Abstract
Vi rapporterer en ny tilpasning av den radielle ett lag cellemigrering assay, først rapportert å måle den radielle migreringen av adherente tumorceller på ekstracellulære matriksproteiner, for måling av motiliteten av fluoresceinmerkede, ikke-adherente humane eller murine effektorceller immunceller. Denne teknikken benytter en rustfritt stål manifold og 10-vel Teflon lysbilde til fokalt sette ikke-heftende T-celler i brønner tilberedt med enten konfluente svulst cellemonolag eller ekstracellulære matrix proteiner. Lys og / eller flerkanals fluorescens mikroskopi blir brukt til å spore bevegelse og virkemåten av effektorceller over tid. Fluorescerende fargestoffer og / eller virale vektorer som koder for fluoriserende transgener som er brukt til å differensielt merke celletyper for avbildning. Denne metoden er forskjellig fra lignende type in vitro som sporer horisontal eller vertikal migrasjon / invasjon utnytte lysbilde kamre, agar eller Transwell plater. Analysen gir detaljerte bildedata til be samles med ulike celletyper preget av spesifikke fluorescerende markører; med spesifikke subpopulasjoner av celler (dvs. transdusert / nontransduced) kan overvåkes. Overflate intensitet fluorescens tomter er generert ved hjelp av spesifikke fluorescens kanaler som tilsvarer flyttingscelletype. Dette gir mulighet for bedre visualisering av ikke-klebende immuncellemobilitet til bestemte tider. Det er mulig å samle bevis fra andre effektor-cellefunksjoner, for eksempel cytotoksisitet eller overføring av virale vektorer fra effektor og målceller, så vel. Således tillater fremgangsmåten forskere å dokumentere mikroskopisk celle-til-celle-interaksjoner av differensielt-merket, ikke-klebende med adherente celler av forskjellige typer. Slik informasjon kan være spesielt relevant i vurderingen av biologisk-manipulert eller aktiverte immuncelletyper, hvor visuelle bevis på funksjonalitet er ønskelig med svulst målceller før deres bruk for kreftbehandling.
Introduction
Den radielle ett lag cellemigrering analysen ble opprinnelig utviklet for å måle de infiltrerende egenskaper av adherente tumorceller 1-4 på objektglass belagt med ekstracellulær matriks (ECM) proteiner 5-7, eller med individuelle ECM-komponenter, så som fibronektin og laminin 1,2. Teknikken involvert poding en enkelt cellesuspensjon av tumorceller i sentrum av brønner ved hjelp av en rustfri stålcelle sedimente manifold (CSM). Etter sedimentering, vil tumorcellene holder seg til bunnen av brønnen, og den endring i diameteren av den opprinnelige cellepopulasjon over tid ble brukt for å etablere en hastighet på horisontal motilitet. Radial med ett lag Cell Migration analysen gitt en visuell fordel fremfor andre eksisterende metoder som benyttes Transwell platene til analysen in vitro trekkende evner av celler; disse analysene er ikke-bidrar til bildebehandling 8. Også, det ga også en stor grad av frihet i valg av endepunktets når migrasjon vurderes, med ingen begrensning på antall tidspunkter en forsker kunne velge å image etter sedimentering.
På grunn av at evnen til å migrere er en viktig funksjon for ikke-adherente celler, spesielt i området av immunterapi eller hvor de kan bli brukt som avleveringsbærere for virale vektorer, vi tilpasset bruken av CSM å evaluere migrering av ikke-adherente celle typer på tumorcellemonolagene, i tillegg til ECM-proteiner. Den ekstra fordelen av mikroskopisk visualisering migrering av ikke-adherente celler på levedyktige tumorcellemonosjikt, på komplekse ECM isolert fra svulsten, eller på individuelle ECM komponenter gjør denne analysen allsidig. Analyser som baserer brønner belagt med et enkelt ekstracellulært protein gjenspeiler ikke nøyaktig ECM vev substrat eller svulst cellene ville migrere gjennom in vivo.
