Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
El glioblastoma multiforme (GBM) es el (60%) tumor cerebral primario más común en adultos, con una supervivencia media de 15-21 meses cuando fueron tratados con cirugía, radioterapia, y quimioterapia 1. Terapias novedosas para GBM son imprescindibles. Las terapias experimentales requieren pruebas en modelos animales que reproducen adecuadamente las características más destacadas de la enfermedad humana. Estrategias para inducir GBM en roedores incluyen mutagénesis química con agentes alquilantes, línea germinal o alteraciones genéticas somáticas, o el trasplante usando líneas celulares de glioma 2. Los modelos más utilizados emplean la implantación de líneas celulares de glioma, ya sea ortotópicamente, en el cerebro o por vía subcutánea utilizando células singénicas en animales con idéntico genotipo; o células xenogénicas, líneas más comúnmente humanos de células GBM, implantados en ratones inmunes comprometidos 3. Los xenoinjertos ofrecen muchas ventajas para el estudio de tumores intracraneales: conveniencia de la reproducibilidad, standatasas de crecimiento rdized, momento de la muerte y el tumor de localización. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones debido al abordaje quirúrgico artificial, invasivo utilizado para implantaciones y capacidad limitada para reproducir con precisión histológica rasgos característicos de GBM humana (OMS grado IV): necrosis pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasión difusa, la proliferación de micro-vascular y la formación de anomalías vascular glomeruloide 4-7. La inducción de GBM por alterar el genoma de las células somáticas con ADN oncogénico, ya sea con vectores virales 8-12, o con la integración mediada por transposón 13, reproduce más estrechamente la etiología de la enfermedad humana y recapitula características histopatológicos de GBM humano.
Históricamente, los tumores del SNC han sido clasificados sobre la base de la célula de origen percibida, que se observó, sería un factor predictivo para la supervivencia 14. GBMs se clasifican en primaria y secundaria. Emergentes tod pruebasay apunta a la naturaleza altamente heterogéneo de glioblastoma primaria 15. GBM secundaria (15%), el resultado de la transformación maligna de los astrocitomas de grado bajo (OMS grado I) y astrocitomas anaplásicos (OMS grado II), están asociados con la aparición temprana de la enfermedad, mejor pronóstico y un patrón de "proneural" de la expresión génica , mientras que GBM primaria (85%) muestran una aparición tardía, mal pronóstico y glial (clásica), neural o patrones de expresión mesenquimales. Si estos patrones de expresión génica se correlacionan con la célula real de origen del tumor todavía se está investigando activamente. La acumulación de los datos muestra que la combinación de mutaciones genéticas asociadas con GBMs son predictivo para la supervivencia. Por ejemplo, la pérdida de heterocigosidad (LOH) de los cromosomas 1p / 19q, mutaciones IDH1, PDGFRa amplificaciones, están asociados con GBMs secundarias, patrón de expresión proneural y mejor pronóstico, mientras que la sobreexpresión de EGFR, Notch y activación de la vía hedgehog sonic, Nf1 y PTEN pérdida y las mutaciones de p53 se correlacionan con los nervios, clásica, o GBM primaria mesenquimales y peor pronóstico 16,17. El advenimiento de los grandes proyectos de secuenciación de escala y la acumulación de numerosas muestras de pacientes disponibles para la prueba trae una gran cantidad de nueva información con respecto a las mutaciones genéticas y las vías implicadas en GBM patogenia y la progresión y la posibilidad de la medicina individualizada, donde las terapias pueden ser adaptados específicamente a las anomalías genéticas del paciente. En última instancia, para evaluar el valor predictivo de estas mutaciones y las vías de manera sistemática, y para probar posibles tratamientos en cada caso, requiere modelos animales de GBM con alteraciones genéticas predeterminados. Transposón de integración mediada de ADN genómico ofrece un enfoque viable.
