Introduction
수술, 방사선 요법, 화학 요법으로 치료 한 경우 다형성 교 모세포종 (GBM)는 15~21개월의 평균 생존 기간으로, 성인에서 가장 흔한 (60 %) 차 뇌종양이다. GBM에 대한 소설 치료는 필수적이다. 실험 요법 적절히 인간 질병의 두드러진 특징을 재현 동물 모델에서 시험을 요구한다. 설치류 교종 세포주를 사용하여 화학이 알킬화제와 돌연변이 유발, 또는 배아 체세포 유전자 변형, 또는 이식을 포함 GBM의 전략을 유도한다. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 뇌 내로 또는 피하로 동일한 유전자형의 동물 세포를 이용하여 동계 어느 동소, 신경 교종 세포주 주입을 채용; 또는 이종 세포는 면역에 이식 가장 일반적으로 인간 GBM 세포주, 마우스 3 손상. 이종 이식은 두개 내 종양의 연구에 많은 장점을 제공합니다 재현성의 편의를 위해, standardized 성장률, 죽음과 종양 현지화의 시간. 의사 pallisading 괴사, 핵 atypias, 미만성 침윤, 미세 혈관의 증식 : 착상하고 정확하게 조직 학적을 재현하는 능력의 한계에 사용되는 인공, 침습 수술 방법으로 인간의 GBM (WHO 4 등급)의 특성을 특징으로 인해 그러나 이러한 모델은 한계를 가지고 및 glomeruloid 혈관의 형성은 4-7 나 비정상. 종양 DNA와, 중 바이러스 벡터 8-12, 또는 트랜스포존 매개 통합 13과 체세포의 게놈을 변경하여 GBM의 유도는 더 밀접하게 인간의 질병의 원인을 재현하고 인간의 GBM의 histo-병리학 적 특징을 되풀이.
역사적으로, 중추 신경계의 종양 분류가 관찰되었다 기원의 인식 셀을 기반으로 한, 생존 (14)에 대한 예측 요인이 될 것입니다. GBMs 기본 및 보조로 분류된다. 신흥 증거 TOD님이 차 아교 모세포종 (15)의 매우 이질적인 성격을 가리키는. 보조 GBM (15 %), 낮은 등급의 성상 세포종 (WHO 등급 I)과 anaplasic 성상 세포종의 악성 변환 결과 (WHO 등급 II), 질병의 초기 발병, 더 나은 예후 및 유전자 발현의 "proneural"패턴과 연관된 차 GBM (85 %) 반면, 발성, 불량한 예후와 아교 (클래식), 신경 또는 중간 엽 발현 패턴을 보여줍니다. 유전자 발현의 이러한 패턴의 유래 종양의 실제 셀과 상관 여부 여전히 활발히 연구되고있다. 데이터를 축적하면 GBMs와 연관된 유전 적 돌연변이의 조합이 생존 예측 것을 보여준다. 예를 들어, 염색체 1P / 19q, IDH1 돌연변이, PDGFRα의 증폭의 heterozygocity의 손실 (LOH)는 EGFR 과발현, 노치와 소닉 고슴도치 경로 활성화 NF-반면, 보조 GBMs, proneural 표현 패턴과 더 나은 예후와 연관된1 PTEN 손실과 p53의 변이는 신경, 클래식, 또는 중간 엽 차 GBM과 나쁜 예후 16, 17과 관련되어있다. 대규모 시퀀싱 프로젝트의 출현 및 테스트에 사용할 수 많은 환자 검체의 축적은 GBM의 발병과 진행 및 치료 특별히 맞출 수있는 개인화 된 의학의 가능성에 연루 유전자 돌연변이 및 경로에 대한 새로운 풍부한 정보를 제공합니다 환자의 유전 적 비정상. 궁극적으로, 이러한 체계적인 방법 및 돌연변이 경로의 예측값을 평가하고, 각각의 경우에 가능한 치료법을 테스트 소정 유전자 변형 동물과 GBM의 모델을 필요로한다. 게놈 DNA의 트랜스포존 매개 통합은 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다.
잠자는 숲속의 미녀의 트랜스포존 시스템, 트랜스포존의에 T / 선원 클래스의 멤버는, 다단계 proce을에서 (건설) "깨어"했다휴면보다 10 만 년 전 (18, 19)가 된 salmonoid 트랜스 유전자에서 특정 사이트 돌연변이의 SS. 본질적으로, 특정 시퀀스 (반전 반복 / 직접 반복 : IR / DR)에 의해 측면 DNA 트랜스포존은 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스의 활동에 의해 "잘라 내기 및 붙여 넣기"방식으로 게놈에 통합 할 수 있습니다. 트랜스는, IR 사이트의 끝을 인식하는 트랜스포존을 소비세 및 기지 T와 A, 전위 (그림 1a) 동안 트랜스포존의 각 끝 부분에 중복 기지 사이에 다른 DNA 사이트에 무작위로를 통합합니다. 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스은 세 가지 영역, 트랜스포존 결합 도메인, 핵 이행 순서와 촉매 도메인으로 구성되어 있습니다. 트랜스 포 분자 함께 트랜스포존의 양단을 가져다 전치 있도록, 트랜스의 너무 많은 분자가 존재하는 경우, 그들은 이량하고 억제하는 데 필요한 tetramerize전위 반응 (20). 효율적인 전위 반응은 트랜스포존에 트랜스의 최적 비율을 필요로한다. 트랜스를 코딩하는 DNA는 (시스)에서 트랜스포존과 같은 플라스미드 또는 (트랜스)에서 상이한 플라스미드 상에 전달 될 수있다. 트랜스와 트랜스포존 간의 최적 비를 확보하기 위해, 충분한 활성을 갖는 프로모터에 대해 (( "CIS"모델) 트랜스의 발현 또는 최적화 될 수 주사액에서 플라스미드의 비율에 대해 선택 될 수있다 "트랜스"모델). 잠자는 숲속의 미녀 transposon의 시스템은 기능 유전체학,에서 삽입 돌연변이 유발, transgenesis 및 체세포 유전자 치료 (21) 성공적으로 사용할 수 있습니다. 합성 구조는 휴면 salmonoid 변형에서 기능성 분자를 재 설계이기 때문에, 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스는 사람이나 다른 포유 동물 (20)의 다른 트랜스포존에 결합하지 않습니다. 그 발견 이후, 분자 공학 enhanc있다ED IR 시퀀스 및 TATA 디 뉴클레오티드는, 트랜스포존 측부 PT2 트랜스포존 결과의 변화를 통해 부가 SB 트랜스포존 시스템의 전치 효능. 이러한 트랜스포존 IR 사이트 SB의 결합을 최적화 절개 효능을 증가했다. SB의 트랜스도 상당한 개선을 받았다; 본원에 제시된 실험에 사용은 트랜스 SB100X, 포유 동물 세포에서 22 대규모 유전자 스크린 뒤에 DNA 셔플 전략에 의해 생성 하이퍼 트랜스이다.