Her brukte vi alloreaktive cytotoksiske T-lymfocytter (alloCTL), er sensibilisert for større histocompatibility kompleks (MHC) proteiner ved hjelp av enveis blandet lymfocytt tumorcellereaksjoner (MLTR) eller blandede lymfocytreaksjoner (MLR) 9, som vår representant ikke-klebende celletype. Vi testet celler av både human og murin opprinnelse. Når migrasjon ble målt på kreft monolag, svulstcellene ansatt var enten delvis relevante mål, viser noen av de samme MHC proteiner som finnes på cellepopulasjonen brukes til å bevisstgjøre effektorene, eller fullt relevante mål, med et komplett sett av MHC molekyler som den effektorer hadde blitt sensibilisert mot. I noen eksperimenter brukte vi fluorescerende CellTracker Red CMPTX eller celleproliferasjon fargestoff eFluor 670 for å skille mellom effektorceller og målceller. Vi har også brukt transduksjon med virale vektorer som koder for fluorescerende proteiner som en ytterligere måte å visualisere cellene. For enkelte analyser, omformet vi alloCTL med retrovirale Replikere vektorer (RRV) koder for Emerald Grønn (EMD) fluorescerende protein 10,11; for ådeers, ble kreftceller transdusert med lentiviral vektorer som koder for mStrawberry.
Den alloCTL ble sådd gjennom en kanal av manifolden inn i sentrum av enten tumorcellemonolagene eller ECM høstet fra tumorcellemonolagene. Adherente og ikke-adherente celleinteraksjoner ble visualisert ved hjelp av lys og / eller ved fluorescens mikroskopi over tid. Forstyrrelser i tumorcellemonolaget med lav effekt, eller tumorceller med fragmenterte kjerner med høy effekt var indikatorer på celleskade etter lysis og apoptose, respektivt. Vi har laget digitalt overflateintensitets fluorescerende kart som viser migrering av ikke-adherente fluorescerende T-celler i løpet av de monolagskulturer. Vi har også bemerket cytotoksisitet skapt til tilhenger glioma cellemonolag etter klyngedannelse av den kledde ikke-klebende alloCTL. I tillegg ble horisontal transduksjon av RRV-EMD fra alloCTL til glioma monoskikt observert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Skyv Forberedelse
- Sett Cell Sedimentation Manifold glir inn sterilisering poser og forsegle med autoklav tape. Face the teflonbelagt side av raset papirsiden av posen for å unngå plastavleiringer på brønnene.
- Autoklav poser for 15 minutter ved 121 ° C.
- Fjern lysbilde fra sterilisering posen inne en biosikkerhet skap og plass i et sterilt 150 x 15 mm steril petriskål. Opptil fire lysbilder kan passe per parabolen. Plasser en 35 x 10 mm petriskål ved siden av skinnene. Legg 2-3 ml steril H2O for å gi fukting.
- Pre-coat lysbilder med poly-D-lysin i 100 ug / ml ved hjelp av nok volum til å dekke hele godt. Etter en time ved romtemperatur, suge løsningen og skyll overflaten av brønnen to ganger ved å pipettere 1 x PBS over overflaten av brønnene.
- Eventuelt legge fibronektin eller andre ECM-komponenter for å sikre sterkere svulst celle tilslutning. Legg fibronektin på 5 mikrogram / ml i nok volum that brønnene tørker ikke i løpet av kort tid ved romtemperatur.
- Etter 1 time, aspirere left løsning og vask to ganger ved å pipettere opp og ned med 1 x PBS.
- Hold PBS på brønnene før svulsten er klar for platekledning. Bruk glir samme dag.
- Høste en konfluent kolbe ønsket tilhenger tumor celletype. Telle levedyktige celler ved hjelp av Trypan blått fargestoff utelukkelse av lys mikroskopi og resuspender på 5 x 10 6 celler / ml i tilstrekkelig-bufret vekstmedium, for eksempel Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), L- glutamin og natriumpyruviat.
- Dersom selvlysende avbildning av den heftende cellepopulasjon ønskes, merke adherente cellepopulasjonen med en vital fluorescerende fargestoff, eller en celle proliferasjon fargestoff ved å følge protokollene som leveres av produsenten.
- Jevnt pipettere 10 mL av komplett medium i hver brønn av raset ta vare å unngå å skape bobler i wells, da disse kan hindre uniform svulst celle tilslutning.
- Legg 2,5 til 5,0 x 10 4 celler (5-10 ul av cellesuspensjonen) til mediet i hver brønn (figur 1A). Juster det optimale antall, avhengig av tumorcelletype og antall dager med vekst ønskede. Større tumorceller eller rask voksende celler kan kreve færre celler i utgangspunktet. Bringe godt volum opp til 40 ul ved tilsetning av medium og pipetten opp og ned for å sikre en jevn fordeling av cellene.
- Etter at alle brønnene er seeded, tillate kreftceller til å følge ved RT, deretter plassere lokket på 150 x 15 mm petriskål og nøye flytte parabolen til en 37 ° C / 5% CO 2 fuktet inkubator i minst 24 timer.