El sistema transposón Bella Durmiente, miembro de la / clase mariner Tc1 de transposones, se "despierta" (construido) en un proce múltiples pasosss de mutagénesis específica de sitio de un gen de transposasa salmónidos, que se convirtió en estado latente hace más de 10 millones años 18,19. En esencia, transposones de ADN flanqueados por secuencias específicas (repeticiones invertidas / repeticiones directas: IR / DR) se pueden integrar en el genoma de una manera de "cortar y pegar" por medio de la actividad de la transposasa Bella Durmiente. La transposasa reconoce los extremos de los sitios de IR, escinde el transposón y la integra aleatoriamente en otro sitio de ADN entre las bases T y A, bases que se duplican en cada extremo del transposón durante la transposición (Figura 1a). La transposasa Bella Durmiente se compone de tres dominios, un dominio de unión transposón, una secuencia de localización nuclear y un dominio catalítico. Se requieren cuatro moléculas de transposasa para llevar a los dos extremos del transposón juntos y permitir la transposición, sin embargo, si demasiadas moléculas de transposasa están presentes, pueden dimerizar y tetramerizarse para inhibirla reacción de transposición 20. Una reacción de transposición eficiente requiere una relación óptima de transposasa de transposones. El ADN que codifica la transposasa puede ser entregado en el mismo plásmido con el transposón (en cis) o en un plásmido diferente (en trans). Para asegurar la relación óptima entre la transposasa y los transposones, un promotor con una actividad adecuada puede ser elegido para la expresión de la transposasa (para el modelo "cis") o la proporción de los plásmidos en la solución de inyección pueden ser optimizados (para el modelo "trans"). El sistema transposón Bella Durmiente puede ser utilizado con éxito para la genómica funcional, mutagénesis de inserción, la transgénesis y la terapia génica somática 21. Al ser una construcción sintética re-ingeniería a una molécula funcional de una variante salmonoides latente, la transposasa Bella Durmiente no se une a otros transposones en seres humanos u otros mamíferos 20. Desde su descubrimiento, la ingeniería molecular tiene enhanced la eficacia transposición del sistema de transposón SB a través de cambios en las secuencias de IR y adición de dinucleótidos TATA que flanquea el transposón, resultando en los transposones pT2. Estos transposones han optimizado la unión de la SB para el sitio de infrarrojos y una mayor eficacia de la escisión. La transposasa SB también se sometió a una mejora significativa; la transposasa utilizado en los experimentos presentados en el presente documento es el SB100X, una transposasa hiperactiva generado por una estrategia de barajado de ADN seguido por una pantalla genética a gran escala en células de mamíferos 22.
En este informe se presenta un método rápido, versátil y reproducible para inducir GBM intrínseca en ratones con la integración no viral, transposón mediada de ADN plásmido en células de la zona sub-ventricular de ratones recién nacidos 23. Presentamos una manera simple de crear transposones con nuevos genes susceptibles para la integración genómico utilizando la transposasa Bella Durmiente y demostrar cómo supervisar plásmido captación yprogresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia. También nos caracterizamos características histológicas e inmunohistoquímicos de la MBG reproducido con este modelo. Además, se presenta un método rápido para generar líneas de células primarias de GBM de estos tumores. El modelo de la Bella Durmiente, en el que los tumores son inducidas a partir de células originales al animal, permite la evaluación funcional de la función de los genes candidatos GBM en la inducción y progresión de los tumores. Este sistema también es muy adecuado para el ensayo de nuevos tratamientos GBM, incluyendo terapias inmunes en ratones inmunocompetentes, sin la necesidad de procedimientos quirúrgicos invasivos inflamatorias, que pueden alterar el microambiente local.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, te detallamos un método versátil y reproducible para la generación de nuevos modelos de GBM mediante la integración SB transposase- mediada de ADN plásmido oncogénica en células que rodean la zona subventricular de ratones recién nacidos. Se presenta un protocolo para generar plásmidos transposón con nuevos genes de interés, ilustramos cómo monitorizar la progresión de los tumores en los animales vivos, y cómo caracterizar rasgos histopatológicos y inmunohistoquímicos de estos tumores….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
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