Abstract
Wir berichten über einen neuartigen Anpassung des Radialmonolayer-Zellmigrationsassay ersten gemeldet, um die radiale Migration von adhärenten Tumorzellen an extrazellulären Matrixproteinen zu messen, zur Messung der Beweglichkeit der fluoreszierend markierten, nicht-adhärente humane oder murine Effektor Immunzellen. Diese Technik verwendet ein nichtrostender Stahl und vielfältigen 10-Well-Teflon-Folie, um fokal einzahlen nicht haftende T-Zellen in die Vertiefungen entweder konfluent Tumorzellmonoschichten oder extrazellulären Matrixproteinen vorbereitet. Licht und / oder Mehrkanal-Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird, um die Bewegung und das Verhalten der Effektorzellen über die Zeit verfolgen. Fluoreszenzfarbstoffe und / oder virale Vektoren, die Code für fluoreszierende Transgenen verwendet werden, um differentiell zu markieren, die Zelltypen für die Bildgebung. Diese Methode unterscheidet sich von ähnlichen Typs in-vitro-Tests, die horizontale oder vertikale Migration / Invasion Verwendung Schiebekammern, Agar oder Transwell-Platten zu verfolgen. Der Test ermöglicht die detaillierte Bilddaten zu be mit verschiedenen Zelltypen mit spezifischen Fluoreszenzmarkern unterschieden gesammelt; sogar spezifische Subpopulationen von Zellen (dh transduziert / transduzierten) überwacht werden kann. Oberflächen Intensität Fluoreszenz Grundstücke werden mit speziellen Fluoreszenzkanälen, die zu migrierenden Zelltyp entsprechen generiert. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung der nichthaftImmunZellMobilität zu bestimmten Zeiten. Es ist auch möglich, Belege für andere Effektorzelle Funktionen wie Zytotoxizität oder der Übertragung von viralen Vektoren, die von Effektorzellen zu Zielzellen zu sammeln, als auch. Somit ermöglicht das Verfahren die Forscher mikroskopisch dokumentieren Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen von differentiell markierten, nicht-haftend mit adhärenten Zellen verschiedener Typen. Solche Informationen können besonders relevant bei der Beurteilung von biologisch manipuliert oder aktivierten Immunzelltypen, wo visuelle Nachweis der Funktionsfähigkeit mit Tumorzielzellen vor ihrer Verwendung zur Krebstherapie erwünscht.
Introduction
Der Radial Monolayer-Zellmigrationsassay wurde ursprünglich entwickelt, um die Infiltrationseigenschaften von adhärenten Tumorzellen 1-4 auf Objektträger mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine 5-7 oder mit einzelnen ECM-Komponenten, wie Fibronectin oder Laminin 1,2 beschichtet messen. Die Technik involviert Animpfen einer Einzelzellsuspension von Tumorzellen in der Mitte der Vertiefungen unter Verwendung eines Edelstahl Zellsedimentation Verteiler (CSM). Nach Sedimentation würden die Tumorzellen an der Unterseite der Wanne und der Änderung des Durchmessers des anfänglichen Zellpopulation im Laufe der Zeit festhalten wurde verwendet, um eine Rate der horizontalen Beweglichkeit herzustellen. Die Radial Monolayer Zellmigration Test vorgesehen eine visuelle Vorteil gegenüber anderen existierenden Methoden, die Transwell-Platten, die in-vitro-Migrationsfunktionen von Zellen zu untersuchen beschäftigt; diese Tests sind nicht förderlich für die Bildgebung 8. Wie gut, sondern auch bei der Auswahl der vorgesehenen Zeitpunkt eine große Menge an Freiheits, wenn die Migration untersucht, ohne Begrenzung auf die Anzahl der Zeitpunkte ein Forscher könnte nach der Sedimentation zu Bild auszuwählen.
Weil die Migrationsfähigkeit ist eine wichtige Funktion für die nicht-anhaftenden Zellen, insbesondere auf dem Gebiet der Immuntherapie oder wo sie als Abgabevehikel für virale Vektoren verwendet werden, geeignet ist der Einsatz der CSM, die Migration von nicht-adhärenten Zellen zu bewerten Typen auf Tumorzellschichten, zusätzlich zu den ECM-Proteine. Der zusätzliche Vorteil der mikroskopisch Visualisierung der Migration von nicht-adhärenten Zellen zu lebensfähigen Tumorzellschichten, auf komplexen ECM aus dem Tumor oder an einzelnen ECM Komponenten isoliert macht dieses Assay vielseitig. Assays, die Vertiefungen, die mit einem einzigen extrazellulären Protein beschichtet beschäftigen nicht genau weiß das ECM-Gewebesubstrat oder Tumor die Zellen würden durch in vivo zu migrieren.
