Транспозонный зависимой интеграции плазмидной ДНК в субвентрикулярной зоне новорожденных мышей для генерации Novel Модели глиобластомы

Introduction

Глиобластомой мозга (GBM) является наиболее распространенным (60%) первичная опухоль головного мозга у взрослых, с медианой выживаемости 15-21 месяцев при лечении хирургии, лучевой терапии, и химиотерапии ^1. Новые методы лечения глиобластомы являются обязательными. Экспериментальные методы лечения требуют проведения испытаний на животных моделях, которые хорошо воспроизводят характерные черты человеческих болезней. Стратегии вызвать GBM у грызунов включают химический мутагенез с алкилирующих агентов, зародышевой линии или соматические генетические изменения, или трансплантации с использованием глиомы клеточные линии ^2. Наиболее часто используемые модели используют имплантацию глиомы клеточных линий, либо ортотопически, в мозг или подкожно с помощью сингенные клетки у животных с одинаковым генотипом; или ксеногенных клеток, клеточные линии, наиболее часто человека GBM, имплантированные в иммунной угрозу мышей ^3. Ксенотрансплантаты предлагают много преимуществ для изучения внутричерепных опухолей: удобство воспроизводимости, Standardized темпы роста, время локализации смерти и опухоли. Тем не менее, эти модели имеют ограничения из-за искусственного инвазивного хирургического подхода, используемого для имплантации и ограниченной способностью точно воспроизводить гистологические признаки, характерные для человека GBM (степень IV ВОЗ): некрозу псевдо-pallisading, ядерных atypias, диффузный вторжения, микро-сосудистой пролиферации и формирование glomeruloid сосудистые аномалии ^4-7. Индукция GBM путем изменения генома соматических клеток с онкогенными ДНК, либо с вирусными векторами ^8-12, или с транспозонов-опосредованной интеграции ^13, воспроизводит более тесно этиологии болезней человека и повторяет гисто-патологических особенностей человека GBM.

Исторически сложилось так, опухоли ЦНС были классифицированы на основании предполагаемой клетки происхождения, которые было замечено, будет прогностическим фактором для выживания ^14. GBMs делятся на первичные и вторичные. Новые данные Todай указывает на весьма неоднородный характер первичного глиобластомы ^15. Среднее GBM (15%), результат злокачественной трансформации астроцитом низкосортных (уровень I ВОЗ) и anaplasic астроцитом (ВОЗ класс II), которые связаны с более ранним началом заболевания, лучше прогноза и "пронейрального" образец экспрессии генов , в то время как первичной GBM (85%) Показать на позднее начало, плохой прогноз и глиальных (классическая), нервов или мезенхимальные паттерны экспрессии. Будут ли эти образцы экспрессии генов коррелирует с фактической клетки происхождения опухоли все еще активно исследовали. Накопление данных показывает, что сочетание генетических мутаций, связанных с GBMs являются прогностическими выживания. Например, потеря гетерозиготности (LOH) хромосом 1р / 19q, IDH1 мутаций, PDGFRα Амплификации, связаны с вторичными GBMs, пронейрального паттерна экспрессии и улучшению прогноза, в то время как EGFR гиперэкспрессия, Notch и Соник активации еж путь, NF1 и PTEN потери и мутации р53 коррелируют с помощью нейронной, классический, или мезенхимальных первичных GBM и худшим прогнозом ^16,17. Появление крупных секвенирования проектов и накопление многочисленных образцов пациентов, доступных для тестирования приносит богатство новой информации по отношению к генетическим мутациям и путей, вовлеченных в патогенез и прогрессирование GBM и возможности индивидуализированного медицине, где методы лечения могут быть специально созданы для генетические аномалии пациента. В конечном счете, оценить прогностическое значение этих мутаций и путей в систематическом порядке, а также проверить возможные процедуры в каждом конкретном случае, требуется животных моделей GBM с заранее заданными генетическими изменениями. Транспозонный зависимой интеграции геномной ДНК предлагает возможный подход.

Спящая красавица транспозонов система, член Tc1 / моряка класса транспозонов, была "проснулся" (построен) в многоступенчатой ​​процесс сайта направленного мутагенеза с лососевые гена транспозазы, который стал бездействующим более 10 миллионов лет назад ^18,19. В сущности, ДНК-транспозонов фланкированы специфических последовательностей (инвертированных повторов / прямых повторов: IR / DR) могут быть интегрированы в геном в "вырезать и вставить" способом посредством деятельности Спящая красавица транспозазы. Транспозаза признает концы ИК-сайтов, вырезает транспозон и интегрирует его случайно в другом месте ДНК между основаниями Т и А, основы которых дублируется на каждом конце транспозона при транспозиции (фиг.1а). Спящая красавица транспозаза состоит из трех доменов, транспозонов связывающий домен, последовательности ядерной локализации и каталитический домен. Четыре молекулы транспозаза должны привести два конца транспозона совместно и позволяют транспозиции, тем не менее, если слишком много молекул транспозазы присутствуют, то они могут димеризации и tetramerize ингибироватьперестановка реакция ^20. Эффективно реагировать перестановки требуется оптимальное соотношение транспозазы к транспозонов. ДНК, кодирующая транспозазу могут быть доставлены на той же плазмиде с транспозона (в СНГ) или на другом плазмиды (в транс). Чтобы обеспечить оптимальное соотношение между транспозазы и транспозонов, промотор с адекватной активностью могут быть выбраны для экспрессии транспозазы (для модели "цис") или соотношение плазмид в растворе для инъекций могут быть оптимизированы (по "транс" модель). Системы сна транспозонов Красота может быть успешно использован для функциональной геномики, инсерционного мутагенеза, трансгенеза и соматической генной терапии ^21. Будучи синтетическим конструкция модернизирована для функциональной молекулы из покоя, лососевые вариант, Спящая красавица транспозаза не связываться с другими транспозонов у человека и других млекопитающих ^20. С момента своего открытия, молекулярной инженерии имеет Enhancред перестановка эффективность системы транспозонов СО путем внесения изменений в ИК последовательностей и добавления TATA динуклеотиды фланговые транспозон, в результате чего транспозонов рТ2. Эти транспозонов оптимизировали связывание СО с ИК-сайте и повышение эффективности удаления. SB транспозаза также претерпела значительные улучшения; транспозаза используется в экспериментах, представленных в настоящем документе, SB100X, гиперактивный транспозаза порождается стратегии перетасовки ДНК с последующим генетическом скрининге крупной в клетках млекопитающих ^22.