- Endre kulturen medium daglig. Pipettere forsiktig en del av det brukte mediet fra monolaget og erstatte med friskt komplett medium.
MERK: På grunn av fordampning, vil mer volum må legges enn ble tatt ut. Brønnene vil være klar for analyse når en selv, confluent lag av celler er til stede. Dette er vanligvis 1-3 dager etter første seeding. - Vask monolag forsiktig en gang med PBS som beskrevet i trinn 1.4, og går videre til trinn 2 hvis monolag er ønskelig, eller til trinn 1.13 nedenfor for å ekstrahere ECM-proteiner fra monolag.
- Foreta en 0,5% Triton-X (v / v) løsning i komplett medium og tilsett 30 ul til hver brønn. La monolag fordøye i hetten i 2 minutter, deretter vaskes to ganger med komplett medium ved pipettering, som beskrevet ovenfor.
MERK: ECM Laget kan være synlig ved lysmikroskopi (figur 2). Bruk lysbilder med en gang, eller holde i fullstendig medium i fuktet CO 2 inkubator for 1-2 dager. Ikke la brønner for å tørke ut.
2. Sedimentasjon av ikke-heftende T-celler over på Slide
- Dersom selvlysende avbildning av den ikke-heftende cellepopulasjon ønskes, merke de ikke-adherente cellepopulasjoner med en vital fluorescerende fargestoff, slik som CFSE, Cell Tracker Red CMPTX eller eFluor670 ved å følge protokollene som leveres av produsenten minst 1 time før forsøket. Alternativt kan manipulere celler til å uttrykke fluorescerende proteiner kodet av virale vektorer.
- Autoklaver i cellen sedimentemanifolden i en autoklav pose som beskrevet i 1.2.
- Fjern den fuktet kammer som inneholder Teflon belagt lysbilder fra inkubatoren og plass i biologisk sikkerhetskabinett.
- Vask brønnene med 1 x PBS ved å pipettere opp og ned, og deretter legge til 45 pl av komplett medium inneholdende minst 10% serum.
- Fjern manifolden fra steriliserings konvolutt og forsiktig gli inn over brønnene inntil "krok" ved enden av manifolden i berøring med bunnen av sleiden (figur 1B).
- Sikre at kulturmediet er synlig i hver av kanalene. Hvis ingen er sett, ta av manifolden og legge mer medium til tilsvarende godt, og sett og sjekk igjen.
- Gjenta trinn 2.5 for hver channel av manifolden, eller for så mange brønner som ønsket.
- Tell ikke-adherente celler og resuspender på ikke mindre enn 1,0 til 2,0 x 10 5 / ul. Utarbeide en mL av celler og sakte pipette dem inn i kanalen (figur 1C). Gjør dette for hver brønn ønskelig.
- La hele cellen lastet anordning, dvs. manifolden og slide, på innsiden av bio-hette i 20-30 min for å tillate at cellene i kanalen til å slå seg.
- Fjern manifolden ved å berøre begge ender og forsiktig løfte den rett opp fra raset, slik som å ikke forstyrre cellene fokalt seeded i sentrum av brønnene (Figur 1D).
- Inspisere hver brønn for å sikre at de ikke-adherente celler har blitt podet på midten av brønnen holde seg innenfor omkretsen av manifoldkanal. De ikke-adherente celler vil ideelt litt følge den monolayer eller ECM og til hverandre, derfor forsiktig bevegelse raset rundt vil ikke føre til at cellen pellet å spre. Ikke skubbe lysbildet.
3. Fluorescensmikroskopi
- Med riktig eksperimentelt utstyr, utføre bildebehandling etter sedimentering er bekreftet. Bruk helst et mikroskop som er utstyrt med et CO 2 og fuktighet kammer. Bilde med lav effekt, dvs. 4X eller 10X, for å tillate flere bilder for å bli tatt fra et større område, slik at helheten av brønnen kan bli sett.
- Tilegne seg digitale bilder ved hjelp av Image Capture programvare. Utføre lysfelt og / eller flerkanals fluorescens bildebehandling.
- Dersom det er ønskelig, sett opp en time-lapse å lagre bilder i ulike kanaler over et gitt område, eller holde lysbilde fuktet og i en 37 ° C / 5% CO 2 inkubator og manuelt ta ut til bilde på tidspunkter ønskede (Figur 1E & F, anbefales for lengre tidspoeng).