Hier haben wir alloreaktiven zytotoxische T-Lymphozyten (alloCTL), zu den wichtigsten histocomp sensibilisiertatibility Komplex (MHC) -Proteinen mit Einweg gemischten Lymphozytentumorzellreaktionen (MLTR) oder gemischten Lymphozytenreaktionen (MLR) 9, wie unsere repräsentative nicht-adhärenten Zelltyp. Wir testeten Zellen der menschlichen und murinen Ursprungs. Bei der Migration wurde auf Tumormonoschichten gemessen, waren die Tumorzellen eingesetzt entweder teilweise relevanten Ziele und zeigt einige der gleichen MHC-Proteinen auf der Zellpopulation verwendet, um die Effektoren oder vollständig relevanten Ziele, mit einem kompletten Satz von MHC-Molekülen zu sensibilisieren gestellt, dass die Effektoren hatte gegen sensibilisiert. In einigen Experimenten wurden fluoreszierende Celltracker Red CMPTX oder Zellproliferation Farbstoff eFluor 670 zwischen Effektor- und Zielzellen zu unterscheiden. Wir haben auch die Transduktion mit viralen Vektoren Codierung für fluoreszierende Proteine als weitere Möglichkeit, um die Zellen zu visualisieren. Für bestimmte Tests, transduziert wir die alloCTL mit retroviralen Vektoren zu replizieren (RRV) für Emerald Green (EMD) fluoreszierendes Protein kodierende 10,11; für othten, wurden Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren für mStrawberry Codierungs transduziert.
Die alloCTL wurden durch einen Kanal des Verteilers in die Mitte der beiden Tumorzellschichten oder ECM aus Tumorzellmonolayer geerntet ausgesät. Adhärenten und nicht-adhärenten Zell Wechselwirkungen wurden durch Licht und / oder durch Fluoreszenzmikroskopie im Laufe der Zeit sichtbar. Störung in der Tumorzellschicht mit geringer Leistung oder Tumorzellen mit fragmentierten Kernen mit hoher Leistung waren Indikatoren der Zellschädigung durch Lyse und Apoptose auf. Wir digital erstellt Oberfläche Intensität fluoreszierender Karten, auf denen die Migration von nicht-haftenden fluoreszierenden T-Zellen in den Monolayer-Kulturen. Wir haben auch darauf hingewiesen, die Zytotoxizität erzeugt, um die adhärenten Gliom-Zellmonolayer nach Clusterbildung der überlagerten nicht haft alloCTL. Wie gut, horizontal Transduktion RRV-EMD von der alloCTL auf die Gliom Monolage beobachtet.
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Protocol
1. Schieben Vorbereitung
- Legen Zellsedimentation Manifold gleitet in Sterilisationsbeutel und Dichtung mit Autoklav-Band. Vor der Teflon-beschichteten Seite des Schiebers die Papierseite des Beutels an Kunststoff Ablagerungen auf den Vertiefungen zu vermeiden.
- Autoklav Beutel für 15 min bei 121 ° C.
- Objektträger aus Sterilisationsbeutel in einer Biosicherheitswerkbank und in eine sterile 150 x 15 mm sterilen Petrischale. Bis zu vier Dias pro Gericht passen. Legen Sie eine 35 x 10 mm Petrischale neben den Folien. Fügen Sie 2-3 ml sterilem H 2 O, um Befeuchtung zu schaffen.
- Precoat-mit Poly-D-Lysin an 100 ug / ml unter Verwendung von genügend Volumen, um gut decken die gesamte. Nach einer Stunde bei RT absaugen und spülen Sie die Oberfläche der Wanne zweimal durch Pipettieren 1x PBS über die Oberfläche der Vertiefungen.
- Fügen Sie optional Fibronektin oder andere ECM-Komponenten zu einer stärkeren Tumorzellhaftung zu gewährleisten. Hinzufügen Fibronektin bei 5 ug / ml in genügend Volumen That den Vertiefungen wird nicht trocken in einem kurzen Zeitraum bei Raumtemperatur.
- Nach 1 Stunde, saugt den Restlösung und waschen zweimal durch Auf- und Abpipettieren mit 1x PBS.
- Halten PBS auf den Brunnen, bis Tumor ist bereit für die Beschichtung. Verwendung gleitet am selben Tag.
- Ernte einen konfluenten Flasche des gewünschten adhärenten Tumorzelltyp. Zählen lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau-Farbstoffausschluss durch Lichtmikroskopie und Resuspension in 5 x 10 6 Zellen / ml in ausreichend gepuffert Wachstumsmedium, beispielsweise Dulbeccos minimal essential medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), L- Glutamin und Natriumpyruvat.
- Wenn Fluoreszenzabbildung der adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die adhärente Zellpopulation mit einem Vitalfluoreszenzfarbstoff oder ein Zellproliferations Farbstoff nach den Protokollen des Herstellers.
- Sanft Pipette 10 ul Vollmedium in jede Vertiefung des Objektträgers kümmert, damit Sie keine Blasen in der wells, da diese einheitliche Tumorzellhaftung zu verhindern.
- Hinzufügen 2,5-5,0 x 10 4 Zellen (5-10 ul Zellsuspension) zu dem Medium in jeder Vertiefung (1A). Stellen Sie die optimale Anzahl in Abhängigkeit von Tumorzelltyp und der Anzahl von Tagen Wachstum erwünscht. Größere Tumorzellen oder schnell wachsende Zellen weniger Zellen erfordern zunächst. Bringen Sie auch Volumen von bis zu 40 & mgr; l durch Zugabe von Medium und Pipette auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
- Nachdem alle Vertiefungen ausgesät, damit die Tumorzellen bei RT auf dem 150 x 15 mm Petrischale haften, dann setzen Sie den Deckel vorsichtig bewegen Sie den Spiegel auf eine 37 ° C / 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für mindestens 24 Stunden.
