וכן השעיה תא בודדת. 48 שעות micrographs להראות הגירה נרחבת של תאי T לכיוון הקצה החיצוני של גם ואשכולות של alloCTL הוא ברור ממבט עם הרס של התאים הסרטניים באתר של ההפקדה הראשונית שלהם. התפשטות של תאי TU-2,449 מתבטא כmStrawberry תאים שכותרתו להגדיל בצפיפות מעל הבאר. זה יותר טוב לראות בשטחמגרשי הקרינה שנוצרו כדי להמחיש את חלוקת תאים סגולים בבארות (איור 4, פנל תחתון). ניידות AlloCTL היא הרבה יותר לידי ביטוי בבאר בשעה 48 בהשוואה לקו בסיס שעה 1. בדומה למה שראה במבחני ניצול תאי alloCTL וגליומה אדם, פינוי של התאים הסרטניים באזור של ההפקדה הראשונית של effectors בולט ב 48 שעות, מה שמרמז תמוגה של תאי המטרה סרטנית.

שלב קריטי בassay זה הוא הצמיחה של monolayers הבריא והקציר הבא של ECM 'שלד'. זריעה של התאים הסרטניים ב2.5-5.0 x 10 4 תאים לכל טוב, לפי צעד 1.9 לעיל, בדרך כלל הביאה אפילו בערך monolayer לסוגי תאי גידול שנהגנו. מצאנו את זה חיוני כדי לאפשר לתאים הסרטניים לדבוק בRT, אחרת ההסעה המתרחשת על 37 מעלות צלזיוס ידחוף את התאים לכיוון מרכז הבארות. כמו כן, לפני ציפוי של wi הבארותפולי-D ליזין ה ו / או חלבון ECM כגון פיברונקטין או קולגן יכול להגדיל את שיעור הצלחה באופן משמעותי. בנוסף, היו לנו הצלחה רבה יותר עם ​​מבחני אלה באמצעות ECM 'שלד' הנגזר monolayer מאשר עם רכיבים בודדים ECM (כלומר., פיברונקטין, קולגן), אשר הוכיחו הרבה פחות אמין. חשוב להתנסות עם מספר התאים חסיד שאינו להפקיד דרך סעפת שקיעה, כמו גם, ואם באמצעות סוג תא טהור, אפשר תיאורטית תוכל להגדיר מקדם תנועתיות עם assay זה. כי באר הנפח קטן וכמה אידוי של מדיום מתרחש, monolayer צריך להתחדש מדי יום עם מדיום חדש. החלפת מדיה גם מונעת הצטברות של חומצת החלב רעילה כמו התאים הגדלים ומתחלקים. כישלון לטפח monolayer בריא יכול לגרום לשפיכה של monolayer או ECM מפני השטח היטב.

חלבוני Coomassie הכחולים המוכתמים ECM נגזרים מli תא גליומה U-87MGne לפי צעד 1.13 לעיל מוצגים כדוגמא חזותית של שכבת המצע חסיד נשארה מאחור לאחר עיכול עם טריטון X-100 (איור 1). ייצור ECM משורת תאי סרטן השד, תאי מד"א-MB-231BR, לעתים קרובות היה בלתי סדיר ודק, וכתוצאה מכך שכבת ECM שהייתה יותר גרוע חסיד ולפעמים הרים מהשקופיות במהלך assay. דבקות חלבון ECM לשקופית משופרת בעת תאי גידול נשמרו כmonolayers מחוברות במשך 1-2 ימים לפני העיכול. לאורך כל התהליך, התחזוקה של חותם הטפלון המקיף את הבאר הייתה גם חשובה. שמירה על הנפח נמוך וצמצום חשיפה של הטפלון לפתרון Triton-X100 מיתנה נזק לשלמות חותם הטפלון.

הסתגלות אחד של פרוטוקול זה יכול להיות שימוש בשלושה ממדי מטריצה ​​תאית שנקטפו מסעיפים של אוקטובר רקמת הגידול המשובץ 14. עם זאת, יש לציין כי המרחק מבוט השטוחomed טוב למשטח המגלשה הוא רק 1 מ"מ; כך, סעיפים העולים על עובי זה עשוי להיות מופר על ידי מיקום סעפת. כמו כן, שיטה הייתה צריכה להיות המציאה לביצוע חור בר קל ברקמות לקבל הטיפה של מדיום המכיל את התאים שאינם חסיד.

