Transposon medieret Integration af plasmid DNA i subventrikulære zone neonatale mus Generer Nye modeller af Glioblastoma
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest almindelige (60%) primær hjernetumor hos voksne, med en median overlevelse på 15-21 måneder, når de behandles med kirurgi, strålebehandling og kemoterapi 1. Nye behandlinger for GBM er bydende nødvendigt. Eksperimentelle behandlinger kræver afprøvning i dyremodeller, som i tilstrækkelig grad gengive de vigtigste træk ved den menneskelige sygdom. Strategier til at inducere GBM i gnavere omfatter kemisk mutagenese med alkylerende midler, germline eller somatiske genetiske ændringer, eller transplantation hjælp gliom cellelinjer 2. De mest almindeligt anvendte modeller anvender implantation af gliomcellelinier enten orthotopisk, i hjernen eller subkutant anvendelse syngene celler i dyr med samme genotype; eller xenogene celler, mest almindeligt humane GBM cellelinjer, implanteret i immunsvækkede mus 3. Xenotransplantater giver mange fordele for studiet af intrakranielle tumorer: bekvemmelighed reproducerbarhed, stanrdized vækstrater, dødstidspunkt og tumorlokalisering. Men disse modeller har begrænsninger på grund af den kunstige, invasive kirurgiske metode, der anvendes til implantationer og begrænset evne til præcist at gengive histologiske træk karakteristisk for human GBM (WHO grad IV): pseudo-pallisading nekrose, nukleare atypias, diffus invasion, mikro-vaskulær proliferation og dannelsen af glomeruloid karabnormaliteter 4-7. Induktion af GBM ved at ændre genomet af somatiske celler med onkogent DNA, enten med virale vektorer 8-12, eller med transposon-medieret integration 13, gengiver tættere ætiologien af sygdom hos mennesker og rekapitulerer histo-patologiske træk ved human GBM.
Historisk set tumorer i CNS er klassificeret baseret på den opfattede celle oprindelse, som det blev observeret, ville være en prædiktiv faktor for overlevelse 14. GBMS inddeles i primære og sekundære. Nye beviser today peger på den meget heterogene karakter af primær glioblastom 15. Sekundær GBM (15%), resultatet af malign transformation af lav kvalitet astrocytomer (WHO grad I) og anaplasic astrocytomer (WHO grad II), er forbundet med tidligere udbrud af sygdommen, bedre prognose og en "proneural" mønster af genekspression , mens primær GBM (85%) viser en sen debut, dårlig prognose og glia (klassisk), neurale eller mesenkymale ekspressionsmønstre. Hvorvidt disse mønstre af genekspression korrelerer med faktiske celle oprindelse af tumoren stadig undersøges aktivt. Akkumulerende data viser, at kombinationen af genetiske mutationer forbundet med GBMS er prædiktiv for overlevelse. For eksempel er tab af heterozygocity (LOH) kromosomer 1p / 19q, IDH1 mutationer, PDGFRα amplifikationer, der er forbundet med sekundære GBMS, proneural udtryk mønster og en bedre prognose, hvorimod EGFR overekspression, Notch og Sonic pindsvineoverføringsvejen aktivering, Nf1 og PTEN tab og mutationer af p53 er korreleret med neural, klassisk eller mesenchymal primære GBM og dårligere prognose 16,17. Fremkomsten af store sekventering projekter og ophobningen af mange patientprøver rådighed til test bringer et væld af nye oplysninger i forhold til genetiske mutationer og veje impliceret i GBM patogenese og progression og muligheden for individualiseret medicin, hvor behandlinger kan skræddersyet til genetiske abnormiteter i patienten. I sidste ende, at vurdere den prædiktive værdi af disse mutationer og veje på en systematisk måde, og for at teste mulige behandlinger i hvert enkelt tilfælde, kræver dyremodeller af GBM med forudbestemte genetiske ændringer. Transposon medieret integration af genomisk DNA tilbyder en mulig fremgangsmåde.