- Ändern Sie das Kulturmedium täglich. Einen Teil des verbrauchten Mediums aus der Monolage vorsichtig pipettieren und ersetzen mit frischem Vollmedium.
Hinweis: Wegen der Verdampfung, mehr Volumen benötigen als entnommen wurde hinzugefügt. Wells ist bereit für Test, wenn eine gleichmäßige, confließend Schicht von Zellen vorhanden ist. Dieser ist in der Regel 1-3 Tage nach der ersten Aussaat. - Sanft einmal waschen Monolayer mit PBS, wie in Schritt 1.4 beschrieben und entweder zu Schritt 2, wenn Monoschichten erwünscht sind, oder mit Schritt 1.13 ECM-Proteine aus der Monoschicht zu extrahieren.
- Einen 0,5% Triton-X (v / v) Lösung in komplettem Medium und füge 30 ul in jede Vertiefung. Lassen Mono verdauen Kapuze für 2 Minuten, dann waschen zweimal mit komplettem Medium mit einer Pipette wie oben beschrieben.
HINWEIS: Die ECM-Schicht kann durch Lichtmikroskopie (Figur 2) angezeigt werden. Verwenden Sie Folien sofort, oder halten Sie in vollständigem Medium in der befeuchteten CO 2 Inkubator für 1-2 Tage. Lassen Sie die Vertiefungen zu trocknen.
2. Sedimentation Nicht anhaftende T-Zellen auf Slide
- Wenn Fluoreszenzabbildung des nicht-adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die nicht-adhärenten Zellpopulationen mit einem Vital fluoreszierenden Farbstoff wie CFSE, Cell Tracker Red CMPTX oder eFluor670 durch Befolgen der Protokolle des Herstellers mindestens 1 Stunde vor dem Test zur Verfügung gestellt. Alternativ zu manipulieren Zellen fluoreszierende Proteine durch virale Vektoren kodiert wird.
- Autoklavieren den Zellsedimentation vielfältig in einem Autoklav Beutel wie oben in 1.2 beschrieben.
- Entfernen Sie den befeuchteten Kammer mit Teflon beschichtete Objektträger aus dem Inkubator und in biologischen Sicherheitsschrank.
- Waschen Vertiefungen mit 1x PBS durch Auf- und Abpipettieren, dann fügen Sie 45 ul Vollmedium mindestens 10% Serum mit.
- Entfernen des Verteilers aus der Sterilisationsumschlag bilden und vorsichtig in den Vertiefungen bis 'Haken' am Ende des Verteilers berührt den unteren Rand der Folie (1B).
- Sicherstellen, dass das Kulturmedium in jedem der Kanäle sichtbar ist. Wenn keine zu sehen ist, nehmen Sie die vielfältigen und noch mehr auf das entsprechende Medium gut, dann ersetzen und erneut prüfen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 für jede channel des Verteilers oder für so viele Vertiefungen nach Wunsch.
- Zählen nicht-adhärenten Zellen und Resuspension bei mindestens 1,0-2,0 x 10 5 / & mgr; l. Auszuarbeiten 1 ul Zellen und langsam pipettiert sie in den Kanal (Abbildung 1C). Tun Sie dies für jede Vertiefung gewünscht.
- Lassen Sie die gesamte Zelle geladenen Gerät, also vielfältig und Rutsche, in der Bio-Haube für 20-30 Minuten, damit sich die Zellen in den Kanal zu begleichen.
- Entfernen Sie die vielfältigen, indem Sie beide Enden und leichtes Anheben sie gerade nach oben von der Folie, um die Zellen fokal in der Mitte der Brunnen (1D) ausgesät nicht stören.
- Untersuchen jeder Vertiefung, um sicherzustellen, daß die nicht-adhärenten Zellen wurden erfolgreich in der Mitte des Bohrlochs innerhalb des Umfangs des Verteilerkanals bleiben ausgesät. Die nichthaftenden Zellen werden in idealer leicht auf der Monoschicht oder ECM und aneinander haften daher sanft bewegt den Schieber herum wird die Zelle nicht Pelle verursachent zu zerstreuen. Drängen Sie nicht die Folie.
3. Fluoreszenzmikroskopie
- Bei entsprechender experimentelle Ausstattung, führen Sie die Bild nach Sedimentation wird bestätigt. Idealerweise mit einem Mikroskop, das mit einem CO 2 und Luftfeuchtigkeit Kammer ausgestattet ist. Bild mit geringer Leistung, das heißt, 4X oder 10X, um mehrere Bilder zu ermöglichen, von einer größeren Fläche aufgenommen, so dass die Gesamtheit der gut eingesehen werden kann.
- Erwerben Sie digitale Bilder mit Aufnahmesoftware. Führen Hellfeld und / oder der Mehrkanal-Fluoreszenz-Imaging.
- Falls gewünscht, kann ein Zeitraffer-Bilder in verschiedenen Kanälen über einen bestimmten Bereich aufzunehmen, oder halten Sie den Schiebe befeuchtet und in einem 37 ° C / 5% CO 2 Inkubator und von Hand nehmen, um Bild zu den gewünschten Zeitpunkten (Bild gesetzt 1E & F, für längere Zeitpunkten empfohlen).
