Introduction
الأشكال ورم أرومي دبقي (GBM) هو الأكثر شيوعا (60٪) ورم في المخ الأولية في البالغين، مع بقاء متوسط 15-21 شهرا عندما تعامل مع الجراحة، العلاج الإشعاعي، والعلاج الكيميائي 1. علاجات جديدة لGBM أمر لا بد منه. تتطلب العلاجات التجريبية اختبار في النماذج الحيوانية التي تتكاثر على نحو كاف السمات البارزة من الأمراض التي تصيب البشر. استراتيجيات للحث على GBM في ما يلي القوارض الطفرات الكيميائية مع وكلاء مؤلكل، سلالة الجرثومية أو تغيرات جينية جسدية، أو زرع باستخدام خطوط الخلايا دبقي 2. النماذج الأكثر شيوعا توظف غرس خطوط الخلايا دبقي، إما orthotopically، في الدماغ أو تحت الجلد باستخدام خلايا مسانج في الحيوانات مع راثى متطابقة. أو خلايا xenogeneic، خطوط الخلايا GBM الأكثر شيوعا الإنسان، مزروع في المناعي للخطر الفئران 3. Xenografts تقدم العديد من المزايا لدراسة الأورام داخل الجمجمة: راحة استنساخ، standaمعدلات النمو rdized، وقت وفاة والأورام توطين. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها قيود بسبب النهج الاصطناعي، والغازية الجراحية المستخدمة لزرع وقدرة محدودة على إعادة إنتاج بدقة النسيجية السمات المميزة لGBM البشري (الصف منظمة الصحة العالمية IV): شبه pallisading نخر، atypias النووية، والغزو منتشر، الانتشار الأوعية الدموية الصغيرة وتشكيل الأوعية الدموية glomeruloid شذوذ 4-7. تحريض GBM عن طريق تغيير جينوم الخلايا الجسدية مع DNA أنكجنيك، إما مع ناقلات فيروسية 8-12، أو مع بوساطة ينقول التكامل 13، يستنسخ أكثر عن كثب مسببات الأمراض التي تصيب البشر ويلخص ميزات HISTO المرضية من GBM البشري.
تاريخيا، أورام الجهاز العصبي المركزي وقد تم تصنيفها على أساس الخلية ينظر المنشأ، والتي لوحظ، سيكون عاملا التنبؤي للبقاء على قيد الحياة 14. وتصنف GBMS في الابتدائي والثانوي. الناشئة أدلة تودAY يشير إلى طبيعة غير متجانسة للغاية من ورم أرومي دبقي الأساسي 15. GBM الثانوي (15٪)، نتيجة التحول السرطاني للastrocytomas الدرجة المنخفضة (WHO الصف الأول) وastrocytomas anaplasic (WHO الصف الثاني)، وترتبط مع بداية سابق من هذا المرض، وتحسين أحوال الطقس ونمط "proneural" في التعبير الجيني ، في حين GBM الأساسي (85٪) تظهر بداية الراحل، وسوء أحوال الطقس والدبقية (الكلاسيكية)، العصبية أو أنماط التعبير الوسيطة. إذا كانت هذه أنماط التعبير الجيني ترتبط مع الخلية الفعلية منشأ الورم لا يزال قيد التحقيق بنشاط. تراكم البيانات يدل على أن الجمع بين الطفرات الجينية المرتبطة GBMS هم التنبؤي من أجل البقاء. على سبيل المثال، ترتبط فقدان heterozygocity (LOH) من الكروموسومات 1P / 19q، والطفرات IDH1، PDGFRα التكبير، مع GBMS الثانوي، نمط التعبير proneural وأفضل التكهن، في حين EGFR overexpression، الشق وسونيك تفعيل مسار القنفذ، NFوترتبط 1 و PTEN الخسارة والطفرات من البروتين p53 مع العصبية، الكلاسيكية، أو GBM الأساسي الوسيطة وأسوأ التكهن 16،17. ظهور مشاريع التسلسل واسعة النطاق وتراكم العديد من عينات المرضى متوفرة للاختبار يجلب ثروة من المعلومات الجديدة فيما يتعلق الطفرات الوراثية ومسارات المتورطين في GBM المرضية والتقدم وإمكانية الطب الفردي، حيث العلاجات يمكن أن تكون مصممة خصيصا ل تشوهات الوراثية للمريض. في نهاية المطاف، لتقييم القيمة التنبؤية لهذه الطفرات والممرات بطريقة منهجية، واختبار العلاجات الممكنة في كل حالة، يتطلب نماذج حيوانية من GBM مع تغيرات جينية محددة مسبقا. ينقول التكامل بوساطة من الحمض النووي الجيني يقدم نهجا عمليا.
