Транспозонный зависимой интеграции плазмидной ДНК в субвентрикулярной зоне новорожденных мышей для генерации Novel Модели глиобластомы
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
Глиобластомой мозга (GBM) является наиболее распространенным (60%) первичная опухоль головного мозга у взрослых, с медианой выживаемости 15-21 месяцев при лечении хирургии, лучевой терапии, и химиотерапии 1. Новые методы лечения глиобластомы являются обязательными. Экспериментальные методы лечения требуют проведения испытаний на животных моделях, которые хорошо воспроизводят характерные черты человеческих болезней. Стратегии вызвать GBM у грызунов включают химический мутагенез с алкилирующих агентов, зародышевой линии или соматические генетические изменения, или трансплантации с использованием глиомы клеточные линии 2. Наиболее часто используемые модели используют имплантацию глиомы клеточных линий, либо ортотопически, в мозг или подкожно с помощью сингенные клетки у животных с одинаковым генотипом; или ксеногенных клеток, клеточные линии, наиболее часто человека GBM, имплантированные в иммунной угрозу мышей 3. Ксенотрансплантаты предлагают много преимуществ для изучения внутричерепных опухолей: удобство воспроизводимости, Standardized темпы роста, время локализации смерти и опухоли. Тем не менее, эти модели имеют ограничения из-за искусственного инвазивного хирургического подхода, используемого для имплантации и ограниченной способностью точно воспроизводить гистологические признаки, характерные для человека GBM (степень IV ВОЗ): некрозу псевдо-pallisading, ядерных atypias, диффузный вторжения, микро-сосудистой пролиферации и формирование glomeruloid сосудистые аномалии 4-7. Индукция GBM путем изменения генома соматических клеток с онкогенными ДНК, либо с вирусными векторами 8-12, или с транспозонов-опосредованной интеграции 13, воспроизводит более тесно этиологии болезней человека и повторяет гисто-патологических особенностей человека GBM.
Исторически сложилось так, опухоли ЦНС были классифицированы на основании предполагаемой клетки происхождения, которые было замечено, будет прогностическим фактором для выживания 14. GBMs делятся на первичные и вторичные. Новые данные Todай указывает на весьма неоднородный характер первичного глиобластомы 15. Среднее GBM (15%), результат злокачественной трансформации астроцитом низкосортных (уровень I ВОЗ) и anaplasic астроцитом (ВОЗ класс II), которые связаны с более ранним началом заболевания, лучше прогноза и "пронейрального" образец экспрессии генов , в то время как первичной GBM (85%) Показать на позднее начало, плохой прогноз и глиальных (классическая), нервов или мезенхимальные паттерны экспрессии. Будут ли эти образцы экспрессии генов коррелирует с фактической клетки происхождения опухоли все еще активно исследовали. Накопление данных показывает, что сочетание генетических мутаций, связанных с GBMs являются прогностическими выживания. Например, потеря гетерозиготности (LOH) хромосом 1р / 19q, IDH1 мутаций, PDGFRα Амплификации, связаны с вторичными GBMs, пронейрального паттерна экспрессии и улучшению прогноза, в то время как EGFR гиперэкспрессия, Notch и Соник активации еж путь, NF1 и PTEN потери и мутации р53 коррелируют с помощью нейронной, классический, или мезенхимальных первичных GBM и худшим прогнозом 16,17. Появление крупных секвенирования проектов и накопление многочисленных образцов пациентов, доступных для тестирования приносит богатство новой информации по отношению к генетическим мутациям и путей, вовлеченных в патогенез и прогрессирование GBM и возможности индивидуализированного медицине, где методы лечения могут быть специально созданы для генетические аномалии пациента. В конечном счете, оценить прогностическое значение этих мутаций и путей в систематическом порядке, а также проверить возможные процедуры в каждом конкретном случае, требуется животных моделей GBM с заранее заданными генетическими изменениями. Транспозонный зависимой интеграции геномной ДНК предлагает возможный подход.