4. Analyse og skjerm
- Ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare, flette lys og fluorescent bilder til et lag slik at flere celletyper og markører kan bli sett i det samme bildet. Dra og slipp bildefilene for hver enkelt farge inn i programmet, og når du blir bedt om, velger du "Legg Layer 'mulighet til å opprette en bildefil med flere lag.
- Ved høyere forstørrelse, ta, justere og sy sammen bilder på tvers av brønnen digitalt. Rett filer ved å se på bevarte deler mellom to bilder og overliggende ett bilde på toppen av den andre inntil et komplett bilde er generert.
- Legg micron barer til bildene under oppkjøpet bruker fange programvare for å bestemme avstand enkelte cellene har migrert.
- Å bestemme cellemigrasjon til ulike tider, gjør overflaten intensitet fluorescens kart med bildeprogramvare, dvs. ImageJ, for å kvantifisere fluorescerende T-celle aggregering eller spredt over tid.
- Å generere overflate tomter, ta en lagdelt bilde generert i trinn 4.1 og under Layers-vinduet,fjern alle lagene bortsett fra de som svarer til kanalen ønsket. For eksempel, hvis et overflateflekk er ønskelig å visualisere EMD ekspresjon, bør bare de "grønne" lag svarende til filteret som brukes for denne markeringen være synlig.
- Flat ut bildet og lagre det i et filformat anerkjent (f.eks, PNG) og laste bildet inn i programmet. Å generere overflaten tomten, endre bildetypen til 8-bit, endre lysstyrke / kontrast som nødvendig for å redusere bakgrunns, og velg 'Analyser / Surface Plot alternativet. Bildene i figur 5 ble generert ved å sjekke "Shade", "Tegn Axis ',' En Polygon Per Line", og "glatt" boksene.
- Alternativt tar målinger ved hjelp av radius eller diameter fra det sentrale celle-innskuddet ved tid null, og null til cellene ved det ytterste punkt på forskjellige tidspunkter. Diameteren av Teflon brønner er 6,0 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virale vektorer som koder for fluorescerende proteiner kan brukes i tillegg til eller i stedet for, fluorescerende fargestoff. Viral transduksjon bør utføres i forkant av motilitet analysen. Både tilhenger og ikke-heftende celletyper kan være forskjellig-merket. Protokollen for transduksjon vil avhenge av den type vektor som anvendes. Her transdusert vi alloCTL i figur 3, 5 og 6 med RRV-EMD minst to dager i forkant av analysen ved hjelp av protokollen beskrevet 12. Vi har også brukt en lentiviral vektor, CMV-Jordbær-IRES-FLUC2, å transduce tumorceller for å uttrykke mStrawberry røde fluorescerende protein (figur 4). Denne transduksjon ble oppnådd ved tilsetning av vektoren til kolben av celler i 48 timer, på hvilket tidspunkt, ble friskt medium tilsatt. Etter at cellene for å gjenopprette i to dager, begrensende fortynning ble utført for å generere en populasjon av 100% transduserte celler.
(figur 3 og 5). Fluorescensmikroskopi viser celler, opprinnelig sådd ut ved midten av brønnen, vandrer bort fra midten over tid. Dannelsen av aggregater alloCTL etter 4 timers (figur 3, hvite piler) er sannsynlig reflekterende av autokrine vekstmønstre som oppvises av aktivert, IL-2-produserende T-cellepopulasjoner 13.
I et annet eksperiment, ble muse-effektor alloCTL laget av enveis MLR ved hjelp av haplotype H-2d Balb / c-splenocytter responder og haplotype H-2b / k stimulatorer splenocytter fra mus B6C3F1, belastningen som TU-2449 glioma er syngen. Umiddelbart før poding gjennom kanalen tHan manifolden på tumorcellemonolaget ble det alloCTL farget med eFluor 670. Den alloCTL (purpur-celler) ble sådd ut i sentrum av etablert monolag av TU-2449 glioma celler (røde) som var 100% transdusert med CMV-Straw- IRES-FLUC2 viral vektor, og belagt på brønnene dagen før analysen. Figur 4a og b viser mikroskopiske bilder som er tatt av den samme kvadrant av samme brønn ved 1 og 48 timer. Figur 4C og D ble generert ved hjelp ImageJ å konvertere digitalisert fiolett fluoresens intensiteter inn kvantitative overflate tomter som vises i tredimensjonal format.