4. Analyse und Anzeige
- Mit Bildbearbeitungssoftware, verschmelzen Licht und fluorescent Bilder in eine Schicht, so dass mehrere Zelltypen und Marken können in der gleichen Bildes gesehen werden. Ziehen Sie die Bilddateien für jede einzelne Farbe in das Programm und, wenn Sie gefragt werden, wählen Sie die "Ebene hinzufügen" Option, um eine Image-Datei mit mehreren Ebenen erstellen.
- Bei höherer Vergrößerung nehmen, ausrichten und zusammenfügen von Bildern über das auch digital. Richten Sie Dateien, indem du konservierten Regionen zwischen zwei Bildern und Überlagerung eines Bildes auf dem anderen, bis ein vollständiges Bild erzeugt.
- Fügen Mikron Bars um Bilder bei der Aufnahme mit Hilfe der Capture-Software zur Entfernung einzelner Zellen gewandert sind zu bestimmen.
- Zur Bestimmung der Zellmigration zu verschiedenen Zeiten, stellen Oberfläche Intensität Fluoreszenz-Karten mit Software-Image, dh ImageJ, um fluoreszierende T-Zell-Aggregation oder über die Zeit verteilt zu quantifizieren.
- Um Oberflächendarstellung zu erzeugen, nehmen Sie ein Bild mit Ebenen in Schritt 4.1 und unter dem Fenster Ebenen erzeugt,Deaktivieren Sie alle Ebenen außer die, die entsprechend dem gewünschten Kanal. Zum Beispiel, wenn eine Oberflächendarstellung gewünscht ist, EMD Ausdrucks sichtbar zu machen, nur die "grüne" Schichten entsprechend dem für diesen Marker verwendete Filter sollte sichtbar sein.
- Glätten Sie das Bild und speichern Sie sie in einem Dateiformat erkannt (zB PNG) und laden Sie das Bild in das Programm. Um die Oberfläche des Grundstückes zu erzeugen, ändern Sie den Bildtyp auf 8-bit, ändern Sie die Helligkeit / Kontrast wie notwendig, um den Hintergrund zu reduzieren, und wählen Sie die "Analyze / Surface Plot 'Option. Die Bilder in Abbildung 5 wurden, indem Sie die "Schatten", "Draw-Achse", "Ein Polygon pro Zeile" und "Smooth" Checkboxen generiert.
- Alternativ nehmen Messungen mit dem Radius oder Durchmesser von der Brennzelle Ablagerung zum Zeitpunkt Null und im Vergleich zu den Zellen im äußersten Punkt zu unterschiedlichen Zeiten. Der Durchmesser der Teflon Vertiefungen beträgt 6,0 mm.
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Representative Results
Virale Vektoren kodierend für fluoreszierende Proteine können zusätzlich zu oder anstelle der Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden. Virale Transduktion sollte vor der Motilität Assay durchgeführt werden. Sowohl adhärenten und nicht-adhärenten Zelltypen kann differentiell markiert. Das Protokoll für die Weiterleitung von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Hier transduziert wir alloCTL in den 3, 5 und 6 mit RRV-EMD mindestens zwei Tage vor dem Test unter Verwendung des Protokolls 12 beschrieben. Wir verwendeten auch ein Lentivirusvektor, CMV-Erdbeer-IRES-FLUC2, um die Tumorzellen zu transduzieren, um die mStrawberry rot fluoreszierendes Protein (Figur 4) zum Ausdruck bringen. Diese Transduktion wurde durch Zugabe des Vektors in den Kolben von Zellen für 48 Stunden, wobei an diesem Punkt, frisches Medium zugegeben bewerkstelligt. Nachdem man die Zellen für zwei Tage erholen, limitierende Verdünnung wurde durchgeführt, um eine Population von 100% transduzierte Zellen zu erzeugen.
(3 und 5). Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt Zellen, die ursprünglich in der Mitte der Vertiefung ausgesät wandern vom Zentrum über die Zeit. Die Bildung alloCTL Aggregate nach 4 h (Figur 3, weiße Pfeile) wird wahrscheinlich reflektierende autokriner Wachstumsmuster von aktivierten, IL-2-produzierende T-Zellpopulationen, 13 ausgestellt.
In einem anderen Experiment wurden Mäuse-Effektor alloCTL durch Einweg-MLR unter Verwendung Haplotyp H-2d Balb / c-Splenozyten und Responder-Haplotyp H-2b / k Stimulator Splenozyten von B6C3F1-Mäusen, die Belastung auf die die TU-2449 Gliom syngen. Unmittelbar vor der Aussaat durch den Kanal ter auf die Tumorzellmonolayer Verteiler wurden die alloCTL mit eFluor 670. Die alloCTL (lila Zellen) angefärbt wurden in der Mitte des etablierten Monoschichten von TU-2449 Gliom-Zellen (rot), die zu 100% mit dem CMV-stroh transduziert wurden ausgesät IRES-FLUC2 viralen Vektor, und Brunnen überzogen der Tag vor dem Test. 4A und B zeigen mikroskopische Bilder des gleichen Quadranten der gleichen gut bei 1 und 48 Stunden entnommen. 4C und D wurden mit ImageJ digitalisierte lila Fluoreszenz umwandeln erzeugt Intensitäten in quantitative Oberflächendarstellung, die im dreidimensionalen Format angezeigt werden.