이보고에서는 신생 생쥐 (23)의 서브 영역의 심실 세포로의 플라스미드 DNA의 비 바이러스, 트랜스포존 매개 통합 마우스에서 극한 GBM을 유도하는, 급속 다용도 재현 방법을 제시한다. 우리는 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스를 사용하여 게놈 통합을위한 의무가 새로운 유전자 트랜스포존을 만들고 플라스미드 흡수를 모니터링하는 방법을 설명하는 간단한 방법을 제시하고생물 발광을 사용하여 질병의 진행. 우리는 또한이 모델 재현 GBM의 조직 학적 및 면역 조직 화학적 기능을 특징. 또, 이들 원발성 종양 GBM 세포주를 생성하는 빠른 방법을 제시한다. 종양 동물에게 원래 세포로부터 유도되는 슬리핑 뷰티 모델은 유도 및 종양 진행에 GBM 후보 유전자의 기능적 역할의 평가를 허용한다. 이 시스템은 또한 잘 로컬 미세 환경을 변경할 수 침습적 염증 수술의 필요없이, 면역 능력이 생쥐의 면역 요법을 포함한 새로운 GBM 치료의 테스트에 적합합니다.
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Protocol
참고 : 모든 동물 프로토콜이 동물의 사용 및 관리에 대한 미시간위원회의 대학 (UCUCA)에 의해 승인되었습니다.
새로운 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존에 관심의 순서 1. 복제
참고 : 유전자 또는 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스 시스템을 사용하여 (shRNA를 등) 억제 요소를 삽입하려면, PKT 또는 PT2 플라스미드의 중추로 관심의 순서를 복제. 복제를 직접 규제 요소, 관심과 마커의 유전자가 반전 반복 (IR / DR)의 어귀를 유지하도록. 아래에 자세히 설명되어 있습니다 PKT 백본에 PDGFβ 복제의 예 (참조 그림 1b).
- 반응 부피 50 μL를 XbaI에서 /의 XhoI 제한 효소의 단위를 37 ~ 10 ° C에서 4 시간 플라스미드 벡터 PKT-IRES-Katushka 5 μg의 다이제스트.
- 5-10 부와 37 ° C에서 4 시간을 pGEM-T- mPDGFβ 플라스미드 5㎍을 mPDGFβ의 cDNA를 다이제스트를 NcoI / SacI로 제한 효소들.
- 100 % 에탄올 2.5 권, 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.8의 1/10 부피를 첨가하여 전체 DNA를 석출시킨 -20 ° C에서 밤새 배양한다.
- 15 분 동안 13,800 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 1 분 동안 13,800 XG에 70 % 에탄올, 원심 분리기 500 μL와 DNA 펠렛을 씻으 번 반복 멸균 DNase를 무료로 물 19 μL에 다시 일시 중지합니다.
- (mPDGFβ)를 모두 벡터 (PKT-IRES-Katushka)의 끝을 무디게하고 삽입 빠른 블 런팅 키트 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 무딘 벡터를 넣고 1.2 % 에티 디움 브로마이드 스테인드 아가 로스 겔에 넣고 40 분 동안 80 V에서 실행합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 겔 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하여, 밴드를 시각화 깨끗한 면도기 블레이드 겔로 절제.
- 1 몰비 (삽입 : 벡터) 사에서 튜브에 추가하여 단계 1.7 정제 삽입 및 벡터 DNA를 결찰. 이 튜브, 페이지 속으로ipette T4 리가 1 μL와 (ATP를 포함) T4 리가 버퍼의 2 μL, 멸균 물을 20 μL로 볼륨을 조절합니다. 16 ° C에서 18 시간 동안 연결 반응을 품어.
- 결찰 유능한 화학 제품 DH5α 세포를 형질 전환 박테리아.
- 얼음에 관할 세포를 해동.
- , 적격 세포를 50 μL로 연결 반응의 전체 볼륨을 추가 부드럽게 흔들 관을 30 분 동안 얼음에서 인큐베이션 믹스. 42 ° C에서 45 초 동안 박테리아를 열 - 충격과 얼음에 즉시 반환; 추가 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 문화 루리아 국물의 950 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양한다. 원심 분리기 박테리아 2,400 XG에 3 분 동안 (LB)의 200 μL의 펠렛을 다시 중단
- LB 아가 로스 및 해당 항생제로 코팅 페트리 접시에 형질 전환 된 박테리아를 확산. 37 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
- 마지막으로, 5 ~ 10 bacte를 수집리얼 식민지 항생제와 LB 미디어 5 ㎖에서 밤새 37 ° C에서 문화.
- 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 DNA 미니 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제한다. 진단 제한 벡터 내로 삽입 체의 적절한 혼합을 확인하고 인서트의 오른쪽 방향을 보장하기 위해 DNA 시퀀싱 양성 클론 제출 다이제스트 수행.
- 무료 플라스미드 준비 키트를 내 독소, 올바른 식민지를 선택하고 높은 품질을 사용하여 DNA 생산을 확장 할 수 있습니다.
- 멸균 또는 1 mM 트리스 - 염산의 DNA를 용출시켰다. 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 저장 DNA는 신생아에 주입합니다.
2. 내부 심실 신생아 주사
- 실험 3 ~ 4 주 전에, 한 남자와 한 여자 마우스 및 플라스틱 색깔 이글루의 마우스와 사육 케이지를 설정합니다. 이는 농축 된 환경을 제공하고 결합 프로세스를 돕는다.
- 임신이 확인 된 경우, m 삭제새 케이지 에일. 열 여덟 일 짝짓기 후, 배달을 위해 매일 케이지를 모니터링 할 수 있습니다. 출생 후 하루 1 (P1)에 뇌 실내 주사를 수행합니다.