הכנת השעיה תא בודד מפוזרת היטב של לימפוציטים מסוג T מפעיל מראש של שקיעה הייתה גם הכרחית. tituration העדין של תאי T שאינם חסיד לפזר אגרגטים להשעית תא בודד היה צעד חיוני תקין לפני טעינת alloCTL לערוצים של CSM. שימוש במאגרי התא דיסוציאציה אינן אנזימטית צריכים להיות מועסקים במידת צורך. יתר על כן, הצפיפות של לימפוציטים מסוג מפעיל צריכה להיות סביב 1.0-2.0 x 10 5 תאים / μl לשקיעה, כמתואר בשלב 2.8 לעיל. מספרים סלולריים נמוכים עלולים לגרום לשקיעה לא, ואילו מספרים סלולריים גבוהים יותר יכולים לגרום להפקדה גדולה כי הוא קל ללשבש בעת מעברלהחליק. מומלץ גם כי הריכוז בסרום בטווח הבינוני להיות לפחות 10% כדי לספק מתח פנים נאותים של המניסקוס החיובי שמקטין את האפשרות של גלישה.

מיקרוסקופ אור הפוכה עם יכולות הדמיה הקרינה ו4x או 10x מטרות היא אופטימלית עבור assay זה. נקודות הזמן להדמיה ניתן לקבוע על פי בירורים ניסיוניים בודדים וסוגי תאים. CTL לא חסיד בפרט להגר ממרכז שקיעה לעבר קצה גם במהירות רבה יותר בחלבוני ECM (4-8 שעות) מאשר על monolayer תא (12-72 שעות). חלקית תאי היעד רלוונטיים MHC היו עדיפים על מטרות רלוונטיות עבור assay alloCTL לעודד את ההדמיה של תנועתיות ולהפחית cytolysis תא בתיווך של monolayers לפני הגירה משמעותית יכולה להתרחש; שימוש במפעיל נמוך למקד יחס גם מאט את תמוגה. השימוש במטרות באופן חלקי בהתאמה מאפשרת ראיה טובה יותר של RRVשידור לתאים הסרטניים, כמו גם.

שימוש במיקרוסקופ הפוכה מאפשרת מספר יתרונות על פני היקף זקוף. היקף הפוך מאפשר הדמיה באמצעות תא humidified כך ששקופיות לא צריכה להיות מוטרדות, תוך שמירה על סביבת סטרילית לתאים. כמו כן, הדמיה באמצעות התא מספקת מחסום בין הדגימה והטכנאי, ומאפשר לעמידה ברמת בטיחות הביולוגית II (מנהלת הליגה השנייה) הנחיות בעת עבודה עם רקמות אדם נגזר 15.

אם אתם משתמשים בהיקף זקוף, ההגדלה הגבוהה ביותר להשגה מבלי להפריע מניסקוס החיובי של הבאר היא 20x. למרבה הצער, שימוש בcoverslip, או אביזרי ערכת אופטיקה לסעפת שקיעת תא, אינו מומלץ, כמו ההפרעה במניסקוס בדרך כלל תוצאות בהפצה שאינן חסיד תאי משקעים לאורך היטב. הדמיה פני תקופות זמן ארוכות עשויה לדרוש בנוסף זהיר של medium היטב כל אחד כדי להחליף את שהפסיד לאידוי, למרות שזה סביר יותר שיהיה צורך במהלך הדמיה הזמן לשגות.

פרוטוקול זה הוא שונה משיטות המודדות נדידת תאים אופקית של תאים חסיד בזיגמונד צ'יימברס 16,17, בתכנונם לא יאפשר להדמיה של נדידת תאים שאינם חסיד. מבחני אחרים שלהעריך הגירה אופקית לכיוון שיפוע chemotactic דרך מצע כגון אגר משמשים בדרך כלל ללימודי הגירה של תאים מסוג אחד 18-20. שימוש בCSM מספק מספר יתרונות לשיטות אלה, כמו גם שיטות המודדות הגירה / פלישה אנכית של תאים בתרבית, כגון בתאים בוידן או צלחות transwell Matrigel. ראשית, קשר תאי תאים מאפשר לקביעת אינטראקציה תא המטרה-מפעיל ופציעה על ידי תאי מפעיל. יכולת cytolytic של alloCTL-RRV-EMD תחילה מגורה על ידי כיוון אחד MLTR עם תאי גידול ממריץ 13-06-MG לparti שורת תאי U-87MG מותאם-MHC הברית ניכרה במרכז monolayer ב 24 ו -72 שעות הבאות שקיעה (איורים 3 ו -5, קווים מקווקווים). כמו גם, את ההשפלה של תאים TU-ידי 2,449 alloCTL העכברי גלויה ב -48 פוסט-שקיעת שעות (איור 4). Monolayer הוא נמחק במרכז הפקדת alloCTL, אבל מתרחש לאט יותר על פני יתרת monolayer, בשל או לחפיפה בביטוי HLA של 13-06-MG וU-87MG במבחנים עם תאים אנושיים 21 או נמוך החל מספר תאי מפעיל עבור גליומה העכברית. כמו כן, מפעיל למקד צפיפות מופחת כמפעיל alloCTL להעביר ממקום שקיעה. בנוסף להגירה וcytolysis, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחזות את ההעברה של חלבוני ניאון קידוד וירוס. הנה, העברת קידוד RRV לEMD מalloCTL לתאי הגידול ניכרה לאחר 72 שעות (איור 5, הבלעה).