Schließlich wurden die menschlichen alloCTL mit inaktivierten Stimulatorzellen menschliche Gehirn tropen Zellen aus der metastasierenden Brusttumor-Zelllinie MDA-MB-231BR durch MLTR abgeleitet sind. Figur 6 zeigt Licht und Fluoreszenzmikroskopiebilder im Laufe der Zeit aus Anti-Haft CMPTX markierten alloCTL, teil transduziert mit RRV-EMD, die Migration auf ECM-Proteine f extrahiertrom diese Tumorzellen. In (A) das Hellfeld Mikrofotografie zeigt Schwer Platzierung alloCTL unmittelbar nach Sedimentation. In (B und F) Hellfeld-Mikrofotografien zeigen, 4 und 8 h zugeführt, die alloCTL radial Migration auf dem ECM. Die alloCTL Dichte mit Abstand von der Mitte des Brunnens ab (Mitte und ist der linken oberen Ecke des Feldes in BI). Panels (C und G) Show die gesamte alloCTL Vorbereitung mit CMTPX befleckt; (D und H) zeigen teilweise Weiterleitung des alloCTL mit RRV-EMD wie von einer kleinen Anzahl von EMD + T-Zellen angegeben ist, und (E und I) zeigen die zusammengeführten Bilder der RRV-EMD transduzierten alloCTL Migration auf der ECM zusammen mit der nicht-transduzierten alloCTL.
Abbildung 2. Die Tumorzellmonoschichten und ECM vernickelt auf CSM Schiebe Brunnen. Mikrofotografien von Schiebe Brunnen vorbereitetmit (A) konfluente U-87MG-Gliom-Zellmonoschichten, oder (B) ECM-Proteine aus konfluenten U-87MG mit Coomassie-Blau angefärbt extrahiert. Bar = 200 um. Klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Migration und Zytotoxizität von RRV-EMD transduziert Lymphozyten in der Mitte und Vorderkante des Zellen Einlagen über die Zeit. Fluoreszenzmikrofotografien zu verschiedenen Zeitpunkten an der Vorderkante und in der Mitte des alloCTL-RRV-EMD folgenden Sedimentation auf einer Monoschicht von anhaftenden U-87MG-Gliomzellen. Effektor alloCTL ausgesät als Einzelzellen, bilden sphärische Cluster innerhalb von 4 Stunden (weiße Pfeile) der Platzierung. Einzelfluoreszenzmarkierten CTL sind von der Mitte des Brunnens ein migrierts Zeit fortschreitet. Nach 24 Stunden sind leere Zelle Flecken in der adhärenten Mono sichtbar vermutlich auf alloCTL Zytolyse der Tumorzielzellen (siehe Bereich innerhalb Striche). Bar = 200 um. Klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Radial Migration von murinen alloCTL mit eFluor 670 auf mStrawberry markierten bei 1 und 48 Stunden gezeigt Gliomzellen gefärbt. Fluorescent Mikrofotografien eines Quadranten der gleichen gut an (A) 1 h und (B) 48 Stunden nach der Sedimentation von fluoreszenz -markierten nichthaft alloCTL auf eine Monoschicht von TU-2449 Gliomzellen. Die Low-Power-Mikroaufnahmen spiegeln die innerhalb eines Quadranten des CSM gut (Radius 3 mm) enthaltenen Bereich. Bei hoher Leistung (A und B, einfügungen) alloCTL (weiße Pfeile) in der Nähe dargestellt oder durch einzelne Tumorzellen assoziiert; hat man einen zerfallenen Aussehen mit fragmentierten Kernen und ist apoptotischen. (C und D) entsprechenden Oberflächen Intensität Fluoreszenz Karten erhalten mit ImageJ-Software, die Pixelwerte der digitalisierten lila Fluoreszenzbilder in dreidimensionaler grafischer Form und auf einem Gitter, das die gut Radius platziert von 3 mm. Bar = 500 & mgr; m. Klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Migration von alloCTL und horizontale Ausbreitung der RRV-EMD von transduzierten alloCTL an Tumorzellen. Fluorescent Mikrofotografien seriell zusammengenäht, um den Radius der auch mit Bildbearbeitungssoftware zu decken. Migration der RRV-EMD transduziertenalloCTL (weiße Pfeile) auf einer Monoschicht von U-87MG-Tumorzellen bei 0 und 72 h folgende Sedimentation gezeigt. RRV-EMD Transduktion von Tumorzellen in der Monolage ist auch offensichtlich bei 72 h nach der Zugabe des EMD-transduzierten alloCTL, das anzeigt, daß eine horizontale Übertragung von infektiösen RRV von Lymphozyten auf Tumorzellen hat (weißer Kasten und Einsatz) aufgetreten. Bar = 200 um. Klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Radial Migration alloCTL mit RRV-EMD transduziert und mit Celltracker