- 주사액의 제조
주 : 주사 용액을위한 형질 입자를 만드는 형질 전환 시약 플라스미드 DNA를 혼합함으로써 만들어진다. PT2 / SB100x 뤽 두 트랜스포존 플라스미드 : pT를 / CAGGS-NRASV12 및 Pt / CMV-SV40-LGT의 비율로 아래 슬리핑 뷰티 트랜스 및 루시퍼 라제를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 주입 용액의 제조에 대한 예는 1 : 2 : 2. 모든 플라스미드는 2 ㎍ / μL의 농도를 갖는다. 주사액의 제조에 중요한 세부 사항이 논의에서 제시된다.- / CMV-SV40-LGT, 10 μl를 4 μg의 (2 μL)의 Pt PT2 / SB100x 룩, pT를 / CAGGS-NRASV12 8 μg의 (4 μL), 8 μg의 (4 μL)의 : 추가하여 DNA 솔루션을 준비 1 ㎍ / ml의 농도에서 20 μL의 최종 부피로 10 %의 글루코오스DNA, 5 % 글루코스.
- 5 % 글루코스의 최종 농도 생체 제트 PEI 2.8 μL, 멸균 7.2 μL, 10 % 글루코스 10 μl를 첨가하여 PEI 용액을 준비한다.
- 상기 DNA 용액에 PEI의 혼합 용액을 첨가하고 보텍스 20 분 동안 실온 (RT)에 앉게. 이 솔루션은 이제 주입을위한 준비가되어 있습니다. RT에서 1 시간 후, 얼음에 솔루션을 유지.
- 마이크로에 12.5 ° 경사와 30 게이지 피하 주사 바늘이 장착 된 10 μL 깨끗한 주사기를 장착한다 (그림 2 # 1).
- 분사 시스템의 적절한 기능을 확인하려면, 자동 주사기를 사용하여 (그림 2 # 1) 주사기에 물 10 μl를 철회하고 완전히 주사기를 비 웁니다
- 신생아 정위 쿨 스테이지 (도 2 # 3) 2-8 ℃의 온도로 드라이 아이스와 알코올의 슬러리.
- 젖은 얼음에 새끼를 배치하여 마취를 유도2 분. 마취 절차의 나머지 부분에 대한 냉각 고정대에 계속됩니다. C는 열상 부상을 방지 할 2-8 ° 사이, 영하 프레임의 온도를 유지하면서. 같은 특별한 예방 조치 새끼는 젖은 얼음에 배치하기 전에 거즈에 싸서 할 수 있습니다.
- DNA / PEI 솔루션으로 주사기를 입력합니다.
- 거즈 덮여 귀 바 (그림 2b) 사이에 머리를 배치하여 고정대에서 강아지를 고정. 두개골의 등쪽면이 수평이되었는지, 프레임의 표면에 평행 두개골 봉합 명확하게 볼 수 있도록. 70 % 에탄올로 머리를 닦아냅니다.
- 주사기의 바늘을 내리고 바늘이 람다 (정수리와 뒤통수 뼈의 중간 선 교차) (그림 2B)에 닿을 때까지 고정대의 다이얼을 사용하여 정위 좌표를 조정합니다.
- 바늘을 올리고 0.8 mm 가로 1.5 m에 정위 좌표를 조정람다 (그림 2b)에 m의 주동이.
- 끝이 닿을 약간 피부를 딤플 때까지 바늘을 낮 춥니 다. 좌표를 측정한다. 바늘 또 다른 1.5 mm를 낮 춥니 다. 바늘이 피부와 두개골을 관통하고, 뇌실 (그림 2C)를 입력 피질을 통과하게된다.
- 자동 주사기를 사용 / 분 0.5 μL의 속도로 DNA / PEI 용액 0.75 μL를 주입
- 이 솔루션은 심실로 분산 할 수 있도록 다른 분을 위해 프레임에 강아지를 유지합니다. 한편, 다음의 주입을위한 준비에 2 분 동안 얼음에, 다른 강아지 마취.
- 부드럽게 천천히 바늘을 들어 올려 가열 램프 아래에 강아지를 놓습니다. 호흡과 활동을 모니터링합니다. 필요한 경우 처음 호흡이 계속된다 때까지, 사지의 부드러운 자극을 제공합니다.
- 이 예열, 정기적으로 호흡, 장미 빛 색상에 도달하고 보통 5-7 분 활성화 된 후 어머니에 강아지를 돌려줍니다. 미주리 경우한 강아지가 한 번에 주입보다 재, 모든 주입이 완료 될 때까지 모두 함께 새끼를 유지합니다. 주사 30 분 이상 걸리는 경우, 처음 30 분 및 절차의 끝에서 나머지 후 새끼의 절반을 반환한다.
- 댐 반응과 그녀의 새끼를 양육 것을 모니터링합니다. 필요한 경우, 케이지에 대리모를 추가합니다.
- 얼음에 강아지를 놓고 온난화 램프 아래로 배치 사이의 간격이 10 분 있는지 확인하십시오. 생존 과정을 더 빨리. 보통은 마취 및 강아지를 주입하는 데 걸리는 시간은 4 분이다.
종양의 형성과 진행 3. 생물 발광 모니터링
3.1) 주사 후 플라스미드 흡수를 모니터링
- 주사 후 24 ~ 72 시간은 6 잘 깨끗한 조직 문화 요리, 한 강아지의 어머니의 케이지 장소에서 모든 새끼를 제거 당 잘.
- 생리 식염수 또는 phosphat에 용해 루시페린의 30 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다전자 버퍼입니다. 사전에이 솔루션을 준비하고 -20 ° C에서 작은 분량 씩 유지.
- 30 게이지 피하 바늘을 구비 한 1 ㎖를 주사기를 사용하여 강아지의 어깨 블레이드 간의 루시페린 피하 30 μL를 주입. 바늘이 피부를 곤란하게하고 바늘을 삽입하기 전에 약간 들어 올려, 모든 장기를 관통하지 않도록하십시오.
- 이미지 즉시 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하는 경우. 자동 노출, 큰 비닝 (binning),와 조리개 F = 1 : IVIS 스펙트럼의 경우, 인수에 대해 다음 설정을 사용합니다.
3.2) 모니터링 종양 형성과 진행
참고 : 동물, 2½-6 주 이내에 생물 발광 및 조직 검사에 의해 검출 거시적 인 종양을 형성 주입 된 종양 플라스미드에 따라 시작됩니다.
- 26 게이지 바늘이 장착 된 1 ㎖를 주사기를 사용하여 30 ㎎ / ㎖ 용액 100 루시페린 μL를 복강 내 주사.
- 마취 실에서 동물을 놓습니다. 동시에 다섯 동물까지 주입한다.