В этом докладе мы представляем быстрый, универсальный и воспроизводимый метод, чтобы вызвать внутреннюю GBM у мышей с невирусной, транспозонов-опосредованной интеграции плазмидной ДНК в клетках суб-желудочковой зоны новорожденных мышей ^23. Мы приведем простой способ создания транспозонов с новых генов поддаются для геномной интеграции с помощью Спящая красавица транспозазу и продемонстрировать, как мониторинг востребованности плазмиды ипрогрессирование заболевания с помощью биолюминесценции. Мы также характеризуют гистологические и иммуно-гистохимических особенностей GBM воспроизводится с этой моделью. Кроме того, мы представляем быстрый способ получения первичных GBM клеточных линий из этих опухолей. Спящий модель красоты, в котором опухоли из клеток индуцируется оригинальных животного, позволяет функциональную оценку роли кандидатов GBM генов в индукции и прогрессии опухолей. Эта система также хорошо подходит для тестирования новых обработок GBM, в том числе иммунной терапии в иммунокомпетентных мышах, без необходимости инвазивных хирургических процедур воспалительных, которые нарушают локальную микросреду.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы животных были одобрены Мичиганского университета Комитет по использованию и уходу за животными (UCUCA).

1. Клонирование интерес последовательности в новую Спящая красавица транспозонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для вставки генов или ингибирующие элементы (как shRNA), используя Спящая систему транспозазу красоты, клонировать последовательность интерес в остов ПКТ или pT2 плазмиды. Направьте клонирование таким образом, что регуляторные элементы, интерес ген и маркеры остаются в окружении обращенных повторов (IR / DR). Пример клонирования PDGFβ в ПКТ позвоночника подробно ниже (см также рис 1б).

1. Дайджест 5 мкг плазмидной векторной ПКТ-IRES-Katushka в течение 4 часов при 37 ° С с 5-10 единиц XbaI / XhoI ферментами рестрикции в 50 мкл реакционного объема.
2. Дайджест в mPDGFβ кДНК 5 мкг плазмиды pGEM-T-mPDGFβ в течение 4 часов при 37 ° С с 5-10 блоках NcoI / SacI ферментами рестрикции.
3. Осадок тотальной ДНК добавлением 2,5 объемов 100% этанола, и 1/10 объема 3 М Na-ацетата, рН 5,8, и инкубируют в течение ночи при -20 ° С.
4. Центрифуга образцов при 13800 мкг в течение 15 мин.
5. Промыть гранулу ДНК с 500 мкл 70% -ного этанола, центрифуге при 13800 х г в течение 1 мин, повтор раз и повторно приостанавливать в 19 мкл стерильной ДНКазы свободной воды.
6. Следуйте инструкциям производителя в быстрых притупление Kit притупить концы обоих вектора (ПКТ-IRES-Katushka) и вставить (mPDGFβ).
7. Загрузите притупляются вектор и вставьте на 1,2% этидийбромидом цветного агарозном геле и запустить на 80 V в течение 40 мин. Визуализация полос, вырезать их чистой бритвы лезвия и геля очистить ДНК с использованием набора для очистки гель в соответствии с протоколом производителя.
8. Перевязывать вставки и векторной ДНК очищают на стадии 1.7, добавляя их в трубку при 4: молярном соотношении 1 (вставка: вектор). В эту трубку, сipette 1 мкл Т4-лигазы и 2 мкл Т4-лигазы буфера (содержащего АТФ) и отрегулируйте громкость до 20 мкл стерильной водой. Инкубируйте реакции лигирования в течение 18 часов при 16 ° С.
9. Преобразование химически компетентных бактериальных клеток DH5 & alpha; с лигировали продуктов.
   1. Оттепель компетентные клетки на льду.
   2. Добавить весь объем реакции лигирования с 50 мкл компетентных клеток, слегка встряхнуть трубку и инкубировать смесь на льду в течение 30 мин. Теплового шока бактерий в течение 45 сек при 42 ° С и возврата непосредственно в лед; инкубировать на льду в течение еще 2 мин.
   3. Добавить 950 мкл бульона Луриа к культуре и инкубировали при встряхивании при 37 ° С в течение 1 часа. Центрифуга бактерии при 2400 мкг в течение 3 минут и повторно приостанавливать осадок в 200 мкл ЛБ
   4. Распространение трансформированных бактерий на чашке Петри с покрытием LB-агарозы и соответствующего антибиотика. Инкубируют планшет в течение ночи при 37 ° С.
   5. Наконец, собирать 5-10 bacteриальными колонии и культуры в течение ночи при 37 ° С в 5 мл LB среды с антибиотиком.
   6. Очищают плазмиду ДНК с использованием мини-набора плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполнение диагностики ограничение переварить чтобы проверить правильность включения вставки в вектор и представить положительные клоны для секвенирования ДНК, чтобы гарантировать правильную ориентацию вставки.
10. Выберите правильные колоний и расширения производства ДНК с использованием высококачественной, эндотоксинов подготовка комплекта плазмиды.
11. Элюции ДНК в стерильной воде или 1 мМ Трис-HCl. Магазин ДНК при температуре -20 ° С до готовности вводят в новорожденных.