Til slutt ble human alloCTL laget med inaktivert stimulatorer menneskelige hjerne-tropisk celler avledet fra metastatisk brysttumorcellelinjen MDA-MB-231BR av MLTR. Figur 6 viser lys og fluorescens mikroskopi bilder over tid av ikke-adherente CMPTX-merket alloCTL, delvis transdusert med RRV-EMD, migrerer på ECM proteiner utvunnet fROM disse kreftceller. I (A) viser fotomikrograf lysfelt fokal plassering av alloCTL umiddelbart etter sedimentering. I (B og F) lysfelt mikrofotografier viser, ved 4 og 8 timer, henholdsvis, den alloCTL radialt migrere på ECM. Den alloCTL tetthet avtar med avstanden fra sentrum av brønnen (sentrum for godt er øvre venstre hjørne av feltet i BI). Paneler (C og G) viser hele alloCTL forberedelse farget med CMTPX, (D og H) viser delvis transduksjon av alloCTL med RRV-EMD som angis av små mengder EMD + T-celler, og (E og I) viser de fusjonerte bilder av RRV-EMD transdusert alloCTL migrerer på ECM sammen med untransduced alloCTL.
Figur 2. Tumor cellemonolag og ECM belagt på CSM lysbilde brønner. Photomicrographs av lysbilde brønner forberedtmed (A) sammenflytende U-87MG glioma cellemonolagene, eller (B) ECM-proteiner ekstrahert fra sammenflytende U-87MG farget med Coomassie blått fargestoff. Bar = 200 mikrometer. Klikk her for en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Migrering og cytotoksisitet av RRV-EMD transduserte lymfocytter på midten og forkanten av celle innskudd over tid. Fluorescent photomicrographs tatt på ulike tidspunkter i forkant og i sentrum av alloCTL-RRV-EMD etter sedimentering på et enkeltlag de heft U-87MG gliomceller. Effector alloCTL seedet som enkeltceller, danner sfæriske klynger innenfor 4 timers (hvite piler) for plassering. Enkelt fluoresceinmerkede CTL har migrert fra sentrum av den vel ens tiden utvikler seg. Etter 24 timer, tom celle flekker i adherente monolaget er synlig antagelig på grunn alloCTL cytolyse av tumor target-celler (se område innenfor streker). Bar = 200 mikrometer. Klikk her for en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Radial migrering av murine alloCTL farget med eFluor 670 på mStrawberry-merkede gliomceller vist ved 1 og 48 timer. Fluorescent mikrofotografier av en kvadrant av samme brønn ved (A) i 1 time og (B) 48 timer etter sedimentering av fluorescensmerket -merket ikke-klebende alloCTL på et monolag av TU-2449 gliomceller. De lave strømmikrofotografier reflektere areal som ligger innenfor en kvadrant av CSM brønnen (radius på 3 mm). Ved høy effekt (A og B, innfellinger) alloCTL (hvite piler) er vist i tilknytning til eller forbundet med individuelle tumorceller; man har en nedbrutte utseende med fragmenterte kjerner og er apoptotisk. (C og D) respektive overflateintensitet fluorescens kart oppnådd ved anvendelse ImageJ software som viser bildeelementverdiene for de digitaliserte lilla fluorescerende bilder i tredimensjonal grafisk form og plassert på et gitter som representerer brønnradius 3 mm. Bar = 500 mikrometer. Klikk her for en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Migrasjon av alloCTL og horisontal spredning av RRV-EMD fra transduserte alloCTL til kreftceller. Fluorescent photomicrographs serielt sydd sammen for å dekke radius av brønnen ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Migrasjon av RRV-EMD transdusertalloCTL (hvite piler) er vist på et enkeltlag av U-87MG tumorceller ved 0 og 72 timer etter sedimentering. RRV-EMD transduksjon av tumorceller i monolag er også tydelig ved 72 timer etter tilsetning av EMD-transdusert alloCTL, noe som indikerer at horisontal overføring av infeksiøst RRV fra lymfocytter til tumorceller har oppstått (hvit boks, og innfelt). Bar = 200 mikrometer. Klikk her for en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Radial