- 다음 동물을 마취하는 산소 / 이소 플루 란 흐름 (1.5 ~ 2.5 %의 이소 플루 란)를 시작 5 분을 기다립니다. 3-4 분 후, 마취 챔버로부터 동물을 제거 생물 발광 챔버 내의 산소 / 이소 플루 란 흐름을 시작한다. 마취와 빛의 장애물 통과를 허용하도록 유리 코 콘 장착 된 각각의 슬롯에 동물을 놓습니다.
- 일반적으로, 자동 노출 시간, 중앙값 비닝 및 F = (1)의 구경 조리개 2 분 간격으로 6 일련의 이미지를 획득.
- 헤드 영역 위에, 통상 타원형 묘화 모든 동물의 관심 영역을 설정하고 / s / cm 2 / SR 보정 유닛 광자를 이용한 발광 강도를 측정한다.
- 각 동물에 대한 최대 값을 기록한다. 이어서, 기록은 예 whe에 대해, 각 동물 및 / 또는 동물 용 간 종양의 진행 중에 비교 될 수있다n은 다른 치료가 사용된다.
새로운 GBMs 4. 조직 학적 및 면역 조직 화학적 분석
참고 : 종양이 원하는 실험 시간이 지점에 도달했을 때, 동물이 희생 될 수있다, 뇌, 관류 고정 및 분석 하였다. 생존을 위해 동물이 증상을 보여주는 장애인 이동성, 웅크 자세와 지저분한 모피가되면 임상 단계에 의해 정의 된대로 동물을 인도적으로, 종양 부담의 첫 번째 징후에 희생 될 때 죽어가는 단계는 실험의 끝점을 나타냅니다 분석한다. 사용되는 표준 조직 학적 및 면역 조직 화학적 방법에 대한 간단한 설명은 아래에 제시되어있다.
4.1) 관류 및 고정
- 케타민 100 ㎎ / kg 자일 라진 및 10 ㎎ / ㎏ 복강 내 주사하여 마우스를 마취.
- 마우스의 발을 집어 페달 반사를 확인합니다. 이 반사가 폐지 나타내는 깊은 마취, immob복강을 열고 핀 해부 보드에 마우스를 ilize 다이어프램을 해부 마음을 시각화하는 흉강을 엽니 다.
- 심장의 좌심실에 무딘 20 게이지 캐뉼라를 삽입합니다. 플라스틱 튜브는, 염화칼슘 2 2H 2 O 산소와 헤파린 타이로드의 솔루션 (0.8 % 염화나트륨, 0.0264 %로 컨테이너에 연동 펌프를 통해 지나가는 정맥을 연결 0.005 %의 NaH 2 PO 4, 0.1 %의 포도당, 0.1 %의 NaHCO3, 0.02 %의 KCl). 느리고 일정한 흐름, 동물이 작은 경우 초 이하인 당 약 한 방울을 위해 연동 펌프의 속도를 조절하여 타이로드의 용액의 유동을 시작한다.
- 혈액과 타이로드의의 드레인을 허용하는 심장의 우심방에 작은 절개를합니다.
- 그들은 혈액의 결여됨에 따라 (간 및 신장에서 가장 눈에 띄는) 내부 장기의 창백을 관찰하여 관류 효율성을 모니터링합니다.
- 때심장에서 배출 솔루션 (3-5 분) 분명, 고정 (4 % PFA, 인산염 완충 식염수에서의 pH 7.34) 4 % 파라 포름 알데히드로 타이로드의에서 솔루션을 전환합니다.
- 목과 꼬리의 증가 강성하여 조직의 좋은 고정을 모니터링합니다.
- 마우스 목을 벨 조심스럽게 두개골에서 뇌를 해부하다.
- 코쪽으로, rostrally 두개골을 덮고있는 털을 당기고 머리, 지느러미 쪽을 안정시키기 위해 단단히 잡아.
- 안와 근육과 하부 광대뼈 아치를 쪼개다하는 궤도의 가장자리를 따라 아래쪽으로 절단 날카로운 메스를 사용.
- 머리 복부 쪽을 켜고 rongeur를 사용하여 부착 목 근육을 제거합니다. 첫 번째 척추 호감과 뇌간에서 제거합니다.
- , 달팽이관을 시각화 rongeur와 상부 측두골을 잡고 시간과 후두골 사이의 구멍을 만드십시오. 소뇌의 표면에서 후두골을 벗겨.
- 머리 복부 쪽을 돌립니다. 뇌는 오직 두개골 신경을 통해 이제 연결, 두개골의 나머지 부분에서 아래로 슬라이드합니다. 사용 작은 가위는 후각, 광학 및 삼차 신경을 잘라. 이것은 뇌를 발표 할 예정이다.
- 후 고정을 위해 4 ° C에서 하룻밤 4 % PFA 뇌를 놓습니다.
- 조직 학적 분석 및 헤 마톡 실린 - 에오신 염색의 경우, 24 시간 동안 인산염 버퍼에 머리를 전송 한 후 내장 파라핀로 진행합니다.
- (뇌가 튜브의 바닥에 가라 앉을 때까지) 면역 조직 학적 분석을 위해, 24 ~ 48 시간 동안 인산염 완충 식염수에 30 % 자당 용액에 두뇌를 전송
- 종양 지역의 중간을 통해 반 섹션 뇌는, 상처를 배치아래로 동결 금형에 측면, 드라이 아이스 에탄올, 드라이 아이스 이소 펜탄 슬러리 또는 액체 질소로 냉동 임베딩 미디어 OCT (화합물) 및 플래시 동결에 포함합니다. 단면 및 염색 할 때까지 -80 ℃에서 냉동 블록을 유지합니다.
4.2) 파라핀의 헤 마톡 실린 - 에오신 염색은 고유 GBMs의 Histo-병리학 적 분석을위한 두뇌를 내장
- 섹션 파라핀은 유리 슬라이드에 42 ° C의 물을 욕조에 떨어 마운트, 4 μm의 두께로 머리를 내장.
- 크실렌 가득 세 슬라이드 용기의 시리즈를 통해 5 분 간격으로 전송 한 후이를 60 ° C의 오븐에서 10 분간 넣어서 의해 탈 paraffinize 슬라이드.
- 2 분 동안 100 %의 에탄올을 한 번 반복하여 95 % 에탄올을 2 분 동안 반복 한 번, 70 % 에탄올을 2 분 동안 교반하고 물에 슬라이드를 전송할 : 에탄올 욕의 일련의 슬라이드 수화물.
- 2 분 동안 해리스 헤 마톡 실린 가득 슬라이드 용기에 침적하여 슬라이드를 얼룩.
- 물이 깨끗해질 때까지 수돗물에 씻어.
- 딥 두 번 잉 용액 (0.1 % 중탄산 나트륨)에 슬라이드.