Red CMTPX gefärbt. Die Zellen wurden auf ECM Auszüge aus MDA-MB-231BR-Zellen abgeleitet sedimentiert. Migration von alloCTL wurde von Hellfeld-Lichtmikroskopie bei 0, 4 und 8 h abgebildet (A, B, F Spalte 1, beziehungsweise). FluoreDuft Bilder der CMPTX (rot) gekennzeichnet alloCTL (C, G, Spalte 2), die RRV-EMD (grün) transduziert alloCTL (D, H, Spalte 3), und die zusammengeführten Bilder (E, I, Spalte 4) 4 und 8 h gezeigt. Bars = 200 & mgr; m; Bar in B für Bilder CI gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Tumorzellen in einem Einzelzellsuspension wurden in die Vertiefungen einer Teflon-maskiert Schieber pipettiert. Man ließ die Zellen anhaften und dann in einer befeuchteten 5% CO 2, 37 ° C-Inkubator (1A) gebildete Monoschichten. Etablierte Monoschichten oder ECM-Proteine aus der Monoschicht abgeleitet könnte für diese Assays (1B) geerntet werden. Effektor-T-Lymphozyten mit vitalen Farbstoffen markiert oder mit Vektoren für EMD Codierungs transduziert wurden in der Mitte des Bohrlochs unter Verwendung einer CSM ausgesät. Die Fähigkeit von nicht-adhärenten Effektor-T-Lymphozyten auf die Monoschicht oder ECM-Proteinen im Laufe der Zeit zu migrieren wurde dann ausgewertet und mit Licht und Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Hier untersuchten wir die Migration und Zytotoxizität von nichthaft Effektor alloCTL auf einer Monoschicht von teilweise relevanten Ziel U-87MG-Gliomzellen (Figuren 3 und 5). Diese Zielzellen und zeigt nur einen Teil der Human-Leukozyten-Antigen(HLA) Moleküle (HLA-A2, B44) auf den ursprünglichen Stimulatoren fanden, wurden verwendet, um die starke lytische Aktivität, die durch die alloCTL den einschlägigen 13-06-MG-Zielzellen (HLA-A1,2 und B44 angezeigt würden reduzieren , 57). Wir beobachteten auch die Beweglichkeit des alloCTL ECM von einer Monoschicht von MDA-MB-231BR Brusttumorzellen (Abbildung 6) geerntet. Die alloCTL wurden durch Einweg MLTR nach vorher veröffentlicht am 9. Verfahren erzeugt. Effektor alloCTL wurden 4-5 Tagen geerntet, nachdem Einweg MLTR und RRV-GS4-EMD transduziert (3 und 5) oder RRV-ACE-EMD (Abbildung 6) 10,11. Höhere Übertragungsspiegel wurden mit der GS4 Vektor Verwendung eines Gibbon ape leukemia virus Hülle als mit dem amphotropen Vektor ACE erreicht. Mit dieser Radialmigrationstest haben wir festgestellt, dass sowohl transduzierten und nicht-transduzierten fluoreszenzmarkierten alloCTL hatten Migrationsfähigkeit. Wir zeigen auch, dass sie ihre Fähigkeit behalten, um cyt werdenotoxic nach Durchlaufen Manipulationen für RRV Übertragung.
Die Fähigkeit von Maus alloCTL migrieren wurde ebenfalls beurteilt (Abbildung 4). alloCTL zu Haplotyp H-2b / k von der TU-2449-Zellen angezeigt sensibilisiert wurden mit eFluor 670 (lila) angefärbt und ein Migrationstest wurde mit TU-2449 mit CMV-Stroh-IRES-FLUC2 (rot) transduziert. Bei Verwendung von voll relevanten Ziel wurden eine geringere Anzahl von alloCTL Effektorzellen ausgesät, um eine schnelle Lyse der Tumorzelle Ziele zu verhindern. Verwendung von 1 h als Basislinie, T-Zellen weitgehend in hoher Dichte in der Mitte der auch als Einzelzellsuspension lokalisiert. Die 48 h-Aufnahmen zeigen umfangreiche Migration von T-Zellen in Richtung auf den äußeren Rand der Bohrung und Clustering der alloCTL ist an der Stelle ihrer Anfangsablagerung leicht offensichtlich mit der Zerstörung der Tumorzellen. Proliferation der TU-2449-Zellen als mStrawberry markierten Zellen Erhöhung der Dichte über die gut belegt. Das ist besser in der Oberflächen gesehenFluoreszenz Plots, die erzeugt wurden, um die Verteilung von Purpur-Zellen in den Vertiefungen (4, unteres Feld) zu visualisieren. AlloCTL Mobilität ist viel deutlicher in der auch bei 48 h im Vergleich zum Ausgangswert 1 Std. Ähnlich dem, was in den Tests unter Verwendung menschlicher alloCTL und Gliomzellen gesehen, ist ein Freiraum von den Tumorzellen in der Umgebung der Ausgangsablagerung von Effektoren auf 48 h bemerkbar, was die Lyse der Tumor-Zielzellen.
