Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma'nın Roman modelleri oluşturmak için
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
Cerrahi, radyasyon tedavisi, kemoterapi ve 1 ile tedavi edildiklerinde glioblastoma multiforme (GBM) 15-21 aylık bir medyan sağkalım, erişkinlerde en sık (% 60) primer beyin tümörü olduğunu. GBM için yeni tedaviler zorunludur. Deneysel tedaviler yeterince insan hastalığının belirgin özelliklerini yeniden hayvan modellerinde test gerektirir. Kemirgenler glioma hücre hatları 2 kullanılarak kimyasal alkilleyici ajanlarla mutagenezini, mikrop hattı veya somatik genetik değişiklikler, ya nakli dahil Stratejiler GBM ikna etmek. En yaygın olarak kullanılan model, beyin içine veya deri altına aynı genotipe sahip hayvanlarda singeneik hücreleri kullanılarak, ya da ortotopikal, glioma hücre hatlarının implantasyonu kullanır; veya ksenojenik hücreler, bağışıklık implante en yaygın insan GBM hücre çizgileri, fare 3 ele geçirildi. Ksenogratflardır intrakranial tümörlerin çalışma için birçok avantaj sunuyoruz: tekrarlanabilirlik kolaylık, Standardized büyüme oranları, ölüm ve tümör lokalizasyonu zamanı. Sözde pallisading nekroz, nükleer atypias, yaygın işgali, mikro-vasküler proliferasyon: implantasyonu ve doğru histolojik yeniden sınırlı yeteneği için kullanılan yapay, invaziv cerrahi yaklaşım insan GBM (WHO Evre IV) karakteristik özellikleri nedeniyle Ancak, bu modeller sınırlamaları var ve glomerüloid vasküler oluşumu 4-7 anormallikler. Onkojenik DNA ile, ya viral vektörlerin 8-12 veya transpozon-aracılı entegrasyon 13 ile somatik hücre genomu değiştirerek GBM İndüksiyon, daha yakından insan hastalığı etyolojisi üretir ve insan GBM histopatolojik özellikleri tartışıldı.
Tarihsel, MSS tümörleri sınıflandırılmış gözlendi kökenli algılanan hücreye dayalı olan, hayatta kalma 14 açısından belirleyici bir faktör olacaktır. GBMs birincil ve ikincil olarak sınıflandırılır. Gelişen kanıtlar today birincil glioblastoma 15 derece heterojen doğasına işaret. İkincil GBM (% 15), düşük dereceli astrositom (WHO grade I) ve anaplasic astrositomların malign transformasyon sonucu (WHO grade II), hastalığın erken başlaması, daha iyi prognoz ve gen ifadesinin bir "proneural" modeli ile ilişkili olan primer GBM (% 85) ise geç başlangıçlı, kötü prognoz ve glial (klasik), sinirsel ya da mezenkimal ifade kalıplarını göstermektedir. Gen ifadesinin bu kalıplar tümörün köken gerçek hücre ile ilişkili olsun hala aktif araştırılmaktadır. Veri Biriken GBM'lerde ile ilişkili genetik mutasyonlar kombinasyonu yaşam için öngörü olduğunu göstermektedir. Örneğin, kromozom 1p / 19q, IDH1 mutasyonları, PDGFRα amplifikasyonlar, bir heterozygocity kaybı (LOH) EGFR ekspresyonu, Notch ve Sonic kirpi yolu aktivasyonu, Nf ise, ikincil GBM'lerde, proneural ifade desen ve daha iyi prognoz ile ilişkili1 ve PTEN kaybı ve p53 mutasyonları nöral, klasik, ya da mezenkimal birincil GBM ve kötü prognoz 16,17 ile ilişkilidir. Büyük ölçekli projelerin sıralama gelişi ve test için kullanılabilir sayısız hasta örneklerinin birikimi GBM patogenezinde ve ilerlemesinde ve tedaviler özellikle uygun olabilir bireyselleştirilmiş tıp, olasılığı karıştığı genetik mutasyonlar ve yollar ile ilgili yeni bilgi hazinesi getiriyor Hastanın genetik anormallikler. Sonuçta, sistematik bir şekilde bu mutasyonların ve yolların öngörü değerini değerlendirmek için, ve her durumda olası tedaviler test etmek için, önceden belirlenmiş genetik değişikliklerle GBM hayvan modelleri gerektirmektedir. Genomik DNA transpozon aracılı entegrasyon uygun bir yaklaşım sunmaktadır.