كان النوم نظام ينقول الجمال، عضو TC1 / فئة بحار من الترانسبوزونات، "أيقظ" (شيد) في متعددة الخطوات اإلجراءاتSS من الطفرات الموقع محددة من الجين ترانسبوزاز salmonoid، والتي أصبحت نائمة أكثر من 10 مليون سنة مضت 18،19. في جوهرها، الترانسبوزونات DNA يحيط بها سلاسل محددة (يكرر مقلوب / يكرر المباشرة: IR / DR) ويمكن دمجها في الجينوم في "قص ولصق" الطريقة عن طريق نشاط ترانسبوزاز الجمال النائم. وترانسبوزاز يعترف ينتهي من المواقع الأشعة تحت الحمراء، المكوس وينقول ويدمج بشكل عشوائي في الموقع DNA آخر بين القواعد T و A، والقواعد التي تتكرر في كل نهاية ينقول خلال تبديل (الشكل 1A). وتتألف ترانسبوزاز الجمال النائم من ثلاثة مجالات، وهي ملزمة ينقول المجال تسلسل توطين النووية ومجال الحفاز. يرجى ملء أربعة جزيئات ترانسبوزاز لجلب طرفي ينقول معا والسماح للتبديل، ولكن إذا الكثير من جزيئات ترانسبوزاز موجودة، فإنها يمكن أن dimerize وtetramerize لمنعرد الفعل تبديل 20. يتطلب رد فعل تبديل كفاءة والنسبة المثلى من ترانسبوزاز إلى الترانسبوزونات. يمكن أن يتم تسليم DNA ترميز ترانسبوزاز على نفس بلازميد مع ينقول (في رابطة الدول المستقلة) أو على البلازميد مختلفة (في العابرة). لضمان النسبة المثلى بين ترانسبوزاز والترانسبوزونات، المروج مع النشاط الكافي ويمكن اختيار لتعبير عن ترانسبوزاز (ل"رابطة الدول المستقلة" نموذج) أو نسبة من البلازميدات في حل الحقن يمكن أن يكون الأمثل (ل نموذج "المتحولة"). والنوم نظام ينقول الجمال يمكن استخدامها بنجاح لعلم الجينوم وظيفية، والطفرات إقحامي، transgenesis والعلاج الجيني الجسدي 21. ويجري بناء الاصطناعية إعادة تصميم لجزيء وظيفية من البديل salmonoid نائمة، وترانسبوزاز الجمال النائم لا ربط الترانسبوزونات أخرى في البشر أو غيرها من الثدييات 20. منذ اكتشافه، والهندسة الجزيئية لها تعزيز إمكانيةإد فعالية تبديل النظام ينقول SB من خلال التغييرات في تسلسل IR وإضافة dinucleotides TATA المرافقة ينقول، مما أدى في الترانسبوزونات PT2. وقد الأمثل هذه الترانسبوزونات ملزم للSB الى الموقع IR وزيادة فعالية الختان. كما خضع ترانسبوزاز SB تحسنا كبيرا. وترانسبوزاز المستخدمة في التجارب المقدمة في هذه الوثيقة هو SB100X، وهو ترانسبوزاز مفرط الناتجة عن استراتيجية خلط DNA يليها شاشة الوراثية على نطاق واسع في خلايا الثدييات 22.