2. Intra-желудочковая новорожденных Инъекции

1. Три-четыре недели до эксперимента, настроить мышь размножения клетку с одной мужских и один женский мыши и пластиковой цветной иглу. Это обеспечивает среде, обогащенной и помогает процессу спаривания.
2. Когда беременность подтверждается, удалите мэль в новом клетке. Восемнадцать дней после спаривания, контролировать клетку ежедневно для поставки. Выполните интравентрикулярную инъекции в послеродовом 1 день (P1).
3. Приготовление раствора для инъекций
   Примечание: раствор для инъекций производится путем смешивания плазмидной ДНК с реагента для трансфекции, чтобы создать частицы для трансфекции. Ниже приведен пример по подготовке раствора для инъекции с использованием плазмиды, кодирующие Спящая красавица транспозазу и люциферазу: pT2 / SB100x-Люк и две транспозона плазмиды: Т / CAGGS-NRASV12 и Pt / CMV-SV40-LGT, в соотношении 1: 2: 2. Все плазмиды имеют концентрации 2 мкг / мкл. Важные сведения о подготовке раствора для инъекций представлены в обсуждении.
   1. Приготовьте раствор ДНК путем добавления: 4 мкг (2 мкл) pT2 / SB100x-Luc, 8 мкг (4 мкл) СТ / CAGGS-NRASV12 и 8 мкг (4 мкл) Pt / CMV-SV40-LGT и 10 мкл 10% глюкозы до конечного объема 20 мкл при концентрации 1 мкг / млДНК и 5% глюкозы.
   2. Подготовка раствора PEI добавлением 2,8 мкл в естественных реактивных PEI, 7,2 мкл стерильной воды и 10 мкл 10% глюкозы до конечной концентрации 5% глюкозы.
   3. Добавить раствор PEI к раствору ДНК, перемешать и вихрь и оставьте при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин. Раствор готов к инъекции. Через один час при комнатной температуре, раствор держать на льду.
   4. Установите 10 мкл чистый шприц, оснащенный 30 калибра иглы для подкожных инъекций с 12,5 ° скос в микронасосу (рис 2 # 1).
4. Для проверки правильности функционирования системы впрыска, используйте автоматические шприцевые (рис 2 # 1) отозвать 10 мкл воды в шприц, а затем очистить шприц полностью
5. Охлаждают новорожденных стереотаксической стадии (фиг.2 # 3) с суспензией сухого льда и спирта до температуры 2-8 ° С.
6. Анестезии путем размещения щенков на льдув течение 2 мин. Анестезия будет продолжаться на охлажденной стереотаксической рамы на оставшуюся часть процедуры. Поддержание температуры выше точки замерзания рамы, между 2-8 ° C будет препятствовать тепловые ожоги. Как специальные меры предосторожности, щенки могут быть обернуты в марлю перед размещением на льду.
7. Заполните шприц с раствором ДНК / PEI.
8. Остановите щенка в стереотаксической рамы, помещая свою голову между марлевыми покрыты уха баров (Рисунок 2B). Убедитесь, что спинной стороне черепа горизонтально, параллельно поверхности рамы и черепных швов четко видны. Протрите головку с 70% этанола.
9. Опустите иглу шприца и отрегулировать стереотаксических координат с помощью циферблаты стереотаксической рамы, пока игла не касается Lambda (по средней линии пересечения теменной и затылочной костей) (рис 2б).
10. Поднимите иглу и отрегулируйте стереотаксических координат до 0,8 мм бокового и 1,5 мм ростральнее лямбда (рис 2b).
11. Опустите иглу, пока она не коснется слегка ямочки на коже. Измерьте координаты. Опустите иглу еще на 1,5 мм. Игла пронзить кожу и череп, и пройти через кору, чтобы войти в боковой желудочек (рис 2С).
12. Использование автоматического инжектора, вводят 0,75 мкл раствора ДНК / PEI со скоростью 0,5 мкл / мин
13. Держите щенка на раме еще минуту, чтобы обеспечить решение разойтись в желудочки. В то же время, анестезию другой щенка, на льду в течение 2 мин при подготовке к следующей инъекции.
14. Мягко и медленно поднимите иглу и поместите щенка под нагревательным лампы. Контролировать дыхание и деятельность. При необходимости, обеспечивают мягкий стимуляции конечностей до появления первых дыхание не следует.
15. Вернуться щенка к матери после того, как прогреется, достиг розовый цвет, регулярно дышать и активно, как правило, 5-7 мин. Если месRe, чем детеныш вводят в то время, сохранить все щенки вместе, пока все инъекции не делаются. Если инъекции занимает больше времени, чем 30 мин, возвращают половина щенков после первых 30 мин, а остальные в конце процедуры.
16. Монитор, что плотина является гибкой и воспитания ее щенков. Если необходимо, можно добавить суррогатной маме в клетку.
17. Убедитесь, что интервал между помещением щенка на льду и поместить его под потепления лампы составляет менее 10 мин. Быстрее процедуру лучше выживания. Как правило, время, необходимое для обезболивания и ввести щенка 4 мин.

3. Биолюминесценция Мониторинг опухоли формирования и прогрессирования

3.1) Мониторинг плазмид Поглощение После инъекций

1. 24-72 ч после инъекции, удалить все щенков из клетки и место матери в 6 и чистой ткани блюдо культуры, одного щенка на лунку.
2. Подготовка 30 мг / мл раствора люциферин, растворенного в нормальном физиологическом растворе или Phosphatе буфер. Подготовьте это решение заранее и хранить в виде небольших аликвот при -20 ° С.
3. Использование 1 мл шприц оснащен 30 калибра иглы для подкожных инъекций вводят 30 мкл люциферин подкожно между лопаток щенка. Убедитесь, что игла не прокалывает любые органы, зажимая кожу и подняв его немного, прежде чем вставлять иглу.
4. Изображение немедленно, используя в естественных условиях системы визуализации биолюминесценции. Для IVIS Spectrum, используйте следующие параметры для приобретений: Автоматическая экспозиция, большой биннинговые, и диафрагма F = 1.

3.2) Контроль опухоли Формирование и прогресс

Примечание: животные начинают формировать макроскопические опухоли обнаруживаемые с помощью биолюминесценции и гистологии течение 2 с половиной-6 недель, в зависимости от онкогенных плазмид вводили.