Ein kritischer Schritt in diesem Assay ist das Wachstum von gesunden Einzelschichten und anschließende Ernte von skelett 'ECM. Aussaat der Tumorzellen bei 2,5 bis 5,0 x 10 4 Zellen pro Vertiefung, nach oben zu Schritt 1.9, in der Regel in einer etwa auch Monoschicht für die Tumorzelltypen, die wir verwendet resultiert. Wir fanden, dass es von entscheidender Bedeutung, damit die Tumorzellen bei RT halten, da sonst die Konvektion, die bei 37 ° C erfolgt die Zellen in Richtung der Mitte der Vertiefungen zu drücken. Wie gut, vor der Beschichtung der Brunnen with Poly-D-Lysin und / oder ein ECM-Protein, wie Fibronectin oder Kollagen kann Erfolgsrate erheblich steigern. Darüber hinaus hatten wir mehr Erfolg mit diesen Tests unter Verwendung von Monolayer-abgeleitete 'Skelett' ECM als mit einzelnen ECM-Komponenten (dh., Fibronektin, Kollagen), die sehr viel weniger zuverlässig erwiesen. Es ist wichtig, die Zahl der nicht anhaftenden Zellen zu experimentieren, um durch die Sedimentation Verteiler sowie abzuscheiden, und bei Verwendung eines reinen Zelltyp, könnte man theoretisch in der Lage, eine Beweglichkeit Koeffizienten mit diesem Test zu definieren. Da das auch Volumen ist klein und einige Verdunstung des Mediums auftritt, muss der Monolage, täglich mit frischem Medium aufgefüllt werden. Medienwechsel verhindert auch Akkumulation toxischer Laktat als die Zellen wachsen und sich teilen. Failure, um eine gesunde Mono pflegen können in vergießen der Monoschicht oder ECM von der Bohrlochoberfläche führen.
Die Coomassie-Blau gefärbten ECM Proteine aus der U-87MG Gliom-Zell li abgeleitetne entsprechend dem Schritt 1.13 über werden als Anschauungsbeispiel für die anhaftende Trägerschicht hinter nach Verdauung mit Triton X-100 (1B) links gezeigt. ECM Herstellung aus einem Brustkarzinom-Zelllinie, MDA-MB-231BR Zellen häufig sehr ungleichmäßig und dünn, was zu einer ECM-Schicht, die mehr schlecht haft und manchmal von dem Objektträger während des Assays wurde aufgehoben. Die ECM-Protein Einhaltung des Schiebers verbessert wird, wenn Tumorzellen wurden als Monolayers für 1-2 Tage vor der Vergärung gehalten. Während des gesamten Prozesses wurde auch die Wartung des Teflon-Dichtung das Bohrloch umgebenden wichtig. Wobei das Volumen gering und Minimierung der Exposition des Teflon dem Triton-X100-Lösung entschärft Beschädigung der Integrität der Teflon-Dichtung.
Eine Anpassung dieses Protokoll kann die Verwendung einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix, die aus Abschnitten von OCT eingebettet Tumorgewebe 14 geerntet wurden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass der Abstand von der flachen Bottgut an der Gleitfläche OMED nur 1 mm; somit kann Abschnitte hinausgehende Dicke durch vielfältige Platzierungs gestört werden. Außerdem wäre ein Verfahren müssen für die Herstellung einer leichten Bohrloch in dem Gewebe, um das Tröpfchen von mittlerer die nicht adhärenten Zellen, die zu akzeptieren abzuweichen.
Herstellung eines gut dispergierten Einzelzellsuspension der Effektor-T-Lymphozyten vor der Sedimentation war auch zwingend. Sanften tituration der nicht adhärenten T-Zellen, um Aggregate zu einer Einzelzellsuspension zu dispergieren, war ein wesentlicher Schritt unmittelbar vor dem Laden des alloCTL in die Kanäle der CSM. Verwendung von nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung Puffer sollten erforderlichenfalls eingesetzt werden. 2,0 x 10 5 Zellen / & mgr; l für die Sedimentation, wie in Schritt 2.8 oben beschrieben - Weiterhin sollte die Dichte des Effektor-Lymphozyten etwa 1,0 sein. Niedrige Zellzahl darf auf keinen Bodensatz führen, während höhere Zellzahlen können sehr grosse Lager, die einfach zu unterbrechen, wenn die beweglichen verursachengleiten. Es wird auch empfohlen, dass die Serumkonzentration in dem Medium mindestens 10% betragen, um eine ausreichende Oberflächenspannung des positiven Meniskus, der die Möglichkeit Greifen verringert.
Eine invertierte Lichtmikroskop mit Fluoreszenz-Imaging-Funktionen und einem 4-fach oder 10-fach Ziele ist optimal für diesen Test. Die Zeitpunkte für die Bildgebung nach individuellen experimentellen Untersuchungen und Zelltypen bestimmt werden. Die nicht-adhärenten CTL insbesondere migrieren von der Mitte der Sedimentation zu der Kante des Bohrlochs schneller an ECM-Proteinen (4-8 h) als über einer Zell-Monoschicht (12-72 h). Teilweise waren MHC relevanten Zielzellen vorzuziehen, relevanten Ziele für unsere alloCTL Assay, um die Visualisierung der Motilität und um den Abbau zellvermittelten Cytolyse der Monoschichten, bevor signifikante Migration auftreten können; Verwenden eines niedrigen Effektor zu Ziel-Verhältnis verlangsamt auch die Lyse. Die Verwendung von teilweise angepaßt Targets ermöglicht eine bessere Visualisierung von RRVÜbertragung an die Tumorzellen auch.
Die Verwendung von einem inversen Mikroskop bietet mehrere Vorteile gegenüber einer aufrechten Rahmen. Eine invertierte Umfang ermöglicht Bebilderung durch befeuchteten Kammer, so daß Folien müssen nicht gestört werden, aber auch die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung für die Zellen. Auch Bildgebung durch die Kammer eine Barriere zwischen der Probe und dem Techniker, so dass für die Einhaltung der Sicherheitsstufe II (BSL II) Leitlinien für die Arbeit mit Menschen stammenden Gewebe 15.