- 슬라이드를 2 분 동안 수돗물에 서 보자, 다음 2 분 동안 80 % 에탄올로 전송할 수 있습니다.
- 5 분 동안 에오신으로 채워진 용기에 침적하여 슬라이드를 얼룩.
- (한 번 반복 한 번, 100 % 에탄올 2 분을 반복, 80 % 에탄올 3-4 강하, 95 % 에탄올 2 분) 에탄올 화장실의 일련의 슬라이드를 탈수.
- 자일 렌의 3 연속 화장실, 3 분 각각으로 취소합니다.
- 크실렌 기반 장착 매체 커버 슬립 및 이미징을위한 준비가 될 때까지 실온에서 평평한 표면에 건조 할 수 있습니다. 실온에서 보관하십시오.
드 노보 유도 GBMs의 분자 세포 특성에 대해 알아내는 보존 임베디드 두뇌의 4.3) 면역 조직 화학
- , -80 ° C 저장 영역에서 냉동 블록을 검색 저온 유지 장치에 배치하고 온도가 30 분 동안 평형 수 있습니다.
- 제 12-14 μm의 두께 섹션과는 양으로 대전 된 유리 슬라이드 위에 2 ~ 3 절을 탑재합니다. 다른 슬라이드에 인접한 섹션을 수집하여, 직렬 부분을 잘라. 이 종양 내 인접 조직 섹션에 다른 항체 염색을 할 수 있습니다.
- 조직을 잘 준수 수 있도록 단면 후 최소 1 시간 동안 건조기에서 건조 슬라이드.
- 섹션을 포함하고 세척하는 동안 슬라이드에 머물 액체를 허용하는 슬라이드의 각 끝에 (소수성 마커) 소수성 장벽을 만듭니다. 0.1 % 트리톤 X와 인산염 완충 생리 식염수 용액으로 섹션 (PBS 0.1 % 송신)를 커버하고 부드럽게 조직을 Permeabilize 하시려면하는 수평 진탕 기에서 5 분 동안 흔들어. 두 번 반복합니다.
- 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 비특이적 (차 항체가 발생시킨 동물로부터 혈청) 10 % 정상 염소 혈청의 용액으로 결합 차단
- PBS에 0.1 %를 2 % 정상 염소 혈청에서 일차 항체 솔루션을 준비Tx 및이 섹션을 통해 솔루션을 피펫. 어둠 속에서 덮여 습기 챔버에서 슬라이드를 놓고 실온에서 하룻밤 유지.
- 다음날, PBS 0.1 % Tx는 5 분 동안 절을 세 번 씻어 1 시간 동안 2 % 정상 염소 혈청 PBS 0.1 % 송신에 희석 형광 이차 항체에 품어.
- 형광을 유지합니다 설치 매체를 기반으로 물로 세척 한 번 더 맑은 물과 커버 슬립에, 2 분 동안 핵 얼룩 (예를 들어, DAPI)와 Counterstain과 PBS 0.1 % Tx는 5 분 동안 절을 세 번 씻으십시오. 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 그들을 이미징을위한 준비가 될 때까지, 어둠 속에서, 최소 24 시간 동안 치료 할 수 있습니다. 4 ° C에서 후 보관하십시오.
특정 유전자 개조와 차 종양 세포주의 5 세대.
- 뷰티 종양 베어링 마우스 잠자는에서 세포 라인을 생성하려면 확인 큰 종양 (생물 발광 (10) 7 -10 8 광자 / S / cm와 마우스를 선택2 / SR).
- (4 절에 설명 된대로) 두개골에서 뇌를 해부 신중하게, 이소 플루 란 마취의 과다 복용으로 마우스를 안락사 동물의 목을 벨합니다. 깨끗한 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다.
- 면도날을 사용하여, 종양 관상 컷 전후방을 만든다. 종양의 위치로 인해 뇌의 투명성 통상 인식 할 수있다.
- 미세 집게로 직경 종양, 보통 5-7mm를 해부 300 μl의 신경 줄기 세포 미디어 가득 1.5 ML 튜브에 배치 (NSC 미디어는 : B-27 보충, N2 보충 및 Normocin와 DMEM / F12, 보충 20 NG의 농도로 인간 재조합 EGF와 bFGF를 / ㎖ 각).
- 부드럽게 튜브의 벽에 맞는 플라스틱 유봉과 종양을 균질화.
- 효소가없는 조직 해리 용액 1 ㎖를 첨가하고, 5 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
- , 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액에 합격하여 10 mL로 여과기를 세척NSC 미디어, 4 분, 캔트 상층 액과 300 XG에 원심 분리기 NSC 매체의 7 ml의에 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 95 % 공기 및 5 % CO 2의 조직 배양 인큐베이터와 함께 분위기에서 37 ° C에서 배양 용 T25 플라스크 배양 접시 상. 삼일 후 일부 세포는 일부는 배양 접시의 바닥에 부착, 사망, 일부는 자유롭게 미디어에 떠 형성 neurosphere를합니다.
- T75 조직 배양 플라스크에이 일시 중단 된 세포와 다시 플레이트를 제거합니다.
- 문화의 또 다른 삼일 후, neurosphere를 수집, 단계 5.6에 설명 된대로 셀 스트레이너를 통해 긴장을 해리와 세포를 계산합니다. T75 플라스크 FGF와 EGF에 대한 보충 NSC 14 ㎖ 중의 백만 세포의 밀도로 소 태아 혈청, 10 % DMSO에서 세포와 세포의 통과 분취 액을 동결. 성장률은 종양을 생성하기 위해 사용될 종양 유전자에 의존 할 것이다. 과증식을 방지하고 비교적 높은 밀도로 세포를 유지하는 세포 배양 조건을 적응.
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Representative Results
SB 유도 된 아교 모세포종의 histo 병리학 적 특징을 특성화하기 위해, C57 / BL6 신생아 생쥐 플라스미드 종양 DNA, 즉, NRAS (PT / CAGGS와 트랜스포존을 코딩과 조합 코드하는 플라스미드 루시페라아제 (PT2 / SB100x 뤽)와 P1으로 주입하면서 -NRASV12)와 SV40 LG 텔레콤 (PT / CMVSV40-LGT) (도 3c) 또는 PDGFβ 짧은 머리 핀의 자형으로 p53의와 NRAS (그림 3D와 함께 GFP 기자 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) 암호화하는 플라스미드). 동물 분사 (그림 2a) 다음날 생물 발광을 모니터링하고 주기적으로이 안락사 때 죽어가는 단계에 도달 할 때까지했다. 빈사 단계는 동물이 증상을 보여주는 장애인 이동성, 웅크 리고 자세, 정치 못한 모피와 체중 감량이되는 임상 단계로 정의된다. 때때로, 동물 원과 갑작스러운 점프에서 산책처럼, 발작 또는 운동의 비정상적인 패턴을 개발한다. 실험 동물의 끝에의 마취 하였다. 뇌는, 관류 파라핀, 및 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 위해 처리 하였다. 뇌 실질에 출혈 (그림 3C), 의사 pallisading 괴사 (그림 3E) 및 혈관 주위 및 확산 침공 인간의 GBM (WHO 4 등급)의 특징을 표시하는 데이터 쇼 종양 (그림 3g, F). pseudopallisades의 형성은 단핵 세포의 대규모 침투 (그림 3H)와 출혈의 지역에서 발생 새는 내피 세포 (그림 3I)와 큰 glomeruloid 혈관의 파열로 시작된다. 비정형 유사 분열 (그림 3J)과 거대한 다핵 종양 세포 (그림 3K)도 인간의 GBM의 pathognomonic 있습니다.
플라스미드가 주입 된 경우에는 교 아세포종, 생물 발광과 종양 성장의 진행에 걸쳐 모니터링 될 수 슬리핑 뷰티 트랜스 시스템을 사용하여 생성 된인코딩 루시퍼. 실험 예는도 4a에 도시된다. 발광가 / S / cm 2 / SR 10 7 -10 9 광자의 강도에 도달 할 때 동물은 일반적으로 종양 부담 굴복. 도 4b에 제시된 생존 곡선에 도시 된 바와 같이 동물의 생존 기간의 중앙값은 신생아의 뇌에 주입 종양 트랜스포존의 조합에 예측 의존한다. shp53의 NRAS 및 PDGF 유발 GBM과 동물의 중앙 생존 기간은 62.5 일 shp53 및 NRAS 팔십삼일를 주입 한 동물 반면, 가장 공격적인 종양 NRAS 및 SV40 LG 텔레콤 항원 (30 일 평균 생존)로 유도합니다.
새로이 형성된 종양이 신경 교세포 종양의 특성 분자의 발현에 의해 면역 histochemically 특징으로 할 수있다. (5)는 초기 종양 (22 dpi로, 생물 발광 2 × 5 광자 / S / cm 2 / SR)를 보여줍니다, shp53로 유도및 NRAS. 주입 shp53 플라스미드는 형질 감염된 세포의 식별 및 그들의 자손 (PT2 / shp53 / GFP)을 할 수 있도록 녹색 형광 단백질 (GFP)을위한 인코딩합니다. GFP + 종양 세포는 신경 줄기 세포 마커 네 스틴 또한 신경교 원 섬유 성 산성 단백질을 발현 일부 GFP + 세포 (GFAP)을 표현한다. (6)가 56 dpi로, 또한 shp53 / GFP 및 NRAS 유발 된 종양에 빈사 동물에서 종양을 도시한다. 수많은 GFAP + 성상 세포는 종양을 둘러싼 있습니다. GFP + 종양 세포는 GFAP를 스틴을 표현하지만.
GBMs을 유도하기 위해이 기술을 사용하여 큰 장점 주입 트랜스포존에 의해 유전 적 변화를 가진 신규 한 GBM 세포주를 생성하는 능력이다. 또한, 사용자 정의 세포주로 특정 유전 형질 전환 동물을 사용하여 생성 될 수있다. 이들 세포주는 생화학 세이를 이용하여 많은 기전 질문을하는 수단이있다. 그들은 이상적으로 새로운 채널과 세포 독성 연구에 적합emotherapeutic 에이전트. 그림 7은 주입 된 플라스미드 중 하나에 인코딩 GFP의 발현을 보여주는 shp53, PDGF 및 NRAS, 유발 잠자는 숲속의 미녀 종양에서 neurosphere을 보여줍니다. 이러한 일차 세포의 GBM 이질적인 성질을 나타내는, 그 표현은 모든 셀에서 동일 강렬한 아닙니다.
그림 1 : () 호스트 염색체 DNA에 트랜스포존을 통합 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스가 사용하는 기증자 트랜스포존 플라스미드 반전 반복 / 직접 반복에 의해 형벌 관심의 유전자 묘사된다 "잘라 내기 및 붙여 넣기"메커니즘을 설명하는 도식 표현. (IR / DR, 빨간색 화살표 상자) 시퀀스를. SB의 트랜스 (녹색) 트랜스포존을 소비세, IR / DR에 결합 숙주 염색체 DNA에 랜덤 TA 뉴클레오티드 염기쌍을 사이에 재 통합. 클로닝의 (b) 예를SB 벡터 (PKT-IRES-Katushka)의 중추로 관심의 유전자 (mPDGFβ). SB 벡터는 두 개의 IR / DR 반복 서열 (적색)과 프로모터 및 인핸서 서열, 다중 복제 사이트 (MCS, 파란색)를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함, 내부 리보솜 항목 사이트 (IRES), 형광 기자 마커 (Katushka를 : 노란색), 및 polyadenilation 사이트 (폴리 -A). 관심의 종양 유전자 (mPDGFβ 주황색)는 클로닝 벡터 pGEMT에 포함되어 있습니다. 특정 제한 사이트 (을 NcoI / SacI로)에 의해 측면 종양 유전자는 둔화 효소에 의해 소화 효소에 의해 발표 및 둔화된다. 선형화 된 벡터뿐만 아니라 둔화된다. 마지막으로, mPDGFβ 종양 유전자가 새로운 플라스미드 트랜스포존 벡터 생성하는 무딘 엔드 연결 반응에 의해 기증자 벡터에 삽입됩니다. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka을 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.
그림 2 : 신생아 마우스의 내부 심실 주사에 대한 실험 설정 및 가이드는 () 마이크로 미터 다이얼과 고정대 (2) 자동 주사기가 10 μL 주사기 (4)를 잡고 장착되어 있습니다. U 프레임 안에, 신생아 어댑터 프레임은 단단히 고정한다 (3). 자동 주사기 (1)의 제어 패널은 주사기, 부피 유동 속도를 정확하게 선택할 수 있도록 (b) 측뇌실 내로 주사에 필요한 좌표에 삽입 된 바늘 신생 마우스 (P1)의 사진 :. 1.5 mm의 복부 및 람다 0.8 mm 측면. 상대 크기 및 심실의 위치를 강조 신생아 마우스 (P1)의 두뇌를 통해 코로나 섹션의 (C) 그림.
그림 3 : 잠자는 숲속의 미녀 transposon의 시스템으로 유도 된 종양은 NRAS, SV40 LGT를 암호화하는 플라스미드와 뇌 실내 주입 후 신생아 강아지 24 시간의 인간 GBM () 생물 발광 이미지의 조직 학적 특징을 보여 성인 동물의 (b)는 생물 발광 영상 (. 50 shp53의 NRAS 및 PDGF 유발 큰 종양 dpi)로. (C) Hematoxilin과 NRAS와 LG 텔레콤 (28 dpi)로 유발 종양 죽어가는 쥐의 뇌에서 관상 섹션의 에오신 염색. (D) 코로나 섹션 종양 죽어가는 쥐의 뇌에서 shp53 NRAS 및 PDGF. (E) Pseudopalisading 괴사, 새로이 생성 된 종양에서 관찰되는 인간의 GBM의 조직 학적 특징으로 유도한다. (괴사 (N)의 중심 지역에서 멀리 마이그레이션 벼랑으로 배열 된 세포에 포인트를 화살표 (F) 및드 노보 g) 생성 된 종양은 정상적인 뇌 실질에 혈관 (g) 및 확산 (f)에 따라 침략을 보여주는 매우 침습적이다. (H) 단핵 세포 (화살표), pseudopalisading 괴사의 영역의 초기 단계의 대규모 침공과 출혈의 영역입니다. (I) 새는 내피 세포 (화살표) 대형 glomeruloid 용기 NRAS로 유도 된 종양 내부에 확산 출혈의 기원에 및 SV40 -LgT. (J) 종양 세포의 비정형 유사 분열 (화살표). (K) 여러 개의 대형 핵 (화살촉)와 거대한 종양 세포.
도 4 : 담암 동물은 질병 진행의 생물 발광과 지속 시간에 걸쳐 모니터링 될 수있다. 동물의 생존 기간의 중앙값은의 조합에 의해 예측종양 DNA 주입. 7 C57 / BL6 마우스의 코호트 연구에서 생물 발광 트레이스 () 예. 생물 발광 (10) 8 광자에 도달 한 후에 마우스 1 주일 정도 푹 빠져 있습니다 / S / cm2 / SR. (b)는 다른 플라스미드 조합으로 생성 뷰티 종양 잠자는과 동물의 중앙 생존 기간을 비교 샘플 생존 곡선. NRAS 및 SV40 LGT로 유도 종양의 평균 생존 기간은 반면 shp53의 NRAS 및 PDGF 또는 shp53과 NRAS로 유도 된 종양 동물의 30 dpi의 것은 각각 62.5 dpi로 또는 83 dpi로입니다. dpi로는 : 일 주사를 게시합니다.
그림 5 : 초기 거시적 인 GBM (22 dpi)로 shp53과 NRAS와 유도는 GFP + 종양 세포 (공 초점 현미경 사진)의 네 스틴과 GFAP의 발현을 표시 패널 (a)는 GFP를 표현하는 초기 종양을 보여줍니다.. 패널 (b)는 네 스틴 식 게재 같은 필드를 나타냅니다. 패널
그림 6 : GBM GFP 종양을 둘러싼 성숙한 폐해 마커 GFAP에 대한 종양 세포의 네 스틴 표현과 풍부한 염색을 보여주는 죽어가는 동물 (56 dpi)로부터 shp53, NRAS 및 PDGF 유발 패널 (a)는 acoronal 섹션의 Nissl 얼룩을 나타냅니다. 종양 죽어가는 동물의 뇌를 통해 (강렬한 푸른 염색 Fshp53, PDGFΒ 및 NRAS를 사용하여 잠자는 숲속의 미녀 transposon의 시스템으로 유도 롬 증가 세포 수). 패널 (b)에 도시 된 패널에 하나 관상 인접한 섹션 (a) 종양 세포에서 GFP의 발현을 보여주는 핵 DAPI 염색으로 염색. 패널 (C)는 DAPI 함께 높은 핵 밀도에 의해 식별 종양에서 GFP 발현을 나타내는 종양 테두리의 공 초점 현미경 사진을 나타낸다. 패널 (D)는 종양에 인접한 셀에서 강한 GFAP 발현을 나타내는, (a)에서와 같은 시야를 도시한다. 패널 (E)는 패널의 오버레이 (C) 및 (D)를 나타낸다. 패널 (F)는 종양 세포에서 GFP 발현을 나타내는 종양 테두리의 공 초점 현미경 사진이다. 패널 (g)이 종양 세포에 네 스틴의 발현을 나타내는, (F)에서와 같은 시야를 나타낸다. 패널 (H)는 오버레이 투영 패널 (F) 및 (g)이고 
그림 7 :. neurosphere를 배양 5 일 후에 shp53, PDGF 및 NRAS로 유도 잠자는 숲속의 미녀 종양에서는 통과 2. 세포가 shp53의 PDGF 플라스미드 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β)에 인코딩 GFP를 표현된다 패널 (a)는 neurosphere의 시야 현미경 사진. 패널 (b) (a) neurosphere 세포에서 GFP의 발현을 도시와 동일한 뷰 에피 형광 현미경 사진을 나타낸다. 패널 (C)는 패널의 오버레이를 나타내는 (a) 및 (b).
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Discussion
이 글에서, 우리는 세부 사항 신생아 마우스의 뇌실 영역을 주변 세포에 종양 플라스미드 DNA의 SB의 transposase- 매개 통합을 사용하여 GBM의 새로운 모델을 생성하기위한 다양하고 재현하는 방법. 우리가 관심있는 새로운 유전자 트랜스포존 플라스미드를 생성하는 프로토콜을 제시, 살아있는 동물에서 종양의 진행을 모니터링하는 방법, 및 이들의 종양 histo 병리학 및 면역 조직 화학적 특징을 특성화하는 방법을 예시한다.
우리의 실험실로 (그림 3) 등 13 보여,이 모델은 안정적 (1) 의사 palisading 괴사, (2) 혈관 증식, (3) 핵 비정 형성, (4) 이상 유사 분열 등 인간의 GBM의 두드러진 특성을 가진 종양 (작성 5) 혈관 주위 및 확산 침공. 신생아 마우스의 사용은 최소의 장비 및 SE에서 비교적 용이 기술적 절차를 제공하는 관점에서 최적 물류 인특정 유전 적 변화와 종양의 큰 샘플 크기의 빠른 생성을 허용 / 복구 시간 재단,. 이 종양은 동물에 의한 유전 적 변화에 따라 예측 가능한 평균 생존과 종양 부담에 굴복하도록합니다. 마지막으로, SB 모델은 치료 반응 24 치료 개입 화면으로 사용되어왔다.