Спящая красавица транспозонов система, член Tc1 / моряка класса транспозонов, была "проснулся" (построен) в многоступенчатой процесс сайта направленного мутагенеза с лососевые гена транспозазы, который стал бездействующим более 10 миллионов лет назад 18,19. В сущности, ДНК-транспозонов фланкированы специфических последовательностей (инвертированных повторов / прямых повторов: IR / DR) могут быть интегрированы в геном в "вырезать и вставить" способом посредством деятельности Спящая красавица транспозазы. Транспозаза признает концы ИК-сайтов, вырезает транспозон и интегрирует его случайно в другом месте ДНК между основаниями Т и А, основы которых дублируется на каждом конце транспозона при транспозиции (фиг.1а). Спящая красавица транспозаза состоит из трех доменов, транспозонов связывающий домен, последовательности ядерной локализации и каталитический домен. Четыре молекулы транспозаза должны привести два конца транспозона совместно и позволяют транспозиции, тем не менее, если слишком много молекул транспозазы присутствуют, то они могут димеризации и tetramerize ингибироватьперестановка реакция 20. Эффективно реагировать перестановки требуется оптимальное соотношение транспозазы к транспозонов. ДНК, кодирующая транспозазу могут быть доставлены на той же плазмиде с транспозона (в СНГ) или на другом плазмиды (в транс). Чтобы обеспечить оптимальное соотношение между транспозазы и транспозонов, промотор с адекватной активностью могут быть выбраны для экспрессии транспозазы (для модели "цис") или соотношение плазмид в растворе для инъекций могут быть оптимизированы (по "транс" модель). Системы сна транспозонов Красота может быть успешно использован для функциональной геномики, инсерционного мутагенеза, трансгенеза и соматической генной терапии 21. Будучи синтетическим конструкция модернизирована для функциональной молекулы из покоя, лососевые вариант, Спящая красавица транспозаза не связываться с другими транспозонов у человека и других млекопитающих 20. С момента своего открытия, молекулярной инженерии имеет Enhancред перестановка эффективность системы транспозонов СО путем внесения изменений в ИК последовательностей и добавления TATA динуклеотиды фланговые транспозон, в результате чего транспозонов рТ2. Эти транспозонов оптимизировали связывание СО с ИК-сайте и повышение эффективности удаления. SB транспозаза также претерпела значительные улучшения; транспозаза используется в экспериментах, представленных в настоящем документе, SB100X, гиперактивный транспозаза порождается стратегии перетасовки ДНК с последующим генетическом скрининге крупной в клетках млекопитающих 22.
В этом докладе мы представляем быстрый, универсальный и воспроизводимый метод, чтобы вызвать внутреннюю GBM у мышей с невирусной, транспозонов-опосредованной интеграции плазмидной ДНК в клетках суб-желудочковой зоны новорожденных мышей 23. Мы приведем простой способ создания транспозонов с новых генов поддаются для геномной интеграции с помощью Спящая красавица транспозазу и продемонстрировать, как мониторинг востребованности плазмиды ипрогрессирование заболевания с помощью биолюминесценции. Мы также характеризуют гистологические и иммуно-гистохимических особенностей GBM воспроизводится с этой моделью. Кроме того, мы представляем быстрый способ получения первичных GBM клеточных линий из этих опухолей. Спящий модель красоты, в котором опухоли из клеток индуцируется оригинальных животного, позволяет функциональную оценку роли кандидатов GBM генов в индукции и прогрессии опухолей. Эта система также хорошо подходит для тестирования новых обработок GBM, в том числе иммунной терапии в иммунокомпетентных мышах, без необходимости инвазивных хирургических процедур воспалительных, которые нарушают локальную микросреду.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы подробно универсальный и воспроизводимый метод для генерации новых моделей GBM с помощью СО transposase- зависимой интеграции онкогенных ДНК плазмиды в клетки, окружающие субвентрикулярной зону новорожденных мышей. Мы приводим протокол для создания транспозона плазмиды с н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