Bei Verwendung eines aufrechten Rahmen, die höchste erreichbare ohne den positiven Meniskus der auch störende Vergrößerung 20x. Leider wird die Verwendung eines Deckglases oder Optik Kit Zubehör zum Zellsedimentation Verteiler wird nicht empfohlen, da die Unterbrechung des Meniskus führt typischerweise zur Spreizung der sedimentierten nicht adhärenten Zellen im ganzen gut. Abbildung über lange Zeiträume kann vorsichtige Zugabe von med erfordernium zu jeder Vertiefung zu ersetzen, um die Verdampfung verloren geht, obwohl dies eher im Zeitraffer-Bildgebung erforderlich.
Dieses Protokoll unterscheidet sich von Methoden, die horizontale Zellmigration von adhärenten Zellen zu messen in Zigmond Kammern 16,17, würde deren Design nicht für die Visualisierung von nicht-adhärenten Zellmigration zu erlauben. Andere Assays, die horizontale Migration in Richtung eines chemotaktischen Gradienten evaluieren durch ein Substrat, wie Agar werden in der Regel verwendet, um die Migration von einem Zelltyp 18-20 untersuchen. Verwendung des CSM bietet mehrere Vorteile auf diese Verfahren, sowie Verfahren, die eine vertikale Migration / Invasion von kultivierten Zellen, wie in Boyden-Kammern oder Matrigel Transwell-Platten zu messen. Erstens ermöglicht die Zell-Zell Kontakt für eine Bestimmung der Ziel-Effektor-Zell-Interaktion und Schädigung durch die Effektorzellen. Die cytolytische Fähigkeit alloCTL-RRV-EMD anfänglich durch Einweg MLTR mit Stimulator 13-06-MG Tumorzellen an die parti stimuliertAlliierten MHC-angepaßten U-87MG-Zelllinie ist ersichtlich, in der Mitte der Monoschicht bei 24 und 72 h folgende Sedimentation (Figuren 3 und 5, gestrichelte Linien). Wie gut, ist der Abbau von TU-2449-Zellen durch murine alloCTL bei 48 Stunden nach der Sedimentation (Abbildung 4) sichtbar. Die Monoschicht wird in der Mitte des alloCTL Ablagerung ausgelöscht, aber langsamer erfolgt über den Rest der Monoschicht, entweder aufgrund der Überlappung der HLA-Expression von 13-06-MG und U-87MG in den Assays mit menschlichen Zellen 21 oder dem Nieder Startnummer von Effektorzellen des murinen Gliom. Auch wird der Effektor Zieldichte verringert, wenn die Effektorzellen alloCTL vom Sedimentation Seite migrieren. Zusätzlich zu Migration und Zytolyse kann dieses Protokoll verwendet, um die Übertragung von Virus codiert fluoreszierende Proteine zu visualisieren. Hier ist die Übertragung von RRV-Codierung für EMD vom alloCTL an die Tumorzellen nach 72 Stunden (Abbildung 5, Einschub) evident.
Eine Einschränkung dieses Modells ist, dass die Migration nur in vitro, die nicht wirklich repräsentativ für die in vivo-Migration sein kann beurteilt werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass Chemokin / Chemokin-Rezeptor-Gradienten kann nicht mit dem Modell festgelegt werden. Während Wechselwirkungen von Immunzellen mit ECM oder einzelne Tumorzellen immer noch auftreten und davon abhängen, was diese Zellen sezernieren oder zum Ausdruck bringen, diese Beweglichkeit assay nicht beantwortet, ob die nicht-adhärenten Zellen spezifisch zu migrieren oder von isolierten Faktoren antworten.
Ein Vorteil dieses Assays ist die Fähigkeit, festzustellen, ob eine Population von nicht-adhärenten Zellen aufrechtzuerhalten wandernden Funktionalität, wenn die Lymphozyten haben oder nicht transduziert wurden. In unserem Beispiel ist die transduzierte Subpopulation durch EMD-Protein-Expression sichtbar, und es ist klar, dass die Migrations Funktionalität ist in dieser Subpopulation gehalten. Eine weitere Anwendung könnte darin bestehen, die Wirkungen von verschiedenen Konzentrationen von Mitteln oder Arzneimitteln, die nicht-anhaftenden Immunzellmigration beeinflussen könnten, zu testen. Auch könnten andere hämatopoetische Zellen Mobilität auf verschiedenen Substraten oder anhaftende Zellen von normalem Gewebe abgeleitet getestet werden. Schließlich, obwohl es hier nicht getan, Aussäen einer Kombination von adhärenten Zelltypen, dh, Stromazellen oder dendritischen Zellen mit Tumor vorsehen, analysiert reflektierende komplexeren in vivo Umgebungen.
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Acknowledgments
Unterstützt teilweise durch NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Förderkennzeichen UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 und der Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH und GCO erhielt von der Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship an der UCLA unterstützt. Die CSM-Gerät wurde von Creative Wissenschaftliche Methoden erhalten: www.creative-sci.com. Die lentiviralen Vektor wurde von der UCLA Vector Kern, der von CURE / P30 DK041301 unterstützt wird empfangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E.
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A.
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
