Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste (60%) primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, mit einer medianen Überlebenszeit von 15 bis 21 Monaten, wenn sie mit Operation, Bestrahlung und Chemotherapie 1 behandelt. Neuartige Therapien für GBM sind unerlässlich. Experimentelle Therapien erfordern Tests an Tiermodellen, die die wesentlichen Merkmale der menschlichen Krankheit angemessen zu reproduzieren. Strategien zur GBM induzieren bei Nagetieren sind chemische Mutagenese mit alkylierenden Substanzen, Keimbahn oder somatischen genetischen Veränderungen, oder Transplantation mit Gliomzelllinien 2. Die am häufigsten verwendeten Modelle verwenden die Implantation Gliomzelllinien entweder orthotopisch, in das Gehirn oder subkutan mit syngenen Zellen in Tieren, die mit identischen Genotyp; oder xenogene Zellen, am häufigsten menschlichen GBM-Zelllinien, in Immun implantiert beeinträchtigt Mäusen 3. Xenografts bieten viele Vorteile für die Untersuchung der intrakraniellen Tumoren: Bequemlichkeit der Reproduzierbarkeit, standardized Wachstumsraten, Zeit des Todes und der Tumorlokalisation. Allerdings haben diese Modelle Einschränkungen auf Grund der künstlichen, invasive chirurgische Ansatz für Implantationen und begrenzte Fähigkeit, histologische genau zu reproduzieren verwendet charakteristischen Merkmale der menschlichen GBM (WHO Grad IV): Pseudo pallisading Nekrose, Kern Atypien, diffuse Invasion, Mikrogefäßproliferations und die Bildung von glomeruloid Gefäßveränderungen 4-7. Induktion der GBM durch Verändern des Genoms von somatischen Zellen mit onkogener DNA, entweder mit viralen Vektoren 8-12 oder mit Transposon-vermittelte Integration 13 reproduziert enger die Ätiologie der Krankheit beim Menschen und rekapituliert histopathologischen Merkmale der menschlichen GBM.
Historisch gesehen, Tumoren des ZNS wurden klassifiziert, basierend auf der wahrgenommenen Ursprungszelle, die beobachtet wurde, würde ein prädiktiver Faktor für das Überleben 14 sein. GBM sind in primäre und sekundäre eingestuft. Anzeichen dafür, today weist auf die sehr heterogenen Natur der primären Glioblastomen 15. Sekundäre GBM (15%), das Ergebnis der malignen Transformation von Astrozytomen niedrig (WHO Grad I) und anaplasic Astrozytome (WHO Grad II) werden mit früheren Ausbruch der Krankheit, bessere Prognose und einem "proneurale" Muster der Genexpression assoziiert , während primäre GBM (85%) zeigen einen späten Beginn, schlechte Prognose und Gliazellen (klassisch), neuronale oder mesenchymalen Expressionsmuster. Ob diese Muster der Genexpression korrelieren mit der eigentlichen Ursprungszelle des Tumors noch intensiv erforscht. Sammeln von Daten zeigt, dass die Kombination von genetischen Mutationen, die mit GBMs zugehörige prädiktive Überleben sind. Beispielsweise werden Verlust Heterozygotie (LOH) der Chromosomen 1p / 19q, IDH1 Mutationen, PDGFRα Amplifikationen mit sekundären GBMs, proneurale Expressionsmuster und bessere Prognose assoziiert, während EGFR-Überexpression, Notch und Sonic Hedgehog-Pfad aktiviert, Nf1 und PTEN Verlust und Mutationen von p53 mit neuronalen, Klassik, oder mesenchymale primären GBM und schlechtere Prognose 16,17 korreliert. Das Aufkommen der Großsequenzierungsprojekte und die Ansammlung von zahlreichen Patientenproben zum Testen zur Verfügung bringt eine Fülle von neuen Informationen in Bezug auf genetische Mutationen und Wege in GBM Pathogenese und Progression und die Möglichkeit der individualisierten Medizin, wo Therapien gezielt auf zugeschnitten werden verwickelt die genetische Anomalien des Patienten. Letztlich, um die Aussagekraft dieser Mutationen und Wege in systematischer Weise zu bewerten und mögliche Behandlungen jeweils zu testen, benötigt Tiermodellen der GBM mit vorgegebenen genetischen Veränderungen. Transposon-vermittelte Integration genomischer DNA bietet ein gangbarer Weg.