في هذا التقرير نقدم طريقة سريع، وتنوعا وقابلة للتكرار للحث جوهري GBM في الفئران مع غير الفيروسية، والتكامل بوساطة ينقول من DNA البلازميد في الخلايا من منطقة البطين-فرعية من الفئران حديثي الولادة 23. نقدم طريقة بسيطة لخلق الترانسبوزونات مع جينات جديدة قابلة للتكامل الجيني باستخدام ترانسبوزاز الجمال النائم وشرح كيفية مراقبة امتصاص البلازميد وتطور المرض باستخدام تلألؤ بيولوجي. نحن أيضا تميز النسيجية والمناعية النسيجية ملامح GBM تتكرر مع هذا النموذج. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة سريعة لتوليد خطوط الخلايا GBM الأولية من هذه الأورام. نموذج الجمال النائم، والتي تنجم أورام من الخلايا الأصلية للحيوان، ويسمح التقييم الوظيفي للدور المرشح الجينات GBM في تحريض وتطور الأورام. كما يناسب هذا النظام بشكل جيد لاختبار العلاجات GBM جديدة، بما في ذلك العلاجات المناعية في الفئران المناعية المختصة، من دون الحاجة إلى عمليات جراحية التهابات الغازية، الأمر الذي قد يغير المكروية المحلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من جامعة ميشيغان جنة لاستخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA).
1. الاستنساخ من تسلسل الاهتمام في نيو النوم ترانسبوزونات الجمال
ملاحظة: لإدراج الجينات أو العناصر المثبطة (كما shRNA) باستخدام نظام النوم ترانسبوزاز الجمال، استنساخ تسلسل الفائدة في العمود الفقري لPKT أو PT2 البلازميد. توجيه الاستنساخ مثل أن العناصر التنظيمية، والجينات في المصالح وعلامات تظل يحيط بها يكرر مقلوب (IR / DR). مثال على استنساخ PDGFβ إلى هو مفصل أدناه العمود الفقري PKT (انظر أيضا الشكل 1B).
- هضم 5 ميكروغرام من ناقلات البلازميد PKT-IRES-Katushka لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية مع 5-10 وحدات من XbaI / XhoI أنزيمات التقييد في 50 ميكرولتر من حجم رد الفعل.
- هضم mPDGFβ [كدنا من 5 ميكروغرام من البلازميد pGEM-T- mPDGFβ لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية مع 5-10 وحدةالصورة من جنة التحقيق الوطنية السودانية / ساسي الانزيمات قيود.
- ترسيب الحمض النووي الكلي بإضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪، و1/10 حجم 3 M نا خلات، ودرجة الحموضة 5.8 واحتضان بين عشية وضحاها في -20 ° C.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 13،800 x ج لمدة 15 دقيقة.
- غسل بيليه الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪، الطرد المركزي في 13،800 x ج لمدة 1 دقيقة، كرر مرة واحدة واعادة تعليق في 19 ميكرولتر من المياه مجانا الدناز العقيمة.
- اتبع تعليمات الشركة الصانعة في تصد كيت السريع لفظة نهايات كل من ناقلات (PKT-IRES-Katushka) وتضاف (mPDGFβ).
- تحميل ناقلات اضعافها وتضاف على 1.2٪ بروميد إيثيديوم الملون agarose هلام وتشغيلها في 80 V لمدة 40 دقيقة. تصور العصابات، واستئصال لهم نظيفة الحلاقة شفرة وهلام تنقية الحمض النووي باستخدام طقم تنقية جل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- Ligate إدراج وناقلات DNA تنقية في الخطوة 1.7 عن طريق إضافتها في أنبوب في نسبة 4: 1 المولي (إدراج: ناقلات). في هذا الأنبوب، صipette 1 ميكرولتر من T4 يغاز و 2 ميكرولتر من T4 يغاز العازلة (التي تحتوي على ATP)، وضبط مستوى الصوت إلى 20 ميكرولتر مع الماء المعقم. احتضان رد فعل لمدة 18 ساعة ربط في 16 ° C.
- تحويل الخلايا البكتيرية DH5α المختصة كيميائيا مع المنتجات و ligated.
- ذوبان الجليد الخلايا المختصة على الجليد.