The Sleeping Beauty transposon-system, medlem af TC1 / mariner klasse af transposoner, var "vækkes" (konstrueret) i en multi-trins process af stedspecifik mutagenese fra en laksefisk transposase gen, som blev sovende mere end 10 millioner år siden 18,19. I det væsentlige, DNA transposoner flankeret af specifikke sekvenser (omvendte gentagelser / direkte gentagelser: IR / DR) kan integreres i genomet i en "cut and paste" måde ved hjælp af aktiviteten af Tornerose transposasen. Transposasen genkender enderne af IR sites, exciserer transposon og integrerer det tilfældigt ind i et andet DNA-sted mellem baserne T og A, baser, der duplikeres ved hver ende af transposonet under gennemførelse (figur 1a). The Sleeping Beauty transposase består af tre domæner, et transposon bindende domæne, en kernelokaliseringssekvens og et katalytisk domæne. Fire transposasesekvenser molekyler er forpligtet til at bringe de to ender af transposonet sammen og give mulighed for gennemførelse, men hvis alt for mange molekyler af transposase er til stede, kan de dimerisere og tetramerisere at hæmmeomlejringsreaktionen 20. En effektiv gennemførelse reaktion kræver et optimalt forhold af transposase til transposoner. DNA'et, der koder for transposasen kan leveres på det samme plasmid med transposon (i cis) eller på et andet plasmid (i trans). For at sikre optimale forhold mellem transposasen og transposoner, kan vælges en promotor med passende aktivitet til ekspression af transposasen (til "cis" model) eller forholdet mellem plasmiderne i injektionsvæsken kan optimeres (for "trans" model). The Sleeping Beauty transposon kan anvendes med succes til funktionel genomforskning, insertionsmutagenese, gensplejsning og somatisk genterapi 21. At være en syntetisk konstruktion omlagte til en funktionel molekyle fra en sovende laksefisk variant, er den sovende skønhed transposase ikke binde sig til andre transposoner i mennesker eller andre pattedyr 20. Siden opdagelsen, molekylær teknik har lydudstyred gennemførelsen effekten af SB transposon systemet gennem ændringer i IR-sekvenser og tilsætning af TATA dinucleotider flankerer transposonet, hvilket resulterer i PT2 transposoner. Disse transposoner har optimeret binding af SB til IR stedet og øget effektivitet af excision. SB transposase undergik også signifikant forbedring; transposasen anvendt i eksperimenter præsenteret heri er SB100X, en hyperaktiv transposase frembragt af en DNA-shuffling strategi efterfulgt af et stort genetisk skærm i pattedyrceller 22.
I denne rapport præsenterer vi en hurtig, alsidig og reproducerbar metode til at inducere iboende GBM i mus med non-viral, transposon-medieret integration af plasmid DNA i celler i sub-ventrikulær zone af neonatale mus 23. Vi præsenterer en enkel måde at skabe transposoner med nye gener, som kan underkastes for genomisk integration ved hjælp af Tornerose transposasen og vise hvordan man kan overvåge plasmid optagelse ogsygdomsprogression ved anvendelse af bioluminescens. Vi karakteriserer også histologiske og immunhistokemisk funktioner af GBM gengivet med denne model. Derudover præsenterer vi en hurtig metode til at generere primære GBM cellelinier fra disse tumorer. The Sleeping Beauty model, hvor tumorer induceres af celler original til dyret, tillader funktionel vurdering af den rolle, kandidat GBM gener i induktion og progression af tumorer. Dette system er også velegnet til afprøvning af nye GBM behandlinger, herunder immunterapier i immunkompetente mus, uden behov for invasive inflammatoriske kirurgiske procedurer, hvilket kan ændre den lokale mikromiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel, vi detaljer en alsidig og reproducerbar metode til frembringelse af nye modeller af GBM hjælp SB transposase- medieret integration af onkogent plasmid-DNA i celler, der omgiver den subventrikulære zone af neonatale mus. Vi præsenterer en protokol til at generere transposonsekvenser plasmider med nye gener af interesse, illustrerer hvordan man kan overvåge udviklingen af tumorerne med levende dyr, og hvordan man kan karakterisere histo-patologiske og immunhistokemisk funktioner i disse tumorer….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