신생아 주사에 사용되는 솔루션을 준비 할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 요인이있다. DNA 용액은, 농축시켜 자유 내 독소 (2-7 ㎍ / μL)을 최소 부피의 주입을 허용하기 위해 멸균해야한다. DNA (N / P 비율)의 포스페이트 잔기에 폴리에틸렌 이민 (PEI)에서 질소 잔기의 최적 비율이 세포 표면에 음이온 성 잔기를 바인딩하고 endocytosed됩니다 양전하 입자 복합체의 형성을 보장 7.이다. 세포질에되면, 삼투압 유입은 입자가 폭발하고 encapsulat가 방출 될 것입니다에드 플라스미드 DNA. 생체 제트 PEI 용액 mM 중의 질소 잔기로서 표현 (150)의 농도를 갖는다. 하나의 μg의 DNA가 음이온 성 포스페이트 3 nmol의 수식으로 계산 될 수 형질 필요한 시약의 양을 주어지면 :
생체 제트 PEI = ㎕의 / 150 (μg의 DNA를 × 3)은 N / P 비율을 X].
예를 들어, 20 μg의 DNA가 필요하다, (7)의 N / P 비율 0.5 ㎍ / ㎕의 DNA 용액 40 μl를 제조 하였다. PEI 요구의 부피는 20 * 3 * 150분의 7 = 2.8 μL 될 것입니다.
최대 다섯 가지 플라스미드를 동시에 주입 할 수있다. 여기에 제공된 실험은 루시퍼 라제를 암호화하는 플라스미드 (SBLuc)에 트랜스에 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스을 제공합니다. 서두에서 언급 한 바와 같이, 트랜스 트랜스포존 분자의 비율은 최적의 전위를 보장하는 것이 중요하다. TRANSP에 SB100x 플라스미드의 최적 비율 (경험적으로 수립)oson DNA 플라스미드는 1 : 4. T1 : 한 개의 상이한 트랜스포존 플라스미드, 예를 들면 T1 및 T2, SBLuc의 비율을 사용하는 경우에 따라서, 2 : T2 1 일 것이다 (2); 또는 40 μL의 용액을 20 μg의 DNA의 총 SBLuc 4 μg의 T2는 T1의 8 μg의 8 μg의 혼합한다. T1 : T2 : T3 = 1 : 1.33 : 세가지 다른 트랜스포존 비가 SBLuc 것 플라스미드 1.33 : 1.33 넷 트랜스포존 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1이다.
이것은 감염 후 24-72 시간 생물 발광하여 플라스미드 DNA의 흡수를 확인하는 데 유용하다. 동물이 성장함에 따라 종양이 임계치 크기, 어둡게 착색 C57BL6 마우스의 경우 대략 1-2mm 세에 도달 할 때까지, 모피, 피부, 두개골과 뇌의 증가 된 광학 밀도, 종양 진행의 모니터링을 방지한다. 흰색 또는 털없는 쥐를 사용할 때 털을 면도 경우 또는 광을 더 잘 투과 이들 마우스에서 가능하다.
몇 가지 제한이 모델을 사용할 때 고려되어야한다. 먼저, 유전자주입 된 플라스미드 도입 TIC 재료는 다른 위치 및 매수에 숙주 게놈에서 무작위로 통합 될 수있다. 이 종양 세포 사이에 종양 사이에 변화가 발생할 수 있습니다. 둘째, 도입 된 DNA가 DNA 25 주로 인트론 TA 반복 시퀀스에 삽입하지만, 호스트 게놈 DNA 코딩과 간섭의 가능성이 남아있다. 셋째, 뇌 실내 주사는 인생의 3 - 4 주에 임상 적으로 볼 수 있고 증상이된다 젊은 쥐에서 뇌수종의 작지만 지속적인 속도를 일으킬 수 있습니다. 생쥐의 일부 변종은 다른 사람보다 뇌수종에 더 경향이 있습니다 (즉, C57 / BL6 FVB 이상). 뇌수종 유발의 위험을 최소화하기 위해,이 바늘 날카로운되도록 가능한 (C57 / BL6 마우스 미만 1 μL) 한 작은 부피를 주입하도록 권장 솔루션과 함께 성장 새끼를 제공하는 저염있을 두개골 봉 적시 골화를 허용하기 위하여, 음식 농후말이지. 마지막으로, 말기 종양은 종종 생 발광하여 마우스를 모니터링 할 때 고려되어야 괴사를 개발한다. 저급 판독 큰 괴사 영역과 반드시 치료의 결과로서 종양의 해상도를 가진 종양 진보를 의미 할 수있다. 궁극적으로, 조직 학적 분석은 종양의 진행을 평가하기위한 황금 표준 남아있다.
최근 종양 총 유전체의 출현 GBM에서 반복적으로 돌연변이 된 유전자의 역할 탐사의 문을 열었다. 잠자는 숲속의 미녀 모델은 잠재적 인 암 유전자 또는 종양 억제의 유효성을 검사에 최적입니다. 설립 SB 플라스미드 백본에 후보 종양 유전자의 마우스 cDNA 서열을 복제, PDGFβ 리간드와이 문서에 나와있는 예와 같이 형질 감염된 세포 내에서 구성 적 표현으로 이어질 것입니다. 종양 억제제의 역할에 대한 평가가 유효 후보 시퀀스와 SB 플라스미드 백본 내로 클로닝에 의해 수행 될 수있다 (로만 제공 RNAi의 사본 데이터베이스 26), 예를 들어, 제 2 세대의 miR 짧은 머리 핀의 강력한 표현을 만들 수 있습니다.
GBM 연구 분야에서 현재 논의는 세포 외 기원의 신원에 관한 것이다. 이는 마우스에서 최근, 신경 줄기 세포에서 하향 조절 및 p53에 의해 유도 된 종양 NF1가 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (27)로부터 발생한 것으로 밝혀졌다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 모델을 사용하여, 다른 유사한 연구는 유전자 변형 우선적 GBMs를 생성하는 줄기 세포 / 전구 세포의 집단을 다른 대상 여부를 테스트하기 위해 설계 될 수있다. 이러한 연구에서 지식은 크게 GBM의 원인에 대한 우리의 이해를 강화하고 새로운 치료 방법에 대한 길을 제공 할 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20 oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | For the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | For the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | For the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70 um | Fisher Scientific | 08-771-2 | For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution (intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
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