Sleeping Beauty transpozon sistemi, transposonların Tc1 / denizci sınıfının üyesi, bir çok adım prosedürü içinde (inşa) "uyanmış" olduatıl fazla 10 milyon yıl önce 18,19 oldu bir salmonoid transposaz geni, site özel mutajenez ss. Özünde, belirli dizileri (ters tekrarlar / doğrudan tekrarlar: IR / DR) tarafından çevrili DNA transposonlar Sleeping Beauty transpozazın faaliyet vasıtasıyla "kes ve yapıştır" şekilde genomuna entegre edilebilir. transposaz, IR siteleri uçlarını tanır transpozonun excises ve bazlar, T ve A, transpozisyon (Şekil 1a) sırasında transpozonun her sonunda çoğaltılır bazlar arasında başka bir DNA siteye rastgele bütünleştirir. Uyku Güzellik transposaz üç alanda, bir transpozon bağlama alanı, bir nükleer lokalizasyon dizisi ve katalitik bir etki oluşturmaktadır. Dört transposaz moleküllerin bir araya transpozonun iki ucunu getirmek ve aktarılması için izin transpozazın çok molekülleri mevcut olan, ancak, bunlar dimerize ve önlenmesi için tetramerize gerekmektedirtranspozisyon reaksiyonu 20. Verimli bir transpozisyon reaksiyon transposonların için transpozazın optimal oranı gerektirir. Transposaz kodlayan DNA (cis olarak) transposon aynı plazmid veya (trans) farklı bir plazmid üzerinde temin edilebilir. Transpozaz ve transpozonlar arasında optimal oranı sağlamak için, yeterli bir etkinliğe sahip bir promotörü (("cis" modeli için) transpozazın ifadesi ya da optimize edilebilir, enjeksiyon çözeltisi içinde plasmidlerin oranı seçilebilir "Trans" modeli). Sleeping Beauty Transpozon sistemi fonksiyonel genomik ekleme mütajenezi, transgenesis ve somatik gen terapisi 21 başarıyla kullanılabilir. Sentetik yapı, bir atıl salmonoid varyantı fonksiyonel molekül için yeniden tasarlanmış olan uyku güzellik transposaz, insanlarda ve diğer memelilerde 20 diğer transpozonlar bağlanmaz. Keşfedilmesinden bu yana, moleküler mühendislik donanımlrn vardıred IR dizileri ve TATA dinükleotidleri, transpozonun yan pT2 transposonların sonuçlanan eklenmesiyle değişiklikler yoluyla SB transpozonu sisteminin aktarılması etkinliği. Bu transposonlar IR sitesine SB bağlama optimize edilmiş ve eksizyon etkinliğini artırmıştır. SB transposaz da önemli bir gelişme göstermiştir; Burada sunulan Deneylerde kullanılan transposaz SB100X, memeli hücrelerinde 22 büyük çaplı bir genetik ekranından sonra bir DNA karıştırma stratejisi tarafından üretilen bir hiperaktif transposaz olup.
Bu yazıda yenidoğan farelerin 23 alt-ventriküler bölgenin hücrelerine plazmid DNA viral olmayan, transpozon-aracılı entegrasyonu ile farelerde iç GBM ikna etmek için hızlı, çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Biz Sleeping Beauty transposase kullanarak genomik entegrasyon için mükellef yeni genlerle transpozonlar oluşturmak ve plazmid alımını izlemek için nasıl göstermek için basit bir yol sunmak veışıldaması kullanarak hastalığın ilerlemesi. Biz de bu model ile yeniden GBM histolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize. Buna ek olarak, bu tümörler birincil GBM hücre hatları oluşturmak için hızlı bir yöntem sunulmaktadır. Tümörler hayvan orijinal hücrelerden kaynaklı olduğu Sleeping Beauty modeli, indüksiyon ve tümörlerin gelişiminde aday GBM genlerin rolü fonksiyonel değerlendirilmesini sağlar. Bu sistem, aynı zamanda, yerel mikro-değiştirebilir invaziv enflamatuar cerrahi prosedürlerin gerek olmaksızın, bağışıklık-kompetan farelerde bağışıklık terapisi de dahil olmak üzere, yeni GBM tedaviler, test edilmesi için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, biz detay yenidoğan farelerin subventriküler bölgesini çevreleyen hücrelerin içine onkojenik plazmid DNA SB transposase- aracılı entegrasyon kullanarak GBM yeni modeller üretmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem. Biz yeni ilgi genleri ile Transposon plasmidlerini oluşturmak için bir protokol mevcut, canlı hayvanlarda tümörlerin ilerlemesini izlemek için nasıl, bu tümörlerin histopatolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize nasıl göstermektedir.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
