Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) is de meest voorkomende (60%) primaire hersentumor bij volwassenen, met een mediane overleving van 15-21 maanden bij behandeling met chirurgie, radiotherapie en chemotherapie 1. Nieuwe therapieën voor GBM zijn noodzakelijk. Experimentele therapieën vereisen testen in diermodellen waarin de meest opvallende kenmerken van de ziekte bij de mens adequaat reproduceren. Strategieën om GBM induceren in knaagdieren omvatten chemische mutagenese met alkylerende agentia, germline of somatische genetische veranderingen, of transplantatie met behulp glioomcellijnen 2. De meest gebruikte modellen gebruiken implantatie van glioma cellijnen, hetzij orthotopically, in de hersenen of subcutaan met syngene cellen bij dieren met identieke genotype; of xenogene cellen, meestal humane GBM cellijnen, geïmplanteerd in immuun gecompromitteerde muizen 3. Xenotransplantaties bieden vele voordelen voor de studie van intracraniële tumoren: gemak van reproduceerbaarheid, standardized groeicijfers, de tijd van de dood en tumorlokalisatie. Echter, deze modellen hebben beperkingen als gevolg van de kunstmatige, invasieve chirurgische benadering gebruikt voor implantaties en de beperkte mogelijkheid om histologische nauwkeurig te reproduceren beschikt kenmerk van de menselijke GBM (WHO graad IV): pseudo-pallisading necrose, nucleaire atypias, diffuse invasie, micro-vasculaire proliferatie en de vorming van glomeruloid vaatafwijkingen 4-7. Inductie van GBM door het veranderen van het genoom van somatische cellen met oncogeen DNA, of met virale vectoren 8-12, of transposon-gemedieerde integratie 13, reproduceert beter de etiologie van menselijke ziekten en herhaalt histo-pathologische kenmerken van menselijke GBM.
Historisch, tumoren van het centrale zenuwstelsel zijn geclassificeerd op basis van de waargenomen cel van oorsprong, die werd waargenomen, zou een voorspellende factor voor overleving 14 zijn. GMB's worden ingedeeld in primaire en secundaire. Opkomende bewijs today wijst op de zeer heterogene karakter van de primaire glioblastoma 15. Secundaire GBM (15%), het resultaat van maligne transformatie laagwaardige astrocytomen (WHO graad I) en anaplasic astrocytomen (WHO graad II), geassocieerd eerder optreden van de ziekte, betere prognose en een "proneural" patroon van genexpressie , terwijl primaire GBM (85%) een late onset, slechte prognose en gliacellen (klassiek), neurale of mesenchymale expressie patronen tonen. Of de patronen van genexpressie correleren met de reële cel van oorsprong van de tumor is nog actief onderzocht. Accumulerende gegevens blijkt dat de combinatie van genetische mutaties geassocieerd met GBMs predictief te overleven. Bijvoorbeeld, het verlies van heterozygocity (LOH) chromosomen 1p / 19q, IDH1 mutaties, PDGFRα versterkingen, in verband worden gebracht met secundaire GBMs, proneural expressie patroon en betere prognose, terwijl EGFR overexpressie, Notch en Sonic hedgehog pathway activering, Nf1 en PTEN verlies en mutaties van p53 zijn gecorreleerd met neurale, klassiek, of mesenchymale primaire GBM en slechtere prognose 16,17. De komst van grootschalige sequentiebepalingsprojecten en de accumulatie van verschillende patiëntenmonsters voor het testen brengt een schat aan nieuwe informatie betreffende genetische mutaties en routes betrokken bij GBM pathogenese en progressie en de mogelijkheid van geïndividualiseerde geneeskunde, waar therapieën specifiek kunnen worden afgestemd de genetische afwijkingen van de patiënt. Uiteindelijk is de voorspellende waarde van deze mutaties en routes systematisch te evalueren en mogelijke behandelingen testen telkens vereist diermodellen van GBM met vooraf bepaalde genetische veranderingen. Transposon gemedieerde integratie van genomisch DNA biedt bruikbaar zijn.