1. Использование 1 мл шприц, снабженный иглой 26 инъекции 100 мкл 30 мг / мл раствора люциферин внутрибрюшинно.
2. Поместите животное в анестезии камеры. Вводят до пяти животных, в то же время.
3. Подождите 5 минут, затем запустить поток кислорода / ИФ (1,5-2,5% ИФ), чтобы обезболить животных. После 3-4 мин, снять животных от анестезии камеры, запустите поток кислорода / ИФ в биолюминесценции камеры. Поместите животных в соответствующие слоты, оснащенных стекло головных частей для обеспечения анестезии и беспрепятственное прохождение света.
4. Как правило, получить серию изображений 6, на 2-минутные интервалы с автоматическим временем экспозиции, медиана биннинга и открытым отверстием F = 1.
5. Установите область интереса для всех животных, изображаемый обычно овальной над головой регионе, а также измерения интенсивности люминесценции при помощи калиброванных единиц фотоны / с / см ² / стер.
6. Запишите максимальное значение для каждого животного. Впоследствии записи могут быть сравнены в течение прогрессии опухоли у каждого животного и / или между животными, например WHEп используются различные методы лечения.

4. Гистологическое и иммуногистохимическое анализ новых GBMs

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда опухоли достигли желаемого времени эксперимента точку, животные могут быть принесены в жертву, мозги перфузируемые, фиксированные и проанализированы. Для анализа выживаемости умирающий этап представляет собой конечную точку эксперимента, когда животные гуманно умерщвляли на первых признаков опухолевой, как это определено в клинической стадии, когда животное становится симптоматическое демонстрационный ограниченной подвижностью, выгибание спины и грязный мех. Краткое описание стандартных гистологических и иммуногистохимическое методов, используемых представлена ​​ниже.

4.1) перфузии и фиксация

1. Обезболить мышь с внутрибрюшинным инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина.
2. Проверьте педаль рефлекс, зажимая ногу мыши. Когда этот рефлекс отменены, с указанием глубокого наркоза, Immobilize мыши на вскрытии борту штифтами, вскрыть брюшную полость, рассекают диафрагму и откройте грудную полость для визуализации сердца.
3. Вставка тупой 20 калибра канюли в левый желудочек сердца. Подключение канюли с пластиковые трубы, проходящей через перистальтический насос в контейнер с кислородом и гепаринизированной раствора Тирода (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl ₂ 2H ₂ O, 0,005% NaH ₂ PO _4, 0,1% глюкозы, 0,1% раствором NaHCO _3, 0,02 % KCl). Начало поток раствора Тирода, регулируя скорость перистальтического насоса, чтобы обеспечить медленное и постоянный поток, приблизительно одну каплю в секунду или менее, если меньше животных.
4. Сделать небольшой надрез в правое предсердие сердца, чтобы обеспечить отток крови и Тирода.
5. Монитор эффективности перфузии путем наблюдения побледнение внутренних органов (наиболее очевидных в печени и почках), поскольку они становятся лишен крови.
6. КогдаРаствор слива из сердца ясно (3-5 мин), переключать решения от Тирода до 4% параформальдегидом для фиксации (4% PFA, рН 7,34 в фосфатном буферном солевом растворе).
7. Монитор хорошую фиксацию на ткани за счет увеличения жесткости шеи и хвоста.
8. Обезглавьте мыши и тщательно препарировать мозг из черепа.
   1. Потяните мех, который покрывает череп рострально, к носу, и захватить его твердо, чтобы стабилизировать голову, спинной стороной вверх.
   2. Используя острый скальпель, нарезать вниз вдоль края орбиты до секут орбитальные мышцы и лежащей скуловые дуги.
   3. Поверните голову вентральной стороной вверх и удалите прикрепленные мышцы шеи с помощью костными кусачками. Раздавить первого позвонка и удалить его из ствола головного мозга.
   4. Представьте улитки, возьмите лежащего на височной кости с костными кусачками и создать отверстие между височной и затылочной кости. Лупиться затылочную кость с поверхности мозжечка.
   5. Поверните голову вентральной стороной вверх. Мозг будет скользить вниз от остальной части черепа, соединены теперь исключительно через черепных нервов. Использование маленькие ножницы сократить обонятельный, оптики и тройничного нервов. Это позволит освободить мозг.
9. Поместите мозг в 4% PFA в течение ночи при 4 ° С в течение последующей фиксацией.
10. Для гистологического анализа и окрашивания гематоксилином-эозином, трансфер мозги, чтобы фосфатного буфера в течение 24 ч, а затем приступить к парафин.
11. Для иммуно-гистологического анализа, передачи мозги в 30% растворе сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе в течение 24-48 ч (до тех пор, пока мозг опускаются на дно пробирки)
12. Мозги Раздел пополам через середину области опухоли, поместите разрезстороной вниз в морозильной формы, вставлять в крио-вложение средств массовой информации (OCT соединение), и флеш-замораживания в суспензии сухого льда этанол, сухого льда изопентана или в жидком азоте. Хранить замороженные блоки при -80 ° С до секционирования и окрашивания.

4.2) Гематоксилин-эозином парафином мозги гисто-патологических анализа сущностных GBMs

1. Раздел парафин мозги при толщине 4 мкм, падение C на водяной бане 42 ° и установите на стеклах.
2. Де-paraffinize скользит, помещая их в течение 10 мин в 60 ° C сушильном шкафу, а затем передать их на 5-минутными интервалами через серию из трех скольжения контейнеров, заполненных ксилолом.
3. Гидратировать слайды через серию ванн этанола: 100% этаноле в течение 2 мин, повторить один раз, 95% этанола в течение 2 минут, повторение раз, 70% этанола в течение 2 мин, а затем передать слайды к воде.
4. Пятно слайды, опуская их в режиме слайд-контейнер, наполненный Harris гематоксилином в течение 2 мин,
5. Промыть в водопроводной воде, пока вода не станет чистой.
6. Dip слайды дважды в подсинивающих раствора (0,1% натрия бикарбонат).
7. Пусть скользит стоять в водопроводной воде в течение 2 мин, а затем перенести в 80% этаноле в течение 2 мин.
8. Пятно слайды погружением их в емкость с эозином в течение 5 мин.
9. Высушить слайды в серии этанола ванны (80% этанола 3-4 провалов, 95% этанол 2 мин, повторение раз, 100% этанола 2 мин, повторить один раз).
10. Ясно, в 3 последовательных ванн ксилола, 3 мин каждый.
11. Покровное с ксилол основе монтажной среды и не дать высохнуть на плоской поверхности при комнатной температуре до тех пор, готов для работы с изображениями. Хранить при комнатной температуре.