migrasjon av alloCTL transdusert med RRV-EMD og farget med CellTracker Red CMTPX. Celler ble sedimentert på ECM ekstrakter utvunnet fra MDA-MB-231BR celler. Migrering av alloCTL ble fotografert ved lysfelt lysmikroskopi ved 0, 4 og 8 timer (A, B, F kolonne 1, henholdsvis). Fluoreduft bilder av CMPTX (rød) merket alloCTL (C, G, kolonne 2), RRV-EMD (grønn) transdusert alloCTL (D, H, kolonne 3), og de sammenslåtte bilder (E, I, kolonne 4) er vist ved 4 og 8 timer. Barer = 200 mikrometer; Bar vist i B gjelder for bilder CI. Klikk her for en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorceller i en enkelt cellesuspensjon ble pipettert inn i brønnene til en teflon-maskert lysbilde. Cellene ble tillatt å overholde, og deretter formet monolag i en fuktet 5% CO2, 37 ° C inkubator (figur 1A). Etablerte monolag eller ECM proteiner fra den monolayer kan høstes for disse analysene (Figur 1b). Effektor T-lymfocytter som er merket med vitale fluorescerende fargestoffer eller transdusert med vektorer som koder for EMD ble sådd inn i sentrum av brønnen ved hjelp av en CSM. Evnen av ikke-adherente effektor T-lymfocytter til å migrere på monolaget eller ECM-proteiner over tid ble så evaluert og kvantifisert med lys og fluorescens mikroskopi. Her har vi undersøkt migrering og cytotoksisitet av ikke-klebende effektor alloCTL på et monolag av delvis relevant mål-U-87MG glioma celler (figur 3 og 5). Disse målceller, viser bare noen av Human Leukocyte Antigen(HLA) molekyler (HLA-A2, B44) funnet på de opprinnelige stimulatorer, ble brukt til å redusere den potente lytisk aktivitet som ville bli vist av alloCTL til relevante 13-06-MG målceller (HLA-ã1,2 og B44 , 57). Vi har også observert mobilitet av alloCTL på ECM høstes fra et monolag av MDA-MB-231BR brysttumorceller (figur 6). Den alloCTL ble samlet ved enveis MLTR i henhold til metoder som tidligere er publisert 9.. Effector alloCTL ble høstet 4-5 dager etter enveis MLTR og omformet med RRV-GS4-EMD (figur 3 og 5) eller RRV-ACE-EMD (figur 6) 10,11. Høyere transduksjon nivåer ble oppnådd med GS4 vektoren anvender en Gibbon ape leukemivirus konvolutt enn med amfotropisk ACE-vektoren. Ved hjelp av denne radial migrasjon analysen, bemerket vi at både transdusert og nontransduced fluoresceinmerkede alloCTL hadde vandrende kapasitet. Vi viser også at de beholder sin evne til å bli cytotoxic etter under manipulasjoner for RRV transduksjon.
Evne murine alloCTL å migrere ble også vurdert (figur 4). alloCTL sensibilisert for haplotype H-2b / k vises av TU-2449 celler ble farget med eFluor 670 (lilla) og en migrasjon analysen ble utført ved hjelp av TU-2449 omformet med CMV-Straw-IRES-FLUC2 (rød). Ved bruk av fullt relevant mål, ble et lavere antall alloCTL effektorceller podet for å hindre hurtig lysering av tumorcelle mål. Ved hjelp av 1 time som en grunnlinje, er T-celler hovedsakelig lokalisert ved høy tetthet i sentrum av brønnen som en enkelt cellesuspensjon. De 48 hr mikrografer viser utstrakt migrering av T-celler mot den ytre kanten av brønnen og gruppering av alloCTL er lett synlig med ødeleggelse av tumorceller på stedet av sitt opprinnelige innskudd. Spredning av TU-2449 celler er dokumentert som mStrawberry merkede celler øker i tetthet over brønnen. Dette er bedre vist i overflatenfluorescens-plott som ble generert for å visualisere fordelingen av lilla celler i brønnene (figur 4, bunnplate). AlloCTL mobilitet er mye mer tydelig i brønnen i 48 timer sammenlignet med en referanse hr. I likhet med det som ble sett i de analyser som anvender humane alloCTL og glioma-celler, er en klaring på tumorcellene rundt delen av den opprinnelige innskudd av effektorer merkbar ved 48 timer, noe som tyder på lysis av tumor målceller.