class = "jove_content"> CSM תוכנן כראוי לבחינת ניידות תא שאינו חסיד בתאים חסיד. זה עיצוב אפשר להפרעה מזערית של תאי nonadherent עם monolayer התא חסיד כאשר הסעפת הוסרה. בנוסף, מרכז שקיעה בתוך הטפלון רעול פנים שקופיות היא זהות בכל טוב של הסעפת מאפשרת לשונות מופחתות בין משכפל הניסיוני. עם זאת, אפשרויות אחרות כגון גלילי זכוכית, טבעות שיבוט, או התקנים במכונה אחרים ניתן היו לאמת את למטרה דומה.

הגבלה של המודל הזה היא שהגירה ניתן להעריך רק במבחנה, אשר לא יכול להיות באמת רעיוני של הגירת in vivo. מגבלה נוספת היא שהדרגתיים קולט chemokine / chemokine לא ניתן לקבוע על פי המודל. בעוד אינטראקציות של תאי מערכת חיסון עם ECM או תאים סרטניים בודדים עדיין עשויות להתרחש ותלויות במה שהתאים אלה מפרישים או להביע, התחת של תנועתיות זואיי לא לענות על שאלות בשאלות האם אינם חסיד התאים יעברו באופן ספציפי לאו מגורמים מבודדים.

יתרון של assay זה הוא היכולת לקבוע אם אוכלוסייה של תאים שאינם חסיד לשמור על פונקציונליות נודדת אם יש לי לימפוציטים או לא היה transduced. בדוגמא שלנו, תת-אוכלוסיית transduced גלויה דרך ביטוי חלבון EMD, וברור שהפונקציונליות נודדת נשמר בתת-אוכלוסייה זו. יישום רחב יותר עשוי להיות כדי לבחון את ההשפעה של ריכוזים שונים של סוכנים או תרופות שעלולות להשפיע על נדידת תאים חיסונית שאינו חסיד. כמו כן, תאי hematopoietic אחרים עשויים להיבדק לניידות על מצעים שונים או תאים חסיד נגזרים מהרקמה נורמלית. לבסוף, למרות שזה לא נעשה כאן, זריעת שילוב של סוגים חסיד תא, כלומר, תאי סטרומה או תאים דנדריטים עם גידול, עשוי לספק ניתוחים רעיוני של יותר מורכב בסביבות vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

נתמך בחלקו על ידי NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI גרנט מספר UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, וג'ואן ס הולמס זיכרון קרן המחקר. MJH וGCO קיבלו תמיכה מג'ואן ס הולמס זיכרון דוקטורים המלגה באוניברסיטת קליפורניה. מכשיר CSM התקבל משיטות מדעיות Creative: www.creative-sci.com. וקטור lentiviral התקבל מאוניברסיטת UCLA וקטור Core, אשר נתמך על ידי DK041301 CURE / P30.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-masked microscope slides Creative Scientific Methods CSM002
Cell Sedimentation Manifold Creative Scientific Methods CSM001
Petri Dish, 150mm Corning 430597
Petri Dish, 35mm Corning 430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Mediatech 21-040
20 μl Pipetman Gilson F123600
200 μl Pipetman Gilson F123601
200 μl pipette tips VWR 89003-060
Distilled, deionized water (sterile) Mediatech 25-055
Trypsin Mediatech 25-054-CL
Celltracker Red CMPTX Invitrogen C34552
TrypLE Express (optional) Gibco 12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM) Mediatech 10-013
AIM-V serum-free media Invitrogen 12055-083
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E
Fibronectin BD 354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches Crosstex SCXS2
Trypan Blue Mediatech 25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience 65-0840-85
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
  2. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  3. Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
  4. Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
  5. Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
  6. Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
  7. Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
  8. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  9. Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
  10. Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
  11. Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
  12. Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
  13. Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
  14. Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
  15. Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
  16. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  17. Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
  18. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  19. Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
  20. Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
  21. Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).

Tags

אימונולוגיה גיליון 96 נדידת תאים שאינם חסיד מיקרוסקופ פלואורסצנטי סעפת שקיעת תא אלוגנאית CTL monolayer תאי T מטריצת חוץ תאית gliom
מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erickson, K. L., Hickey, M. J.,… More

Erickson, K. L., Hickey, M. J., Kato, Y., Malone, C. C., Owens, G. C., Prins, R. M., Liau, L. M., Kasahara, N., Kruse, C. A. Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (96), e52416, doi:10.3791/52416 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter