Abstract
まず、蛍光標識、非接着性ヒトまたはマウスエフェクター免疫細胞の運動性を測定するために、細胞外マトリックスタンパク質に付着した腫瘍細胞の半径方向移動を測定することが報告され、ラジアル単層細胞移動アッセイの新規適応を報告する。この技術は、ステンレス鋼製マニホールドと10ウェルテフロンスライドが局所的にコンフルエント腫瘍細胞単層または細胞外マトリックスタンパク質のいずれかを用いて調製したウェルに非接着T細胞を堆積するために使用する。光および/またはマルチチャネル蛍光顕微鏡は、経時的にエフェクター細胞の移動および動作を追跡するために使用される。蛍光色素および/または蛍光の導入遺伝子のためのコードは、示差的イメージングのための細胞型を標識するために使用されるウイルスベクター。この方法は、スライドチャンバー、寒天またはトランスウェルプレートを利用して、水平または垂直の遊走/浸潤を追跡するインビトロアッセイにおいて同様の型と区別される。アッセイは、詳細な撮像データをbを可能にする特定の蛍光マーカーで区別異なる細胞型で集めE;細胞（ すなわち 、形質導入し/形質導入された）であっても、特定の亜集団を監視することができる。表面強度の蛍光プロットが移行細胞型に対応する特定の蛍光チャネルを使用して生成される。これは、特定の時間に非接着性免疫細胞の移動性の良好な視覚化を可能にする。それは同様に、標的細胞へのエフェクターのようなウイルスベクターの細胞毒性または転送などの他のエフェクター細胞機能の証拠を収集することが可能である。したがって、この方法は、研究者が微視的に様々な種類の接着性細胞を示差的に標識され、非接着性の細胞間の相互作用を記録することができる。このような情報は、機能の視覚的な証拠は、癌治療のためのそれらの使用の前に腫瘍標的細胞に所望される生物学的に操作されまたは活性化免疫細胞型の評価に特に関連し得る。
Introduction
ラジアル単層細胞遊走アッセイは、本来細胞外マトリックス（ECM）タンパク質5-7またはフィブロネクチンまたはラミニン1,2のような個々のECM成分でコーティングされたスライド上に付着した腫瘍細胞1-4の浸潤特性を測定するために開発された。技術は、ステンレス鋼、細胞沈殿マニホールド（CSM）を使用して、ウェルの中心における腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を播種関わる。沈降した後、腫瘍細胞がウェルの底に付着すると、経時的な最初の細胞集団の直径の変化は、水平運動の速度を確立するために使用した。ラジアル単層細胞遊走アッセイは、細胞のインビトロ渡り鳥の能力をアッセイするトランスウェルプレートを採用し、他の既存の方法より視覚的な利点を提供した。これらのアッセイは、イメージング8非資する。同様に、それはまた、時点の選択の自由度を多量に提供移行が、評価される時点の数に制限して、研究者が沈降した後の画像に選択することができるときだ。
移行する能力は、特に免疫療法の領域、またはどこにウイルスベクターのための送達ビヒクルとして使用することができる、非接着細胞のために重要な機能であるため、我々は、非接着性細胞の遊走を評価するためにCSMを使用するように適合ECMタンパク質に加えて、腫瘍細胞の単層上型。顕微鏡的に、または個々のECMコンポーネントの腫瘍から単離された複雑なECMに、生存腫瘍細胞単層上の非付着性細胞の遊走を可視化するという追加の利点は、このアッセイは、汎用性になる。シングル細胞外タンパク質でコーティングしたウェルを採用するアッセイは正確に細胞が生体内で通って移動したいのECM組織基質または腫瘍を反映するものではありません。
ここでは、主要なhistocompに感作、アロ反応性細胞傷害性Tリンパ球（alloCTL）を使用一方向混合リンパ球腫瘍細胞反応（MLTR）または私達の代表的な非付着性の細胞型などの混合リンパ球反応（MLR）9を使用して、複合体（MHC）タンパク質atibility。我々は両方のヒトおよびマウス由来の細胞をテストした。移行が腫瘍単層上で測定したところ、採用された腫瘍細胞は部分的に関連する標的は、MHC分子の完全なセットのエフェクター、または完全に関連する標的を、感作するために使用される細胞集団に見られるのと同じMHCタンパク質の一部を表示し、あったことエフェクターは、向かって感作されていた。いくつかの実験では、エフェクター細胞および標的細胞を区別するために、蛍光CellTrackerレッドCMPTXまたは細胞増殖色素eFluor 670を使用する。我々はまた、細胞を可視化するための追加の方法などの蛍光タンパク質のためのウイルスベクターのエンコーディングで形質導入を使用していました。特定のアッセイのために、私たちはエメラルドグリーン（EMD）蛍光タンパク質10,11をコードするレトロウイルスの複製ベクター（RRV）でalloCTLを形質導入した。 OTH用ERSは、腫瘍細胞をmStrawberryをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。
alloCTLは、腫瘍細胞単層から回収した腫瘍細胞の単層またはECMのいずれかの中心にマニホールドのチャネルを介して播種した。接着性および非接着細胞の相互作用は、光によって、および/または経時的な蛍光顕微鏡によって可視化した。ハイパワーで断片化した核を有する低電力での腫瘍細胞の単層、または腫瘍細胞の混乱は、それぞれ、溶解およびアポトーシスによる細胞傷害の指標であった。我々は、デジタル的に、単層培養上の非付着性蛍光T細胞の遊走を示す表面強度の蛍光マップを作成した。我々はまた、細胞傷害性がオーバーレイ非接着alloCTLのクラスターを形成した後に接着性神経膠腫細胞の単層に生ん留意。同様に、神経膠腫の単分子層へalloCTLからRRV-EMDの水平伝達が観察された。
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Protocol
1.スライドさせて準備
- 滅菌パウチに細胞沈降マニホールドのスライドを挿入し、オートクレーブテープで密封する。井戸のプラスチック製の堆積物を回避するために、ポーチのスライド紙側のテフロンコーティングされた側に直面しています。
- 121℃で15分間オートクレーブパウチ。
- 無菌の150×15ミリメートルの滅菌ペトリ皿にバイオセーフティキャビネット及び場所内部の滅菌袋からスライドを削除します。 4スライドまで一品ごとに収めることができます。スライドの隣に35×10ミリメートルペトリ皿を置きます。加湿を提供するために、滅菌H 2 O 2〜3mlのを追加します。
- ポリ-D-リジンプレコートスライドを、100μg/ mlのウェル全体をカバーするために十分な容量を使用することによって。 RTで1時間後、この溶液を吸引し、ウェルの表面上に1×PBSをピペットでよく二回の表面をすすぐ。
- 必要に応じて、より強力な腫瘍細胞の接着を確実にするために、フィブロネクチンまたは他のECM成分を追加する。十分なボリュームTHA中5μg/ mlのフィブロネクチンを追加ウェルを、室温で短時間に乾燥させないであろうトン。
- 1時間後、残りのソリューションを吸引し、ピペッティング1X PBSで二回洗浄します。
- 腫瘍はめっきの準備ができるまでウェル上にPBSにしてください。使用して、同じ日にスライドします。
- 所望の接着性の腫瘍細胞型のコンフルエントなフラスコを収穫する。 10％ウシ胎児血清（FBS）と適切に緩衝成長培地たとえば5×10 6細胞/ mlで、ダルベッコ最小必須培地（DMEM）で光学顕微鏡を再懸濁することによってトリパンブルー色素排除を使用して生存細胞を計数、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム。
- 付着性細胞集団の蛍光イメージングが所望される場合、重要な蛍光色素または製造業者によって提供されるプロトコルに従って、細胞増殖色素で接着細胞集団を標識する。
- スムーズにWEL内の気泡を作成しないように注意しながらスライドの各ウェルに完全培地を10μlピペットlsは、このような均一な腫瘍細胞の付着を防ぐことができる。
- 各ウェル（ 図1A）内の培地に2.5〜5.0×10 4細胞（細胞懸濁液5~10μl）を加える。腫瘍細胞のタイプおよび所望の成長の日数に応じて最適な数を調整する。より大きな腫瘍細胞または急速に成長している細胞は、最初は少ない細胞を必要とするかもしれない。細胞の均一な分布を確実にするために、上下の媒質とピペットを追加することによって、40μlの、最大ウェル容量を持参。
- 全てのウェルを播種された後、腫瘍細胞は、室温で付着させ、次いで、150×15mmのペトリ皿に蓋を配置し、慎重に37℃で少なくとも24時間/ 5％CO 2の加湿インキュベーターに皿を動かす。
- 毎日の培養液を変更します。慎重に単層から使用済み培地の一部をピペットで、新鮮な完全培地と交換してください。
注：蒸発するので、より多くのボリュームを取り出したよりも追加する必要があります。ウェルズは、アッセイのために準備ができても、confl細胞のuent層が存在する。これは1〜3日最初の播種後に、通常である。 - ステップ1.4で説明した単層が望まれる場合、手順2に進み、または単層からECMタンパク質を抽出するために、以下の1.13ステップのいずれかとして、PBSで軽く一回単層を洗浄します。
- 完全培地中0.5％のTriton-X（v / v）の溶液を作製し、各ウェルに30μlを添加する。単分子層は、上述したように、ピペッティングにより完全培地で2回洗い、次いで、2分間フードダイジェストう。
NOTE：ECM層は光学顕微鏡（ 図2）で見ることができる。すぐにスライドを使用するか、または1〜2日間の加湿CO 2インキュベーター内で完全培地中で維持する。井戸を乾燥させないでください。
スライド上に非接着T細胞の2沈降
- 非付着性細胞集団の蛍光イメージングが望まれる場合、そのようなCFSE、セルトラッカーレッドCMPTX、またはeFluorとして、重要な蛍光色素との非接着細胞集団を標識アッセイの前に、製造業者は、少なくとも1時間により提供されるプロトコルに従って、670。あるいは、ウイルスベクターによってコードされる蛍光タンパク質を発現するように細胞を操作する。
- 上記1.2に記載されるようにオートクレーブポーチに細胞沈殿マニホールドオートクレーブ。
- 生物学的安全キャビネット内のインキュベーターと場所からテフロンコーティングしたスライドを含む加湿チャンバーを削除します。
- 上下にピペッティングすることによって1×PBSでウェルを洗浄し、その後、少なくとも10％血清を含む完全培地45μlを添加する。
- 滅菌エンベロープからマニホールドを取り外し、慎重にスライドします（ 図1B）の底部に接触しマニホールドの最後に「フック」まで、井戸の上でスライドさせます。
- 培養培地は、チャネルのそれぞれに表示されていることを確認してください。何も見られない場合は、マニホールドを脱いでも対応する、より多くの媒体を追加し、その後交換して、再度確認してください。
- 各ちゃんを繰り返しステップ2.5チャンネルマニホールドの、または多数のウェルに所望される。
- 1.0-2.0×10 5 /μLを下回らない非接着細胞を再懸濁を数える。細胞の1μLを策定し、ゆっくりチャネル（ 図1C）にそれらをピペット。よく目的のそれぞれについて、これを行います。
- チャンネル内の細胞が落ち着くことができるように20〜30分間のバイオフードの内側、 すなわち 、マニホールドやスライド、セル全体ロードされた装置のままにしておきます。
- 細胞を乱さないように、局所的に井戸の中央に播種し、両端に触れ、ゆっくりとまっすぐスライドから、それを持ち上げてマニホールドを取り外します（ 図1D）。
- 非接着細胞が正常にうまくマニホールドチャンネルの円周内に留まるの中心で播種されたことを確認するために、各ウェルを点検。非接着細胞は、理想的にはわずか従って穏やかに細胞ペレを引き起こさないの周りにスライド移動する、単層またはECMに、互いに付着する分散させるトン。スライドをモーターボーないでください。
3.蛍光顕微鏡
- 沈降が確認された後に適切な実験装置では、撮像を行う。理想的には、CO 2、湿度室が装備されている顕微鏡を使用しています。低電力、 すなわち 、4X、または10Xの画像、ウェルの全体を見ることができるように、複数の画像より広い領域を撮影することを可能にする。
- 画像キャプチャソフトウェアを使用してデジタル画像を取得する。明視野および/またはマルチチャネル蛍光画像化を行う。
- 必要に応じて、一定の面積以上の異なるチャンネルに画像を記録する、または、加湿、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内でスライドを維持し、手動で（ 図所望の時点で、イメージに取り出すことタイムラプスを設定長い時間点に推奨1E＆F、）。
4.分析と表示
- 画像編集ソフトウェアを使用して、光をマージとfl1層への蛍光増像ので、複数の細胞型およびマーカーは、同じ画像で見ることができます。ドラッグアンドプログラムに個々の色の画像ファイルをドロップして、プロンプトが表示されたときに、複数のレイヤーを持つ画像ファイルを作成するには、「レイヤーの追加」オプションを選択します。
- より高い倍率では、取る合わせ、デジタルでよく一緒に渡って画像をステッチ。二つの画像の保存領域を見て、完全な画像が生成されるまで、他の上に一つの画像を重ね合わせることによって、ファイルの位置を合わせます。
- 個々の細胞が移動した距離を決定するためにキャプチャソフトウェアを使用して取得時に画像へのミクロンバーを追加します。
- 、様々な時点で細胞遊走を決定する蛍光T細胞凝集または経時的に広がるを定量化するために、 すなわち、イメージソフトウェア、ImageJを用いて表面強度の蛍光マップを作る。
- 表面プロットを生成するには、ステップ4.1でとレイヤーウィンドウの下に生成された層状の画像を取ること、所望のチャンネルに対応したものを除くすべてのレイヤーをオフにします。サーフェスプロットは、EMDの発現を可視化することが望まれる場合、インスタンスの場合は、このマーカーに使用するフィルタに対応する唯一の「グリーン」の層が見えるはずです。
- 画像を平らにし、識別されたファイル形式で保存（ 例えば 、.pngの）とプログラムにイメージをロードします。表面プロットを生成するには、8ビットに画像の種類を変更するバックグラウンドを低減するために、必要に応じて明るさ/コントラストを変更し、「/表面プロットを分析する」オプションを選択します。 図5の画像は、「日陰」、「軸を描く」、「Oneポリゴン毎のライン」、および「滑らか」のチェックボックスをチェックすることによって作製した。
- また、時間ゼロで焦点セル預金からの半径または直径を使用して測定を行うと、異なる時間に、最も外側の点で細胞に比較します。テフロンウェルの直径は6.0 mmである。
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Representative Results
蛍光タンパク質をコードするウイルスベクターに加えて使用することができ、または代わりに、蛍光染料。ウイルス形質導入は、運動性アッセイの前に行われるべきである。接着性および非接着性細胞型の両方の差動標識することができる。形質導入のためのプロトコルが使用されるベクターのタイプに依存する。ここでは、12に記載のプロトコルを用いたアッセイに先立って、図 RRV-EMDと3,5と6、少なくとも2日間でalloCTLを形質導入した。また、mStrawberry赤色蛍光タンパク質（ 図4）を発現する腫瘍細胞を形質導入するために、レンチウイルスベクター、CMV-ストロベリー-IRES-FLUC2を使用する。この伝達は、新鮮な培地を添加した時点で48時間、細胞をフラスコにベクターを加えることによって達成された。細胞を2日間回復させた後、限界希釈100％形質導入された細胞の集団を生成するために実施した。
（図3、図5）。蛍光顕微鏡細胞を示し、最初は時間をかけて中心から離れて移動する、ウェルの中央で播種。 alloCTLの形成は4時間後に凝集する（ 図3、白矢印）はおそらく反射13活性化、IL-2産生T細胞集団によって示される自己分泌成長パターンである。
別の実験では、マウスのエフェクターalloCTLは、B6C3F1マウスからTU-2449神経膠腫が同系された歪みをハプロタイプH-2DのBALB / cレスポンダ脾細胞およびハプロタイプH-2B / K刺激脾細胞を用いて、一方向MLRによって作られた。直ちにトンのチャネルを介して播種前彼は、腫瘍細胞単層上にマニホルド、alloCTLがeFluor 670 alloCTL（紫色の細胞）で染色し、100％は、CMV-Straw-で形質導入されたTU-2449グリオーマ細胞（赤色）の確立された単層の中央に播種しIRES-FLUC2ウイルスベクター、ウェルに、アッセイの前日に播種した。 図4AおよびBは、顕微鏡画像は、1および48時間後に同一ウェルの同じ象限の撮影を示している。 図4CおよびDは、デジタル化された紫色の蛍光を変換するためにImageJを使用して生成された三次元形式で表示され、定量的表面プロットに強度。
最終的に、人間のalloCTLはMLTRにより転移性乳癌細胞株MDA-MB-231BRに由来し、不活性化刺激ヒト脳指向性細胞を用いて行った。 図6部分的に、非接着CMPTX標識alloCTLの経時的な光及び蛍光顕微鏡画像を示すF抽出されたECMタンパク質に移行し、RRV-EMDで形質導入これらの腫瘍細胞をセットします。 （A）は明視野顕微鏡写真はすぐに沈降した後alloCTLの焦点位置を示しています。 （BおよびF）で明視野顕微鏡写真は、4と8時間後に、それぞれ、alloCTLが放射状にECMに移行し、表示されます。 alloCTL密度は、ウェルの中心（ウェルの中心がBIフィールドの左上隅である）からの距離に伴って減少する。パネル（CおよびG）ショー CMTPXで染色全体alloCTL製剤;（DおよびH）小EMD + T細胞の数、及び（EとI）で示されるようにRRV-EMDとalloCTLの部分的な形質導入を示しRRV-EMDのマージされた画像はalloCTL形質導入を示し非形質導入alloCTLと共にECMに移行する。
図2.腫瘍細胞単層およびECMはCSMスライドウェル上にプレーティングした 。スライドウェルの顕微鏡写真は準備クマシーブルー染料で染色したコンフルエントU-87MGから抽出された（A）コンフルエントU-87MG神経膠腫細胞の単層、または（B）ECMタンパク質と。バー=200μmである。 この図の拡大版については、ここをクリックしてください。
図3.移行と中央にRRV-EMD形質導入リンパ球の細胞毒性と時間をかけて細胞堆積物の前縁 。リーディングエッジで、付着U-87MG神経膠腫細胞の単層上に沈降以下alloCTL-RRV-EMDの中心に様々な時間に採取蛍光顕微鏡写真。エフェクターalloCTLは、配置の4時間以内に球状のクラスター（白矢印）を形成する、単一細胞として播種した。シングル蛍光標識されたCTLは、ウェルの中心から移行したsの時間が進行する。 24時間後、接着単層の空のセルパッチはおそらく腫瘍標的細胞のalloCTL細胞溶解（ダッシュ内の領域を参照のこと）に起因する表示されます。バー=200μmである。 この図の拡大版については、ここをクリックしてください。
1と48時間後に示さmStrawberry標識神経膠腫細胞でeFluor 670で染色したマウスalloCTLの図4.ラジアル移行。（A）1時間と、（B）、蛍光体の沈降後48時間で同じウェルの1象限の蛍光顕微鏡写真TU-2449神経膠腫細胞の単層上に非接着alloCTL - 標識。低消費電力の顕微鏡写真は、1 CSMの象限ウェル（半径3ミリメートル）内に含まれる領域を反映しています。ハイパワー（AとB、インセット）、アロでCTL（白矢印）に近接して図示または個々の腫瘍細胞と関連している。一方は断片化した核を持つ崩壊外観を有し、アポトーシスである。（CおよびD）は 、それぞれの表面強度の蛍光マップは、三次元グラフィック形式でデジタル化された紫色の蛍光画像の画素値を示すImageJソフトウェアを使用して得られたウェルの半径を表すグリッド上に配置され3mmの。バー=500μmの。 この図の拡大版については、ここをクリックしてください。
図5 alloCTLの移行および腫瘍細胞への形質導入alloCTLからRRV-EMDの水平方向の広がり。直列によく使用して、画像編集ソフトウェアの半径をカバーするために縫い合わせ蛍光顕微鏡写真。 RRV-EMDの移行が形質導入alloCTL（白い矢印）が沈降次0及び72時間でU-87MG腫瘍細胞の単層上に示されている。単層中の腫瘍細胞のRRV-EMD伝達は、リンパ球の腫瘍細胞への感染性RRVの水平伝播する（ホワイトボックス、および挿入）が発生したことを示す、EMD形質導入alloCTLの添加後72時間目にも明らかである。バー=200μmである。 この図の拡大版については、ここをクリックしてください。
alloCTLの図6.ラジアル移行はRRV-EMDで形質導入し、CellTrackerレッドCMTPXで染色した 。細胞は、MDA-MB-231BR細胞由来のECM抽出物上に沈降させた。 alloCTLの移動は、0,4、および8時間後に明視野光学顕微鏡で画像化した（A、B、それぞれF列 1）。 FluoreCMPTX（赤）の香りのイメージをalloCTL（C、G、列2）標識、RRV-EMD（緑）alloCTL（D、H、列3）、およびマージされた画像（E、I、列4）を形質導入され4および8時間で示す。バー=200μmの。バーのイメージCIに適用Bに示す。 この図の拡大版については、ここをクリックしてください。
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Discussion
単一細胞懸濁液中の腫瘍細胞を、テフロン（登録商標）マスクされたスライドのウェルにピペットで入れた。細胞が付着させ、次いで加湿した5％CO 2、37℃インキュベーター（ 図1A）で単層を形成した。単層から派生設立単層またはECMタンパク質は、これらのアッセイ（ 図1B）のために収穫することができた。 EMDをコードするベクターを用いて重要な蛍光色素で標識されたまたは形質導入されたエフェクターTリンパ球は、十分にCSMを使用しての中央に播種した。経時的な単層又はECMタンパク質に移行するための非接着性エフェクターTリンパ球の能力を評価し、光及び蛍光顕微鏡を用いて定量した。ここでは、部分的に関連する標的U-87MG神経膠腫細胞の単層上に非接着性エフェクターalloCTLの遊走及び細胞毒性を評価した（ 図3および図5）。これらの標的細胞のみヒト白血球抗原の一部を表示するオリジナルの刺激物質に見出さ（HLA）分子（HLA-A2、B44）は、関連する13から06-MG標的細胞（HLA-A1,2及びB44にalloCTLによって表示される強力な細胞溶解活性を低下させるために使用された、57）。また、MDA-MB-231BR乳癌細胞の単層（ 図6）から採取したECMにalloCTLの移動を観察した。 alloCTLは、以前に公開された方法9に従って一方向MLTRによって生成された。エフェクターalloCTLは4-5日一方向MLTR後に収穫し、RRV-GS4-EMD（ 図3、図5）またはRRV-ACE-EMD（ 図6）10,11で形質導入した。より高い形質導入レベルはGS4ベクターが両種ACEベクターよりもテナガザル白血病ウイルスエンベロープを用いて達成された。この放射状の遊走アッセイを使用して、我々は両方の形質導入および形質導入し、蛍光標識されたalloCTLが移動能力を持っていたことを指摘した。我々はまた、のcytされる能力を保持することを実証するRRV形質導入のための操作を受けた後otoxic。
移行するネズミalloCTLの能力も（ 図4）を評価した。 alloCTL TU-2449細胞により表示ハプロタイプH-2bの/ kに感作する（紫色）eFluor 670で染色し、遊走アッセイは、CMV-ストロー-IRES-FLUC2（赤）で形質導入したTU-2449を用いて行った。完全に関連するターゲットを使用する場合、alloCTLエフェクター細胞のより少ない数は、腫瘍細胞標的の迅速な溶解を防止するために播種した。ベースラインとして1時間を使用して、T細胞は、主に単一細胞懸濁液として、ウェルの中心部に高密度に局在している。 48時間の顕微鏡写真は、それらの初期の堆積物の部位での腫瘍細胞の破壊と容易に明らかであるウェルとalloCTLのクラスタリングの外縁に向かってT細胞の大規模な移動を示している。 TU-2449細胞の増殖は、標識された細胞は、優に超える密度の増加mStrawberryとして証明される。これは、より良好な表面に見られるウェル中の紫色の細胞（ 図4、下パネル）の分布を可視化するために生成された蛍光のプロット。 AlloCTL移動度ははるか明らかに1時間のベースラインと比較して48時間でよくである。人間alloCTLおよび神経膠腫細胞を利用するアッセイで見られたものと同様に、エフェクターの頭金の領域の周囲の腫瘍細胞のクリアランスは、腫瘍標的細胞の溶解を示唆し、48時間で顕著である。
このアッセイにおける重要なステップは健康な単層と「骨格」ECMのその後の収穫の成長である。 2.5での腫瘍細胞の播種-ウェル当たり5.0×10 4個の細胞を、上記1.9のステップに従って、通常、我々は、使用される腫瘍細胞型に対してほぼさえ単層をもたらした。我々は、そうでなければ37℃で発生する対流がウェルの中心に向かって細胞に押され、腫瘍細胞は、室温で付着することを可能にすることが重要で見つかった。同様に、井戸wiのプリコート第ポリ-D-リジンおよび/または非常に成功率を高めることができ、フィブロネクチンまたはコラーゲンなどのECMタンパク質。さらに、当社は、個々のECM成分（ すなわち 、フィブロネクチン、コラーゲン）、はるかに少ない信頼性が証明さよりも単層由来の「骨格」ECMを使用してこれらのアッセイとのより良い成功を収めた。それだけでなく、沈降マニホールドを通して堆積させるために、非接着細胞の数を試してみることが重要であり、純粋な細胞型を使用する場合、人は理論的には、このアッセイで運動性係数を定義することができる。ウェル容量が小さく、媒体のいくつかの蒸発が発生するため、単層を新鮮な培地を毎日補充する必要がある。細胞が成長および分裂などのメディア交換も有毒な乳酸の蓄積を防ぐことができます。健全な単層を開拓しないと、ウェル表面から単層またはECMの脱落につながることができます。
U-87MG神経膠腫細胞のLiに由来し、クマシーブルー染色したECMタンパク質ね上記のトリトンX-100（ 図1B）での消化後に残さ接着性基材層の視覚的な例として示されている1.13のステップに記載の方法。乳癌細胞株MDA-MB-231BR細胞からのECM産生は、多くの場合、不十分な接着性、時にはアッセイ中にスライドから解除されたECM層をもたらし、斑状と薄い。腫瘍細胞は、消化前に1~2日間コンフルエントな単層として維持したときのスライドにECMタンパク質の付着を向上させる。プロセス全体を通じて、よく周囲のテフロンシールのメンテナンスも重要でした。低容量を維持し、テフロンシールの完全性へのダメージを軽減するトリトンX100溶液へのテフロンの暴露を最小限に抑えることができる。
このプロトコルの一つの適応は、10月埋め込 み腫瘍組織14のセクションから収穫3次元細胞外マトリックスの使用可能性があります。しかし、留意すべきフラットボットからの距離スライド表面によくomedのみ1ミリメートルである。このように、この厚さを超えたのセクションでは、マニホールドの配置によって破壊されてもよい。また、この方法は、非接着細胞を含む培地の液滴を受け入れる組織のわずか穿頭孔を作るために工夫する必要がある。
沈降に先立ってエフェクターTリンパ球の十分に分散単一細胞懸濁液の調製にも不可欠であった。単一細胞懸濁液に凝集体を分散させるための非接着性T細胞を穏やかにトリチュレート右CSMのチャネルにalloCTLをロードする前に、必須の工程であった。必要に応じて、非酵素的細胞解離緩衝液の使用は、使用されるべきである。上記のステップ2.8で説明したように、沈降のために2.0×10 5細胞/μL -さらに、エフェクターリンパ球の密度は約1.0であるべきである。高い細胞数が移動するときに破壊することが容易であり、大きな堆積物を生じさせることができるが、低細胞数は、全く沈殿を生じ得るスライド。また、培地中の血清濃度は、スピルオーバーの可能性を減少させる正のメニスカスの適切な表面張力を提供するために、少なくとも10％であることが推奨される。
蛍光イメージング機能と4倍または10倍の目標に倒立光学顕微鏡は、このアッセイに最適です。イメージングのための時点は、個々の実験の問い合わせおよび細胞型に応じて決定することができる。特に非接着CTLは細胞単層（12-72時間）にわたってよりECMタンパク質（4-8時間）に、より迅速にウェルの縁に向かって沈降の中心から移動する。部分的にMHC関連する標的細胞が重要な移行が発生する前に運動性の可視化を奨励し、単層の細胞媒介性細胞溶解を減らすために私たちのalloCTLアッセイのために、関連のターゲットに好適であった;比率を標的とする低エフェクターの使用はまた、溶解を遅らせる。部分的に一致したターゲットの使用はRRVのより良い可視化を可能にする同様に、腫瘍細胞への送信。
倒立顕微鏡を使用すると、直立範囲にわたって複数の利点をもたらす。スライドはまた、細胞のための無菌環境を維持しながら、邪魔されていないように反転した範囲が、加湿チャンバを通るイメージングを可能にします。また、チャンバを通るイメージングは、ヒト由来の組織15で作業するときバイオセーフティーレベルII（BSL II）のガイドラインの遵守を可能にし、試料と技術者との間の障壁を提供しています。
直立スコープを使用している場合は、ウェルの正メニスカスを乱すことなく、達成可能な最高倍率は20倍である。メニスカスの混乱は、一般的によく全体で沈降した非接着細胞の広がり、その結果として残念ながら、カバースリップ、または細胞沈殿マニホールドに光学キットの付属品の使用は、推奨されません。長期間にわたってイメージングは、MEDを注意深く添加を必要とするかもしれないこれはタイムラプスイメージング中に必要とされる可能性が高いが、それを置き換えるために、各ウェルにイウムは、蒸発で失わ。
このプロトコルはZigmondチャンバー16,17に接着細胞の水平細胞移動を測定する方法とは区別される、の設計は、非接着性細胞移動の可視化を可能にしない。寒天などの基板を介して走化性勾配に向かって水平移動を評価する他のアッセイは、一般に、1つの細胞型18-20の遊走を研究するために使用される。 CSMの使用は、いくつかのこれらのメソッドへの利点だけでなく、そのようなボイデンチャンバーまたはマトリゲルトランスウェルプレートのように培養した細胞の鉛直移動/浸潤を測定する方法を提供する。まず、細胞 - 細胞接触は、エフェクター細胞による標的エフェクター細胞相互作用および損傷の決定を可能にする。最初はパルティに刺激装置13から06-MG腫瘍細胞を一方向MLTRによって刺激alloCTL-RRV-EMDの細胞溶解能力味方MHCマッチしたU-87MG細胞株は、沈殿後24及び72時間で単層の中央には明らかである（ 図3および図5、破線）。同様に、マウスalloCTLによるTU-2449細胞の劣化は、48時間後に沈降（ 図4）で表示されます。単層をalloCTL鉱床の中心に抹消するが、単層の残りの部分の上に、よりゆっくりと発生し、ヒト細胞21または低でアッセイにおいて13から06-MGとU-87MGのHLA発現における重複のいずれかに起因しているマウス神経膠腫のためのエフェクター細胞の数を開始。また、密度を標的とするエフェクターはalloCTL沈降部位から離れて遊走エフェクターとして低減される。遊走および細胞溶解に加えて、このプロトコルは、ウイルスをコードする蛍光タンパク質の移動を視覚化するために使用することができる。ここでは、腫瘍細胞にalloCTLからEMDためRRV符号化の転送は72時間（ 図5の挿入図）の後に明らかである。
このモデルの制限は、マイグレーションのみインビボの移行の真に反映していない可能性がインビトロで評価することができることである。別の制限は、ケモカイン/ケモカイン受容勾配モデルを用いて確立することができないことである。 ECMまたは個々の腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用は依然として発生し、依存している細胞が分泌するものに、または、この運動性のお尻を表現するかもしれないがAY非接着細胞を特異的にまたは離れて孤立した要因から移行するかどうかを上の質問に答えるではないだろう。
このアッセイの利点は、リンパ球を有するか、または形質導入されていない場合、非接着細胞の集団は遊走機能を維持するかどうかを決定する能力である。この例では、形質導入された亜集団は、EMDのタンパク質の発現を介して可視であり、遊走機能は、この亜集団内に維持されることは明らかである。広いアプリケーションは、非接着性免疫細胞の遊走に影響を与える可能性のある薬剤または薬物の様々な濃度の効果を試験することであろう。また、他の造血細胞は、正常組織由来の様々な基材または接着細胞に移動性のためにテストされることがあります。最後に、腫瘍を有する、すなわち、ストローマ細胞または樹状細胞は、接着細胞タイプの組み合わせを播種し、ここで行われていないが、提供することができる生体内環境でより複雑な反射解析。
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Acknowledgments
NIH R01 CA121258、R01 CA125244、R01 CA154256、NIH / NCATS UCLA CTSIグラント番号UL1TR000124、USAMRMC W81XWH-08-1-0734、およびジョアンS.ホームズ記念研究基金によって部分的にサポートされている。 MJHとGCOはUCLAのジョアンS.ホームズ記念ポストドクトラルフェローシップからサポートされた。 www.creative-sci.com：CSM装置を創造科学的方法から得られた。レンチウイルスベクターは、CURE / P30のDK041301でサポートされているUCLAのベクトル·コア、から受信されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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