Et viktig skritt i denne analysen er veksten av sunne monolayers og påfølgende høst av 'skjelett' ECM. Poding av tumorcellene på 2,5 - 5,0 x 10 4 celler pr brønn, i henhold til trinn 1.9 ovenfor, vanligvis resultert i en omtrent selv monolag for tumorcelletyper vi brukte. Vi har funnet det viktig å tillate at tumorcellene til å følge ved RT, ellers konveksjon som oppstår ved 37 ° C vil presse cellene mot midten av brønnene. I tillegg, for-belegg av brønner with poly-D-lysin og / eller en ECM-proteiner som fibronektin eller kollagen i stor grad kan øke suksessrate. I tillegg hadde vi bedre suksess med disse analysene bruker monolayer-avledet 'skjelett' ECM enn med individuelle ECM-komponenter (ie., Fibronectin, kollagen), som viste mye mindre pålitelig. Det er viktig å eksperimentere med antallet ikke-adherente celler for å avsette gjennom sedimenteringsmanifolden også, og ved bruk av en ren celletype, kan man teoretisk sett være i stand til å definere en motilitet koeffisient med denne analysen. Fordi brønnvolumet er lite, og noen fordampning av medium skjer, må monolaget etterfylles daglig med friskt medium. Media erstatning hindrer også akkumulering av giftig laktat som cellene vokser og deler seg. Unnlatelse av å dyrke en sunn monolag kan resultere i utstøtingen av monolag eller ECM fra brønnoverflaten.
De coomassieblått farget ECM proteiner fra U-87MG glioma celle line i henhold til trinn 1.13 ovenfor er vist som en visuell eksempel på den vedheng substratlag igjen etter spalting med Triton X-100 (figur 1B). ECM produksjon fra et brystcancer cellelinje MDA-MB-231BR celler, som ofte var usammenhengende og tynn, noe som resulterer i en ECM-lag som var mer dårlig vedheftende og noen ganger løftes fra sleiden under analysen. ECM protein tilslutning til raset forbedret når kreftceller ble opprettholdt som konfluent monolayers i 1-2 dager før fordøyelsen. Gjennom hele prosessen, vedlikehold av Teflon tetning som omgir brønnen var også viktig. Å holde volumet lavt og minimere eksponering av Teflon til Triton-X100 løsning reduseres skade på integriteten av teflonpakning.
En tilpasning av denne protokollen kan være bruk av en tredimensjonal ekstracellulære matrise høstet fra deler av oktober innebygd svulstvev 14. Imidlertid bør det bemerkes at avstanden fra den flate bottomed godt til lysbilde overflaten er bare 1 mm; dermed kan deler stiger denne tykkelsen bli forstyrret av manifold plassering. Dessuten ville en fremgangsmåte trenger å være utformet for å gjøre en liten Burr hull i vevet til å akseptere dråpen av medium inneholdende de ikke-adherente celler.
Fremstilling av en godt dispergert enkelt cellesuspensjon av effektor T-lymfocytter før sedimentering var også viktig. Lett tituration av de ikke-adherente T-celler for å spre aggregater i en enkelt cellesuspensjon var et viktig trinn rett før lasting av alloCTL inn i kanalene i CSM. Bruk av ikke-enzymatiske celledissosiasjon buffere bør benyttes hvis det er nødvendig. Videre bør tettheten av effektor-lymfocytter være rundt 1,0 til 2,0 x 10 5 celler / mL for sedimentering, som beskrevet i trinn 2.8 over. Lave celletall kan resultere i ingen sedimentasjon, mens høyere celletall kan føre til et stort innskudd som er lett å forstyrre ved flytting avskyv. Det anbefales også at serumkonsentrasjonen i mediet være minst 10% for å gi tilstrekkelig overflatespenningen i positiv menisken som reduserer muligheten for ringvirkninger.
En invertert lys mikroskop med fluorescens imaging evner og en 4x eller 10x mål er optimal for denne analysen. Tidspunktene for bildebehandling kan bestemmes i henhold til individuelle eksperimentelle henvendelser og celletyper. Den ikke-klebende CTL særlig migrere fra sentrum av sedimentering mot kanten av brønnen raskere på ECM-proteiner (4-8 t) enn over en celle monolag (12-72 timer). Delvis MHC relevante målceller var å foretrekke fremfor relevante mål for vår alloCTL analyse for å oppmuntre til visualisering av motilitet og redusere celle-mediert cytolyse av monosjiktene før betydelig migrasjon kan oppstå; bruk av en lav effektor og mål-forhold også bremser lysis. Bruken av delvis matchede mål gir bedre visualisering av RRVoverføring til tumorcellene i tillegg.
Bruk av et invertert mikroskop gir flere fordeler i forhold til en opprettstående ramme. En invertert siktet kan for avbildning gjennom fuktet kammer slik at slides ikke trenger å bli forstyrret, og samtidig opprettholde et sterilt miljø for cellene. Også, bildebehandling gjennom kammeret gir en barriere mellom prøven og tekniker, noe som åpner for tilslutning til biosikkerhet nivå II (BSL II) retningslinjer når du arbeider med menneske-avledet vev 15.