Das Transposon Sleeping Beauty Systems, Mitglied des Tc1 / mariner Klasse von Transposons, wurde "erwacht" (gebaut) in einem mehrstufigen Verfahss von ortsspezifische Mutagenese von einer Lachs Transposasegen, die vor mehr als ruhend 10.000.000 Jahre 18,19 wurde. Im Wesentlichen DNA Transposons durch spezifische Sequenzen (inverted repeats / direkte Wiederholungen: IR / DR) flankiert kann in das Genom in einem "cut and paste" Weise durch die Aktivität des Dornröschen Transposase integriert werden. Die Transposase erkennt die Enden der IR Sites, schneidet das Transposon und integriert sie zufällig in einem anderen DNA-Region zwischen den Basen T und A, Basen, die an jedem Ende des Transposons während der Umsetzung (Abbildung 1a) dupliziert werden. Dornröschen Transposase wird aus drei Domänen, ein Transposon-bindende Domäne, eine Kernlokalisationssequenz und eine katalytische Domäne umfasst. Vier Transposase Moleküle sind erforderlich, um die beiden Enden des Transposons zusammen zu bringen und lassen für die Umsetzung ist jedoch, wenn zu viele Moleküle des Transposase vorhanden sind, sie dimerisieren können und tetramerize zu hemmendie Umsetzung Reaktions 20. Eine effiziente Transpositionsreaktion benötigt eine optimale Verhältnis von Transposase Transposons. Die DNA, die Transposase kodiert, kann auf demselben Plasmid mit dem Transposon (in cis) oder auf einem anderen Plasmid (in trans) geliefert werden. Um das optimale Verhältnis zwischen der Transposase und Transposons zu gewährleisten, kann ein Promotor mit ausreichender Aktivität für die Expression der Transposase (für die "cis" Modell) oder das Verhältnis der Plasmide in der Injektionslösung kann optimiert werden, gewählt werden (für den "trans" Modell). Das Transposon Sleeping Beauty Systems erfolgreich der funktionellen Genomik, Insertionsmutagenese, Transgenese und somatische Gentherapie 21 verwendet werden. Als synthetisches Konstrukt zu einem funktionellen Molekül aus einem ruhenden Lachs Variante überarbeitet, wird die Dornröschen Transposase nicht auf andere Transposons in Menschen oder anderen Säugetieren 20 zu binden. Seit seiner Entdeckung hat Molekulartechnik enhanced die Umsetzung Wirksamkeit des SB Transposonsystem durch Veränderungen in der IR-Sequenzen und die Zugabe von TATA Dinukleotide flankierenden Transposon, was zu den pT2 Transposons. Diese Transposons haben an den IR-Website Bindung des SB optimiert und erhöht die Wirksamkeit der Exzision. Die SB Transposase unterzog auch signifikante Verbesserung; die Transposase in Experimenten hierin dargestellt verwendet wird, ist die SB100X, ein hyperaktives Transposase von einer DNA shuffling Strategie gefolgt von einer großen genetischen Screen in Säugetierzellen 22 erzeugt.
In diesem Bericht zeigen wir eine schnelle, flexible und reproduzierbares Verfahren zur intrinsischen GBM in Mäusen, die mit nicht-viralen, Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in Zellen der Unter ventrikulären Zone des neugeborenen Mäusen 23 induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine einfache Möglichkeit, Transposons mit neuer Gene zugänglich für genomische Integration mit dem Dornröschen Transposase zu schaffen und zeigen, wie man das Plasmid Aufnahme zu überwachen undFortschreiten der Krankheit mit Biolumineszenz. Wir charakterisieren auch histologischen und immunhistochemischen Eigenschaften der GBM mit diesem Modell wiedergegeben. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen eine schnelle Methode, um primäre GBM Zelllinien aus diesen Tumoren zu erzeugen. Dornröschen Modell, bei denen Tumore aus Zellen Original dem Tier induziert werden, erlaubt das funktionale Bewertung der Rolle von Kandidaten GBM Gene bei der Induktion und Progression von Tumoren. Dieses System ist auch für das Testen von neuen GBM Behandlungen, einschließlich Immuntherapien in immunkompetenten Mäusen geeignet, ohne die Notwendigkeit invasiver entzündlichen chirurgischer Prozeduren, die die lokale Mikroumgebung verändern können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel werden wir ausführlich ein vielseitiges und reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung von neuen Modellen der GBM mit SB transposase- vermittelte Integration onkogenen Plasmid-DNA in die Zellen umgebenden Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen. Wir stellen ein Protokoll zur Transposon-Plasmiden mit neuen Genen von Interesse zu erzeugen, zu veranschaulichen, wie das Fortschreiten von Tumoren in lebenden Tieren zu überwachen und, wie histopathologischen und immunhistochemischen Eigenschaften dieser …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
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