4.3) Иммуно-гистохимия Cryo сохранившихся встроенных мозги Молекулярная и клеточная Характеристика De Novo индуцированной GBMs

1. Получение замороженных блоков из C хранения -80 °, поместить в криостат и позволить, чтобы уравновесить температуру в течение 30 мин.
2. Раздел 12-14 Мкм разделы и смонтировать 2-3 секций на положительно заряженных стеклах. Вырезать разделы последовательно, путем сбора соседних участков на разных слайдах. Это позволяет окрашивания различных антител на соседних участках ткани в опухоли.
3. Сухие скользит в эксикаторе в течение по меньшей мере 1 ч после секционирования, чтобы обеспечить хорошее сцепление ткани.
4. Создать гидрофобный барьер (с гидрофобным маркер) на каждом конце ползуна для обеспечения жидкости для покрытия участков и, чтобы остаться на слайде во время мытья. Крышка секции с раствором фосфатно-солевой буфер с 0,1% Triton-X (PBS, 0,1% ТХ) и осторожно встряхивают в течение 5 мин на горизонтальном шейкере с проницаемыми ткани. Повторите дважды.
5. Блок неспецифическое связывание с раствором 10% нормальной козьей сывороткой (или сыворотки от животного, в котором вторичное антитело повышенной) в течение 30 мин при осторожном встряхивании
6. Подготовка первичной решение антител в 2% нормальной козьей сыворотке в PBS 0,1%Tx и пипетки раствор на секциях. Поместите слайды в закрытом влажной камере в темноте и держать при комнатной температуре в течение ночи.
7. На следующий день, мыть разделы три раза в течение 5 мин с PBS 0,1% Tx и инкубировать в флуоресцентном вторичного антитела, разбавленного в 2% нормальной козьей сывороткой PBS 0,1% Tx в течение одного часа.
8. Промыть разделы три раза в течение 5 мин с PBS 0,1% Tx, контрастное с ядерным красителем (например, DAPI) в течение 2 мин, промыть еще раз, очевидно, в воде и покровное с водной основе монтажную среду, которая будет сохранять флуоресценцию. Поместите слайдов на плоской поверхности, и пусть они не лечить, по крайней мере, 24 ч в темноте, пока готов к визуализации. Хранить при 4 ° С после этого.

5. Формирование первичных опухолевых клеточных линий с определенными генетическими изменениями.

1. Для создания клеточных линий из Спящая красавица мышей с опухолями выбрать мышь с подтвержденным большой опухоли (биолюминесценции 10 ⁷ -10 ⁸ фотонов / с / см2 / SR).
2. Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран анестезии, обезглавить животное и тщательно препарировать мозг из черепа (как описано в разделе 4). Поместите мозг в чистую чашку Петри.
3. Использование лезвие бритвы, чтобы корональные сокращений передний и задний в опухоль. Расположение опухоли, как правило, узнаваемый за счет прозрачности мозга.
4. Проанализируйте опухоль, как правило, 5-7 мм в диаметре, с тонким пинцетом и поместить в 1,5 мл трубки, заполненной 300 мкл нервные стволовые клетки СМИ (NSC СМИ: DMEM / F12 с B-27 добавки, N2 дополнять, а Normocin с добавлением человеческий рекомбинантный EGF и bFGF в концентрации 20 нг / мл каждого).
5. Осторожно гомогенизации опухоли с пластиковым пестиком, который прилегает к стенкам трубки.
6. Добавить 1 мл фермента растворе без диссоциации ткани и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
7. Передайте клеточной суспензии через сито 70 мкм клетки, мыть фильтр с 10 млНСК СМИ, центрифуге при 300 мкг в течение 4 мин, после декантации супернатанта и вновь приостановить гранул в 7 мл среды НБК.
8. Пластина на колбу Т25 культуры и культуры при 37 ° С в инкубаторе тканевых культур с атмосферой и 95% воздуха и 5% CO _2. После 3-х дней, некоторые клетки погибли, некоторые прикреплен к нижней части чашки для культивирования, и некоторые из них, образующие нейросферы, свободно плавающие в средствах массовой информации.
9. Удалите эти взвешенные клетки и повторного пластину на колбу культуры T75 ткани.
10. После еще трех дней культуры, собирать нейросферы, отделить, как описано в шаге 5,6, процедить через ячейки сетчатого фильтра и считать клетки. Замораживание аликвот клеток в эмбриональной бычьей сыворотки 10% ДМСО и прохождение клеток при плотности один миллион клеток в 14 мл НСК с добавлением EGF и FGF для T75 колбу. Скорость роста зависит от онкогенов, используемых для генерации опухоли. Адаптация условиях культуры клеток, чтобы предотвратить разрастание и поддержания клеток при относительно высокой плотности.