- إضافة وحدة التخزين بالكامل من رد فعل ربط إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة، هز بلطف أنبوب واحتضان هذا المزيج على الجليد لمدة 30 دقيقة. للحرارة صدمة البكتيريا لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية، والعودة فورا إلى جليد. احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة أخرى.
- إضافة 950 ميكرولتر من مرق لوريا للثقافة واحتضان مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. البكتيريا الطرد المركزي في 2،400 x ج لمدة 3 دقائق وإعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من LB.
- انتشار البكتيريا تتحول على طبق بتري المغلفة مع LB-الاغاروز والمضادات الحيوية المماثلة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- وأخيرا، وجمع 5-10 bacteالمستعمرات الريال والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5 مل من LB وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية.
- تنقية DNA البلازميد باستخدام مصغرة عدة DNA البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إجراء قيود التشخيص هضم للتحقق من التأسيس السليم للإدراج في ناقلات وتقديم استنساخ إيجابية لتسلسل الحمض النووي لضمان التوجه الصحيح للإدراج.
- حدد المستعمرات الصحيحة وزيادة إنتاج الحمض النووي باستخدام عالية الجودة، والذيفان الداخلي خالية بلازميد إعداد عدة.
- أزل الحمض النووي في الماء المعقم أو 1 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك. متجر DNA في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للحقن في حديثي الولادة.
2. البينية البطين حديثي الولادة الحقن
- ثلاثة إلى أربعة أسابيع قبل أن يجرب، وإنشاء الماوس تربية قفص مع ذكر واحد وأنثى واحدة الماوس، والبلاستيك الملونة القباني. وهذا يوفر بيئة غنية ويساعد في عملية التزاوج.
- عندما يتم تأكيد الحمل، وإزالة ممزر إلى قفص جديد. بعد ثمانية عشر يوما التزاوج، ومراقبة القفص يوميا للتسليم. أداء الحقن داخل البطين في يوم ما بعد الولادة 1 (P1).
- إعداد الحل الحقن
ملاحظة: يتم حل حقن عن طريق خلط DNA البلازميد مع كاشف ترنسفكأيشن لخلق الجسيمات لترنسفكأيشن. فيما يلي مثال على إعداد الحل الحقن باستخدام ترميز البلازميد في ترانسبوزاز الجمال النائم وluciferase المراسل: PT2 / SB100x لوك واثنين من البلازميدات ينقول: PT / CAGGS-NRASV12 و PT / CMV-SV40-LGT، بنسبة 1: 2: 2. جميع البلازميدات لديها تركيز 2 ميكروغرام / ميكرولتر. يتم عرض تفاصيل مهمة على إعداد الحل الحقن في مناقشة.- تحضير محلول الحمض النووي عن طريق إضافة: 4 ميكروغرام (2 ميكرولتر) من PT2 / SB100x لوك، 8 ميكروغرام (4 ميكرولتر) من PT / CAGGS-NRASV12 و 8 ميكروغرام (4 ميكرولتر) من PT / CMV-SV40-LGT و 10 ميكرولتر 10٪ نسبة الجلوكوز إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر بتركيز 1 ميكروغرام / ملDNA و 5٪ جلوكوز.
- إعداد الحل PEI بإضافة 2.8 ميكرولتر من المجراة طائرة PEI، 7.2 ميكرولتر من الماء المعقم، و 10 ميكرولتر من 10٪ الجلوكوز إلى تركيز النهائي من 5٪ جلوكوز.
- إضافة الحل PEI إلى حل DNA، ومزيج دوامة وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. والحل هو الآن على استعداد للحقن. بعد ساعة واحدة على RT، والحفاظ على حل على الجليد.
- تناسب 10 ميكرولتر حقنة نظيفة مجهزة قياس 30 إبرة تحت الجلد مع 12.5 ° شطبة في micropump (الشكل 2 # 1).
- للتحقق من حسن سير العمل في نظام الحقن، واستخدام محقن التلقائي (الشكل 2 # 1) لسحب 10 ميكرولتر من الماء في حقنة ثم إفراغ الحقنة تماما
- تبريد مرحلة التجسيمي حديثي الولادة (الشكل 2 # 3) مع الطين من الجليد الجاف والكحول لدرجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
- لحث التخدير عن طريق وضع الجراء على الجليد الرطبلمدة 2 دقيقة. ستواصل التخدير على الإطار التجسيمي المبردة للفترة المتبقية من هذا الإجراء. الحفاظ على درجة حرارة الإطار فوق درجة التجمد، بين 2-8 درجة مئوية وتفادي وقوع إصابات الحروق الحرارية. كما الجراء الاحتياطات الخاصة يمكن أن تكون ملفوفة في الشاش قبل وضع على الجليد الرطب.
- ملء المحاقن مع الحل DNA / PEI.
- شل الجرو في إطار التجسيمي عن طريق وضع رأسه بين الشاش تغطيها القضبان الأذن (الشكل 2B). تأكد من أن الجانب الظهري من الجمجمة هو أفقي، موازية لسطح الإطار، والتي الغرز في الجمجمة واضحة للعيان. مسح الرأس مع الايثانول 70٪.
- خفض إبرة المحقنة وضبط الإحداثيات التجسيمي باستخدام بطلب من الإطار التجسيمي حتى تلامس الإبرة قيمة لامدا (تقاطع خط الوسط من الجدارية القفوية والعظام) (الشكل 2B).
- رفع الإبرة وضبط الإحداثيات التجسيمي إلى 0.8 ملم الجانبي و 1.5 مترم منقاري إلى امدا (الشكل 2B).
- خفض الإبرة حتى يلمس والدمامل قليلا الجلد. قياس الإحداثيات. خفض إبرة 1.5 ملم أخرى. سوف إبرة تخترق الجلد والجمجمة، وتمر عبر القشرة لدخول البطين الجانبي (الشكل 2C).
- باستخدام محقن التلقائي، وضخ 0.75 ميكرولتر من محلول الحمض النووي / PEI بمعدل 0.5 ميكرولتر / دقيقة
- إبقاء الجرو على الإطار لمدة دقيقة أخرى لإتاحة الفرصة لإيجاد حل لتفريق إلى البطينين. في غضون ذلك، تخدير الجرو آخر، على الجليد لمدة 2 دقيقة في التحضير للحقن المقبل.
- بلطف وببطء رفع الإبرة، ووضع الجرو تحت مصباح التدفئة. مراقبة التنفس والنشاط. إذا لزم الأمر، وتوفير التحفيز لطيف من أطرافه حتى تستتبعه الأول التنفس.
- العودة الجرو لأمه بعد أن استعد، قد وصلت إلى اللون الوردي، والتنفس بانتظام ونشطة، عادة 5-7 دقيقة. إذا موإعادة من يتم حقن الجرو في وقت واحد، والحفاظ على جميع الجراء معا حتى تتم جميع الحقن. إذا الحقن يستغرق وقتا أطول من 30 دقيقة، والعودة من نصف الجراء بعد دقيقة 30 الأول وبقية في نهاية هذا الإجراء.
- مراقبة أن السد هو استجابة ورعاية ودعم لالجراء لها. إذا لزم الأمر، إضافة أمي البديلة إلى القفص.
- ضمان أن الفاصل الزمني بين وضع الجرو على الجليد ووضعه تحت مصباح الاحترار هو أقل من 10 دقيقة. وأسرع الإجراء كان ذلك أفضل للبقاء على قيد الحياة. عادة، والوقت الذي يستغرقه لتخدير وحقن الجرو هو 4 دقائق.
3. ضوء بارد رصد تشكيل الورم والتقدم
3.1) رصد البلازميد امتصاص بعد حقن
- 24-72 ساعة بعد الحقن، وإزالة جميع الجراء من قفص الأم ومكان في 6 نظيفة جيدا طبق زراعة الأنسجة، والجرو واحد لكل بئر.
- إعداد 30 ملغ / مل من حل وسيفيرين المذاب في محلول ملحي أو الفوسفاطالبريد العازلة. يعد هذا الحل مقدما والبقاء على مأخوذة صغيرة في -20 ° C.