The Sleeping Beauty transposon systeem, lid van de Tc1 / zeeman klasse van transposons, werd "wakker" (gebouwd) in een multi-step process van plaatsspecifieke mutagenese van een zalmachtige transposase gen, die slapende meer dan 10 miljoen jaar geleden werd 18,19. In wezen DNA transposons geflankeerd door specifieke sequenties (omgekeerde herhalingen / directe herhalingen: IR / DR) kan door middel van de activiteit van Doornroosje transposase worden geïntegreerd in het genoom in een "knip en plak" wijze. Het transposase erkent de uiteinden van de IR sites accijns de transposon en integreert willekeurig in een andere DNA-plaats tussen de basen T en A, basen die worden gedupliceerd aan beide uiteinden van het transposon tijdens omzetting (figuur 1a). Doornroosje transposase bestaat uit drie domeinen, een transposon bindend domein, een nucleair lokalisatiesignaal sequentie en een katalytisch domein. Vier transposase moleculen dienen de twee uiteinden van de transposon samen te brengen en zorgen voor de omzetting echter, indien te veel moleculen transposase aanwezig zijn, kunnen ze dimeriseren en tetrameer te remmende omzetting reactie 20. Een efficiënte omzetting reactie vereist een optimale verhouding van transposasegen om transposons. Het DNA dat codeert voor het transposase kan worden uitgebracht op hetzelfde plasmide met de transposon (CIS) of op een ander plasmide (trans). De optimale verhouding tussen het transposase en de transposons garanderen, kan een promoter met voldoende activiteit gekozen voor de expressie van het transposase (de "cis" model) of de verhouding van de plasmiden in de injectieoplossing kan worden geoptimaliseerd (de "trans" model). The Sleeping Beauty transposon systeem met succes kan worden gebruikt voor functionele genomica, insertiemutagenese, transgenese en somatische gentherapie 21. Omdat het een synthetische constructie opnieuw ontworpen om een functionele molecuul van een slapende zalmachtige variant, doet de Sleeping Beauty transposase niet binden aan andere transposons in mensen of andere zoogdieren 20. Sinds de ontdekking, moleculaire technieken heeft audiotoebed de omzetting werkzaamheid van het SB transposon systeem door veranderingen in het IR sequenties en toevoeging van TATA dinucleotiden flankeren de transposon, waardoor de pT2 transposons. Deze transposons hebben binding van de RvC geoptimaliseerd om de IR-website en de toegenomen effectiviteit van excisie. De SB transposase onderging ook een significante verbetering; het transposase gebruikt in experimenten die hierin is SB100X een hyperactief transposase gegenereerd door DNA shuffling strategie gevolgd door een grote genetische screen in zoogdiercellen 22.
In dit rapport presenteren we een snelle, veelzijdige en reproduceerbare methode intrinsieke GBM induceren in muizen met niet-virale, transposon-gemedieerde integratie van plasmide-DNA in cellen van de sub- ventriculaire zone van neonatale muizen 23. We presenteren een eenvoudige manier om transposons met nieuwe genen vatbaar voor genomische integratie met behulp van de Schone Slaapster transposase maken en demonstreren hoe plasmide opname te controleren enprogressie van de ziekte met behulp van bioluminescentie. We hebben ook karakteriseren histologische en immuno-histochemische kenmerken van de GBM gereproduceerd met dit model. Bovendien presenteren we een snelle methode om primaire GBM cellijnen van deze tumoren genereren. Doornroosje model, waarin tumoren worden geïnduceerd uit cellen origineel aan het dier, kan de functionele beoordeling van de rol van GBM kandidaat genen in de inductie en progressie van tumoren. Dit systeem is ook goed geschikt voor het testen van nieuwe GBM behandelingen, waaronder immune therapieën in immunocompetente muizen, zonder de noodzaak van invasieve inflammatoire chirurgische procedures, waarbij de lokale micro-omgeving kunnen veranderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel, we detail een veelzijdig en reproduceerbare werkwijze voor het genereren van nieuwe modellen van GBM gebruik SB transposase- gemedieerde integratie van oncogene plasmide-DNA in cellen rondom de subventriculaire zone van neonatale muizen. We presenteren een protocol om transposon plasmiden met nieuwe genen van belang te genereren, te illustreren hoe de progressie van de tumoren in levende dieren, en hoe histo-pathologische en immuno-histochemische kenmerken van deze tumoren te karakteriseren.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