Representative Results

Для характеристики гисто-патологических особенностей SB-индуцированных глиобластомы, C57 / BL6 новорожденных мышей вводили в Р1 плазмидой, кодирующей люциферазы (pT2 / SB100x-Люка) в сочетании с плазмидами, кодирующими транспозонов онкогенными ДНК, т.е. НКО (PT / CAGGS -NRASV12) и SV40 LGT (Pt / CMVSV40-LGT) (3в) или плазмиды, кодирующие короткую шпильку p53 с PDGFβ и GFP репортер (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) в сочетании с НРО (рис 3d). Животные не наблюдали в течение биолюминесценции день после инъекции (рис 2а) и периодически до достижения умирающей стадии, когда они были умерщвлены. Moribund этапе определяется как клинической стадии, когда животное становится симптоматическое, показывающий ограниченной подвижностью, выгибание спины, грязный мех и потерю веса. Иногда животных развивались судороги или аномальные движения, как ходьба по кругу и внезапной прыжков. В конце эксперимента животныхс анестезировали. Головной мозг перфузии, заливали в парафин, и обрабатывали для окрашивания гематоксилином и эозином. Данные показаны опухоли, отображающие признаки человеческой глиобластомы (IV степени ВОЗ) с кровоизлияниями (3в), некроз псевдо-pallisading (рис 3e) и периваскулярной и диффузное вторжения в паренхиме головного мозга (рис 3G, F). Образование pseudopallisades предшествует разрыву крупных сосудов glomeruloid с вытекающей эндотелий (фиг 3i), которые приводят в регионах кровоизлияния с массивной инфильтрации мононуклеарных клеток (фиг 3H). Нетипичные митозы (рис 3J) и гигантские многоядерные клетки опухоли с (рис 3k) также патогномоничны человека GBM.

Глиобластомы генерируется с использованием Системы сна транспозазу красоты можно наблюдать на протяжении всего прогрессирования опухолевого роста с биолюминесценции, если плазмиды вводиликодировать люциферазы. Пример эксперимента показан на фиг.4а. Животные, как правило, уступают бремени опухоли, когда свечение достигает интенсивности 10 ⁷ -10 ⁹ фотонов / с / см ² / SR. Средняя продолжительность жизни животных предсказуемо зависит от комбинации онкогенных транспозонов, вводимых в неонатальном мозге, как показано на кривых выживаемости, представленные на рисунке 4B. Обратите внимание, что самые агрессивные опухоли индуцированные NRAS и SV40 LGT антигена (медиана выживаемости 30 дней), в то время как медиана выживаемости животных с GBM индуцированных shp53 NRAS и PDGF составляет 62,5 дней, и животных, которым вводили shp53 и NRAS 83 дней.

De Novo, образованные опухоли могут быть охарактеризованы иммуно-гистохимически их экспрессии молекул, характерных глиальных опухолей. 5 показан формирующегося опухоли (22 точек на дюйм, биолюминесценции 2x10 ⁵ фотонов / с / см ² / SR), индуцировали shp53и NRAS. Вводят shp53 плазмиды кодирует зеленый флуоресцентный белок (GFP), чтобы идентифицировать трансфекции клеток и их потомства (pT2 / shp53 / GFP). GFP + опухолевые клетки экспрессируют нервных стволовых клеток нестин маркера и некоторые GFP + клетки также экспрессируют глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP). Фиг.6 иллюстрирует опухоль из умирающих животных на 56 точек на дюйм, опухоли, которые также индуцировали shp53 / GFP и NRAS. Многочисленные GFAP + астроциты вокруг опухоли. GFP + опухолевые клетки экспрессируют нестин, но не GFAP.

Большим преимуществом при использовании этого метода, чтобы вызвать GBMs является способность генерировать новые клеточные линии GBM с уникальными генетических изменений с помощью транспозонов вводили. Кроме того, линии пользовательские клеток могут быть получены с использованием трансгенных животных с определенной генетической косметикой. Эти клеточные линии играют важную роль в задавая много механистические вопросы, используя биохимические анализы. Они идеально подходят для цитотоксичность исследований с новыми чemotherapeutic агенты. Фиг.7 иллюстрирует нейросфера из спящего опухоли красоты, индуцированной shp53, PDGF и NRAS, показывающий экспрессию GFP, который кодируется на одном из вводимых плазмид. Следует отметить, что выражение не столь интенсивно во всех клеток, что указывает на гетерогенный характер этих первичных клеток GBM.

Рисунок 1: () Схематическое представление, иллюстрирующее "вырезать и вставить" механизм, используемый Спящая красавица транспозазы интегрировать транспозонов в хромосомной ДНК хозяина донор транспозонов плазмиды изображены с интересующего гена фланкированного инвертированных повторов / прямых повторов. (IR / DR, красные коробки со стрелками) последовательности. SB транспозаза (зеленый) связывается с ИК / DR, акцизы транспозон и реинтегрирует его между случайными ТП динуклеотидную пар оснований на хромосомной ДНК хозяина. (Б) пример клонированияинтерес ген (mPDGFβ) в остов вектора SB (ПКТ-IRES-Katushka). Вектор SB содержит два IR / DR повторы (красный) и кассету экспрессии гена, который включает в себя промотор и энхансер последовательности, сайт множественного клонирования (MCS, синий), внутренние рибосомных сайтов запись (IRES), флуоресцентный репортер маркер (Katushka: желтый), и сайт polyadenilation (полиА). Онкоген интерес (mPDGFβ; оранжевый) содержится в вектора клонирования pGEMT. Онкоген, в окружении конкретных сайтов рестрикции (NcoI / SacI) освобождается в результате ферментативного пищеварения, и притупляется притупление фермента. Вектор линеаризуется и притупляются, а также. Наконец, онкоген mPDGFβ вставляется в вектор доноров с помощью реакции с тупым концом лигирования для создания новых плазмиды транспозонов вектор:. ПКТ-mPDGFβ-IRES-Katushka Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное вариант оF этого показателя.

Рисунок 2: Экспериментальная установка и руководства для внутри инъекций желудочка у новорожденных мышей () стереотаксической рамы (2) с микрометра циферблатов оснащен автоматической инжектор проведения 10 мкл шприц (4). Внутри U кадра, новорожденных адаптер рамы надежно закреплены (3). Пульт управления автоматические шприцевые (1) позволяет точного выбора шприца, объема и скорости потока (б) Фотография новорожденных мышей (P1) с помощью иглы, вставленной в точке с координатами, необходимых для инъекций в боковой желудочек:. 1,5 мм вентрально и 0,8 мм сбоку от лямбда. (с) Иллюстрация корональной разделе через мозг новорожденных мышей (P1), подчеркивая относительные размеры и положение желудочков.