Hvis du bruker en oppreist omfang, den høyeste forstørrelse oppnåelig uten å forstyrre den positive menisken av brønnen er 20x. Dessverre er bruken av et dekkglass, eller optikk kit tilbehør til cellen sedimente manifold, anbefales ikke, da avbrudd i menisken vanligvis resulterer i spredning av de sedimenterte ikke-adherente celler i hele brønnen. Imaging over lange tidsperioder kan kreve forsiktig tilsetning av MedIUM til hver brønn for å erstatte det tapte til fordampning, selv om dette er mer sannsynlig å være nødvendig under time-lapse bildebehandling.
Denne protokollen er forskjellig fra fremgangsmåter som måler horisontale cellemigrering av adherente celler i Zigmond Chambers 16,17, vil en utforming som ikke tillater for visualisering av ikke-adherente cellemigrering. Andre analyser som evaluerer horisontal migrering mot en kjemotaktisk gradient gjennom et substrat slik som agar er vanligvis brukt for å studere migrering av en celletype 18-20. Bruk av CSM gir flere fordeler for disse fremgangsmåter, så vel som metoder som måler vertikal migrering / invasjon av dyrkede celler, for eksempel i Boyden kammere eller Matrigel Transwell platene. For det første tillater celle-celle-kontakt for en bestemmelse av target-effektor-celle-interaksjon og skade av effektorceller. Den cytolytiske evne alloCTL-RRV-EMD innledning stimulert av enveis MLTR med stimulatorer 13-06 mg tumorceller til det partially MHC-matchet U-87MG cellelinje er tydelig i midten av monolaget ved 24 og 72 timer etter sedimentering (figur 3 og 5, stiplede linjer). I tillegg, er nedbrytningen av TU-2449-celler ved murine alloCTL synlig ved 48 timer etter sedimentering (figur 4). Monolaget er utslettet ved midten av alloCTL innskudd, men forekommer mer langsomt over resten av monolaget, på grunn av enten til overlappingen i HLA ekspresjon av 13-06-MG og U-87MG i assayene med humane celler 21 eller den lave utgangs antall effektor-celler for den murine glioma. Dessuten er effektor og mål tettheten reduseres som effektor alloCTL migrere bort fra sedimenteringsstedet. I tillegg til migrasjon og cytolyse, kan denne protokoll benyttes for å visualisere overføring av virus som koder for fluorescerende proteiner. Her, er overføring av RRV koder for EMD fra alloCTL til tumorcellene tydelig etter 72 timer (figur 5, innfelt).
En begrensning ved denne metoden er at migrasjon bare kan vurderes in vitro, som ikke kan være helt reflekterende av in vivo-migrasjon. En annen begrensning er at chemokine / kjemokinreseptor gradienter ikke kan etableres ved hjelp av modellen. Mens interaksjoner av immunceller med ECM eller individuelle tumorceller kan likevel forekomme og er avhengig av hva disse cellene skiller ut eller uttrykke, dette motilitet assay ville ikke svare på spørsmål om hvorvidt de ikke-heftende celler vil migrere spesifikt til eller bort fra isolerte faktorer.
En fordel med denne analysen er evnen til å bestemme om en populasjon av ikke-adherente celler opprett vandrende funksjonalitet hvis lymfocytter har eller ikke har blitt transdusert. I vårt eksempel er transduserte undergruppe synlig gjennom EMD protein uttrykk, og det er klart at trekkfugl funksjonalitet opprettholdes i denne undergruppe. En bredere anvendelse kan være å teste effekten av forskjellige konsentrasjoner av midler eller stoffer som kan påvirke ikke-klebende immuncellemigrering. Dessuten kan andre hematopoetiske celler testes for mobilitet på ulike substrater eller heftende celler avledet fra normalt vev. Til slutt, selv om det ikke er gjort her, såing av en kombinasjon av adherente celletyper, dvs. stromale celler eller dendrittceller med tumor, kan gi analyser reflektert av mer kompleks in vivo miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Støttet delvis av NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Number UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, og Joan S. Holmes Memorial forskningsfond. MJH og GCO mottatt støtte fra Joan S. Holmes Memorial postdoktorstipend ved UCLA. CSM enheten ble hentet fra Creative vitenskapelige metoder: www.creative-sci.com. Den lentiviral vektor ble mottatt fra UCLA Vector Core, som er støttet av CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