Рисунок 3: опухолей, вызванных со спящим системы транспозонов Beauty Show гистологические признаки человеческого GBM (а) биолюминесценции изображения неонатальной щенок 24 часа после внутрижелудочкового введения с плазмид, кодирующих НКО, SV40 LGT (б) Биолюминесценция образ взрослого животного (. (с) гематоксилином и эозином пятно корональной участке от мозга умирающей мыши с опухолью, индуцированной NRAS и LGT (28 точек на дюйм) (г) корональной раздела. 50 точек на дюйм) с большим опухоли, индуцированной shp53 NRAS и PDGF. от мозга умирающей мыши с опухолью вызывает с shp53 NRAS и PDGF. (е) Pseudopalisading некроза, гистологического отличительной чертой человеческой глиобластомы наблюдается в De Novo, полученных опухолей. Стрелка указывает на ячейки, расположенные в частоколом, мигрирующих из центральной зоны некроза (N) (F) и (г) De Novo генерируется опухоли высоко инвазивными, показывая вторжение вдоль кровеносных сосудов (г) и диффузной (F) в нормальной паренхиме головного мозга. (Ч) Регион кровоизлияния с массивным вторжением мононуклеарных клеток (стрелки), на начальном этапе площадью некроза pseudopalisading. (Я) Большой glomeruloid сосуд с вытекающей эндотелия (стрелка) в начале диффундирующего кровоизлияния внутри опухоли, индуцированной NRAS и SV40 -LgT. (J) Атипичная митоза в опухоли клеток (стрелка). (К) Гигантский опухолевых клеток с несколькими крупными ядрами (стрелки).

Фигура 4: животных с опухолями можно контролировать с биолюминесценции в течение всего периода прогрессирования заболевания. Медиана выживаемости животных прогнозируется комбинациейвводят онкогенными ДНК. () Пример биолюминесцентных следы от когорты 7 C57 / BL6 мышей. Обратите внимание, что у мышей, поддаваться примерно через неделю после биолюминесценции достигает 10 ⁸ фотонов / с / см2 / ср. (Б) кривые выживаемости Образец сравнению медиана выживаемости животных с Спящая опухоли красоты, созданные с различными комбинациями плазмид. Медиана выживаемости опухолей, вызванных с NRAS и SV40 LGT составляет 30 точек на дюйм, тогда как животных с опухолями, индуцированные shp53 NRAS и PDGF или shp53 и NRAS составляет 62,5 дюйм или 83 точек на дюйм соответственно. DPI: дней после инъекции.

Рисунок 5: Нарождающиеся макроскопическое GBM (22 точек на дюйм) индуцировали shp53 и NRAS показывают экспрессию нестина и GFAP в GFP + опухолевых клеток (конфокальной микрофотографии) Панель (а) показывает формирующегося опухоли, экспрессирующих GFP.. Панель (б) представляет собой то же поле, показывающую нестин выражение. Панель (а) и (б), иллюстрирующая совместной локализации нестина и GFP. (Д) GFP экспрессии в опухолевых клетках. (Е) GFAP выражение в некоторых опухолевых клетках и в клетках, окружающих опухоль формирующегося. (Е) Наложение проекция (д) и (е), иллюстрирующий некоторые опухолевые клетки (белый) CO-экспрессирующих GFAP и GFP. Шкала баров в (а) и (D) представляют 75 мкм.

Рисунок 6: GBM индуцированных shp53, NRAS и PDGF от умирающей животного (56 точек на дюйм), показывая GFP и нестин выражение в опухолевых клетках и обильные окрашивание для глиальных маркера GFAP окружающих опухоль Panel () представляет Ниссля пятно acoronal разделе. через мозг умирающей животного с опухолью (интенсивный синий окрашивание FROM увеличилось клеточность), индуцированное с Спящая системы транспозонов красоты с использованием shp53, PDGFΒ и НКО. Панель (б), корональной примыкающей секции к одной панели, показанной на (а) окрашивали с окрашивающим ядра DAPI, показывающий экспрессию GFP в клетках опухоли. Панель (в) представляет собой микрофотографию конфокальной границы опухоли показывает GFP экспрессии в опухоли, обозначенное высокой атомной плотностью с DAPI. Панель (г) показана та же поле зрения, что и в (а), показывающий интенсивную экспрессию GFAP в клетках, прилегающих к опухоли. Панель (е) представляет собой накладку панели (С) и (D). Панель (е) является конфокальной микрофотография границы опухоли, показывающий экспрессию GFP в клетках опухоли. Панель (г) представляет собой то же поле зрения, что и в (F), показывающий экспрессию нестина в опухолевых клетках. Панель (Н) наложение проекция панели (F) и (G)

Рисунок 7:. Нейросферы из Спящей опухоли красоты, индуцированной shp53, PDGF и NRAS после 5 дней в культуре, прохождение 2. Клетки выражения GFP закодированы на shp53 PDGF плазмиды (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) Panel () является светлое микрофотография нейросфера. Панель (б) представляет собой эпи-флуоресцентный микрофотография той же точки зрения, что и в (а), показывающий экспрессию GFP в клетках нейросфера. Панель (в) представляет собой накладку панели (а) и (б).

Discussion

В этой статье мы подробно универсальный и воспроизводимый метод для генерации новых моделей GBM с помощью СО transposase- зависимой интеграции онкогенных ДНК плазмиды в клетки, окружающие субвентрикулярной зону новорожденных мышей. Мы приводим протокол для создания транспозона плазмиды с новых генов, представляющих интерес, иллюстрируют, как контролировать прогрессирование опухоли в живых животных, и как охарактеризовать гисто-патологические и иммуно-гистохимических особенностей этих опухолей.

Как нашей лаборатории (Фиг.3), а другие ¹³ показали, эта модель надежно создает опухоли с характерных особенностей человека, включая GBM (1) некроза псевдо-palisading, (2) пролиферацию сосудов, (3) ядерной атипии, (4) аномальных митозов и ( 5) периваскулярное и диффузное вторжение. Использование новорожденных мышей является оптимальным с логистической точки зрения, обеспечивая сравнительно легко техническую процедуру с минимальным оборудованием и себедации времени / восстановление, позволяя для быстрого поколения больших образцов опухолей с конкретными генетическими изменениями. Эти опухоли может привести к животным поддаваться опухолевой с предсказуемым медианы выживаемости в зависимости от генетических изменений, вызванных. Наконец, модель SB была использована в качестве терапевтического экране вмешательства ответ на лечение ^24.

Есть несколько важных факторов, которые следует учитывать при подготовке решения, используемые для новорожденных инъекций. Растворы ДНК должны быть стерильными, эндотоксинов и концентрируют (2-7 мкг / мкл), чтобы обеспечить минимальный объем инъекции. Оптимальное соотношение остатков азота в полиэтиленимина (PEI) с фосфатных остатков в ДНК (шум / Р) 7. Это обеспечивает образование положительно заряженных частиц комплексов, которые будут связываться анионные фрагменты на поверхности клеток и будет эндоцитарных. После того, как в цитоплазме, осмотическое приток вызовет частицы лопнуть и выпустить encapsulatред плазмидной ДНК. В естественных условиях раствор струи-ПЭИ, имеет концентрацию 150 мМ выражена как остатки азота. Учитывая, что один мкг ДНК имеет 3 нмоль фосфата анионного, количество необходимого реагента для трансфекции может быть рассчитана по формуле:

мкл в естественных условиях реактивный PEI = [(мкг ДНК х 3) х N / P соотношение] / 150.

Например, для приготовления 40 мкл 0,5 мкг / мкл ДНК-раствора с N / P отношение 7, 20 мкг ДНК необходимы. Объем обязательных PEI будет 20 * 3 * 7/150 = 2,8 мкл.

До пяти различных плазмид могут быть введены одновременно. Эксперименты, представленные здесь, доставить Спящая красавица транспозазу в транс на плазмиде, который также кодирует люциферазу (SBLuc). Как уже упоминалось во введении, соотношение молекул транспозазу для транспозонов является важным для обеспечения оптимального транспонирование. Оптимальное соотношение (эмпирически установлено) плазмиды SB100x к Transposon ДНК плазмид 1: 4. Таким образом, если использовать два различных транспозона плазмиды, T1 и T2, например, отношение SBLuc: T1: T2 будет 1: 2: 2; или в общей сложности 20 мкг ДНК в растворе 40 мкл 4 мкг SBLuc смешивают с 8 мкг T1 и 8 мкг Т2. Для трех различных транспозонов плазмиды отношение будет SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1,33: 1,33: 1,33, а в течение четырех транспозонов: 1: 1: 1: 1: 1.

Это полезно для проверки поглощение плазмидной ДНК с помощью биолюминесценции 24-72 ч после инъекции. Как животные растут, увеличение оптической плотности меха, кожи, черепа и мозга, предотвращает мониторинг опухолевой прогрессии, пока опухоль не достигнет порогового размера, примерно 1-2 мм ³ для темно пигментированных C57BL6 мышей. Лучше пропускания света возможно в таких мышей, если их мех побрился, или при использовании мыши с белым или не мех.

Необходимо учитывать при использовании этой модели некоторые ограничения. Во-первых, генкрестики материал, введенный с вводимых плазмид может быть интегрирована в случайном порядке в геном хозяина в разных местах и ​​количество копий. Это может привести к вариабельности между опухолевыми клетками и между опухолей. Во-вторых, ДНК введена вставляется в первую очередь на интронных последовательностей повторяющихся ТА ДНК ^25, однако, возможность вмешательства в кодирования хоста геномной ДНК остается. В-третьих, интравентрикулярные инъекции могут привести к небольшой, но постоянный темп гидроцефалии у молодых мышей, который становится клинически видимой и симптоматическое в 3-4 недели жизни. Некоторые штаммы мышей более склонны к гидроцефалии, чем другие (например, С57 / BL6 более FvB). Чтобы свести к минимуму риск индукции гидроцефалия, рекомендуется вводить в виде маленьких объем, насколько это возможно (менее 1 мкл в C57 / BL6 мышей), чтобы убедиться, что иглы остры, решения имеют низкую соленость и обеспечить растущие щенков с обогащенный пищу, с тем чтобы своевременно окостенения черепа БонES. Наконец, опухоли поздней стадии часто развиваются некроз, который должен учитываться при мониторинге мышей биолюминесценции. Нижняя считывания может указывать на передовые опухоль с большими участками некрозов и не обязательно размер опухоли как следствие лечения. В конечном счете, гистологический анализ остается золотым стандартом для оценки прогрессирования опухоли.

Появление опухоли всей секвенирования генома в последние годы открыла дверь в освоении роли периодически мутировавших генов в глиобластомы. Спящая красавица модель является оптимальным для проверки потенциальных онкогенов или опухолевых супрессоров. Как и в примере, приведенном в данной работе с PDGFβ лиганда, клонирование кДНК мыши последовательность кандидата онкогена в установленном СО плазмиды позвоночника приведет к конститутивной экспрессии в трансфицированных клетках. Оценка роли опухолевых супрессоров может быть эффективно выполнена путем клонирования в основной цепи плазмиды СО с возможных последовательностей, (модели шириной например в Кодексе базе данных РНК-интерференции ^26), чтобы создать сильную экспрессию второго поколения Мир коротких шпилек.

Нынешняя дискуссия в области исследований GBM связана с идентичностью клеточной посещающих происхождения. Недавно было показано, что у мышей, опухоли, индуцированные вниз для регулирования р53 и НФ1 в нервных стволовых клеток, происходят из клеток-предшественников олигодендроцитов ^27. Использование Спящая красавица транспозонов модель, аналогичные исследования могут быть разработаны, чтобы проверить, могут ли другие генетические изменения преимущественно нацелены и на другие популяции стволовых клеток / клеток-предшественников для получения GBMs. Знание таких исследований значительно повысит наше понимание GBM этиологии и обеспечить возможности для новых терапевтических подходов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631