- باستخدام حقنة 1 مل مجهزة قياس 30 إبرة تحت الجلد حقن 30 ميكرولتر من وسيفيرين تحت الجلد بين الكتف من الجرو. تأكد من أن إبرة لا تخترق أي أجهزة، عن طريق معسر الجلد ورفعه قليلا قبل إدخال الإبرة.
- الصورة فورا، وذلك باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير. لطيف IVIS، استخدام الإعدادات التالية لعمليات الاستحواذ: التعرض التلقائي، binning كبير، وفتحة F = 1.
3.2) تشكيل رصد الورم والتقدم
ملاحظة: سوف تبدأ الحيوانات تكوين الاورام العيانية للكشف من قبل تلألؤ بيولوجي والأنسجة داخل 2½-6 أسابيع، اعتمادا على البلازميدات أنكجنيك حقن.
- باستخدام حقنة 1 مل مزودة إبرة قياس 26 حقن 100 ميكرولتر من 30 ملغ / مل حل وسيفيرين داخل peritoneally.
- وضع الحيوان في غرفة التخدير. ضخ ما يصل إلى خمسة حيوانات في نفس الوقت.
- انتظر 5 دقائق ثم بدء تدفق الأوكسجين / الأيزوفلورين (1.5-2.5٪ الأيزوفلورين) لتخدير الحيوانات. بعد 3-4 دقائق، وإزالة الحيوانات من غرفة التخدير، وبدء تدفق الأوكسجين / الأيزوفلورين في غرفة تلألؤ بيولوجي. وضع الحيوانات في فتحات منها مجهزة المخاريط الزجاج الأنف للسماح للتخدير والمرور دون عائق للضوء.
- عادة، والحصول على سلسلة من 6 صور، في 2 دقيقة مع فترات ومدة التعرض التلقائي، binning متوسط وفتحة المفتوحة و = 1.
- تعيين المنطقة من الفائدة لجميع الحيوانات تصويرها، وعادة بيضاوي على منطقة الرأس، وقياس كثافة التلألؤ باستخدام وحدات الفوتونات معايرة / ق / سم 2 / ريال.
- تسجيل القيمة القصوى لكل حيوان. وفي وقت لاحق، يمكن مقارنة التسجيلات خلال تطور الورم لكل حيوان و / أو بين الحيوانات، على سبيل المثال عرجن يعملون العلاجات المختلفة.
4. التركيب النسيجي والمناعى تحليل جديد GBMS
ملاحظة: عندما وصلت إلى أورام المطلوب التجريبية الوقت نقطة، والحيوانات يمكن التضحية، والعقول perfused ل، الثابتة وتحليلها. من أجل البقاء يحلل تمثل مرحلة الاحتضار نقطة نهاية التجربة، وعندما يتم التضحية الحيوانات معاملة إنسانية في أول علامات عبء الورم، على النحو المحدد في المرحلة السريرية عندما يصبح الحيوان تبين أعراض ضعف الحركة، وموقف منحنية والفراء ضيع. ويرد وصف موجز لأساليب النسيجية والمناعية النسيجية القياسية المستخدمة أدناه.
4.1) الإرواء والتثبيت
- تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغم / كغم من زيلازين.
- تحقق منعكس دواسة عن طريق معسر القدم من الفأرة. عندما يتم إلغاء هذا المنعكس، مشيرا إلى التخدير العميق، IMMOBilize الماوس على لوحة التشريح مع دبابيس، وفتح تجويف البطن، تشريح الحجاب الحاجز وفتح التجويف الصدري لتصور القلب.
- إدراج حادة قياس 20 قنية إلى البطين الأيسر من القلب. توصيل قنية مع أنابيب بلاستيكية تمر مضخة تمعجية إلى حاوية مع حل تايرود المؤكسج وheparinized (0.8٪ كلوريد الصوديوم، 0.0264٪ CaCl 2 2H 2 O، 0.005٪ ناه 2 PO 4، 0.1٪ الجلوكوز، 0.1٪ NaHCO 3، 0.02 ٪ بوكل). بدء تدفق حل تايرود عن طريق ضبط سرعة مضخة تمعجية لضمان تدفق بطيء ومستمر، قطرة واحدة تقريبا في الثانية أو أقل إذا الحيوانات هي أصغر.
- إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب للسماح نزيف الدم وعلى تايرود.
- مراقبة كفاءة الارواء من خلال مراقبة ابيضاض من الأعضاء الداخلية (الأكثر وضوحا في الكبد والكلى) عندما تصبح خالية من الدم.
- عندماحل استنزاف من القلب هو واضح (3-5 دقيقة)، والتحول من الحلول لتايرود إلى 4٪ بارافورمالدهيد لتثبيت (4٪ PFA، ودرجة الحموضة 7.34 في الفوسفات مخزنة المالحة).
- مراقبة التثبيت الجيد للأنسجة التي كتبها جمود زيادة من الرقبة والذيل.
- قطع رأس الفأر وتشريح بعناية الدماغ من الجمجمة.
- سحب الفراء الذي يغطي الجمجمة rostrally، نحو الأنف، والاستيلاء عليها بقوة لتحقيق الاستقرار في الرأس، حتى الجانب الظهري.
- باستخدام مشرط حاد، وقطع أسفل على طول حافة المدار، إلى القطع العضلات المدارية والأقواس الوجني الأساسية.
- بدوره رئيس الجانب بطني حتى وإزالة عضلات الرقبة المرفقة باستخدام مقراض. سحق فقرة الأولى وإزالته من جذع الدماغ.
- تصور القوقعة، والاستيلاء على العظم الصدغي المغطي مع مقراض وخلق الافتتاح بين العظم الصدغي والقذالي. تقشر عظم القذالي من سطح المخيخ.
- تحويل رأس بطني حتى الجانب. سوف الدماغ تنزلق من تبقى من الجمجمة، وترتبط الآن فقط من خلال الأعصاب القحفية. قطع باستخدام مقص صغير على حاسة الشم، والأعصاب البصرية مثلث التوائم. هذا وسوف الافراج عن الدماغ.
- وضع الدماغ في 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لمدة ما بعد التثبيت.
- للتحليل النسيجي والهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ، ونقل العقل لعازلة الفوسفات لمدة 24 ساعة ومن ثم المضي قدما إلى تضمين البارافين.
- لتحليل المناعية النسيجية، ونقل العقول في حل السكروز 30٪ في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 24-48 ساعة (حتى أدمغة تنزل الى قاع الأنبوب)
- أدمغة القسم في النصف عن طريق الوسط للمنطقة الورم، ووضع قطعالجانب السلبي في قالب التجميد، تضمين في وسائل الإعلام تضمين البرد (OCT المركبة)، وفلاش للتجمد في الطين من الايثانول الجاف الجليد، isopentane الجاف الثلج أو في النيتروجين السائل. إبقاء الكتل المجمدة في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء وتلطيخ.
4.2) الهيماتوكسيلين-يوزين تلطيخ من البارافين جزءا لا يتجزأ من العقل لتحليل-HISTO المرضية للجوهري GBMS
- قسم البارافين جزءا لا يتجزأ العقول في 4 ميكرون سمك، وانخفاض في 42 ° C حمام الماء وجبل على الشرائح الزجاجية.
- الشرائح دي paraffinize عن طريق وضعها لمدة 10 دقيقة في فرن C 60 درجة ومن ثم نقلهم إلى 5 فترات دقيقة من خلال سلسلة من ثلاث حاويات الشريحة مليئة زيلين.
- هيدرات الشرائح من خلال سلسلة من الحمامات الايثانول: الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة، كرر مرة واحدة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة، كرر مرة واحدة، و 70٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ثم نقل الشرائح في الماء.
- وصمة عار على الشرائح عن طريق غمس لهم في وعاء الشريحة مليئة هاريس الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة.
- شطف في ماء الصنبور حتى الماء هو واضح.
- تراجع الشرائح مرتين إلى حل الصبغة الزرقاء (0.1٪ بيكربونات الصوديوم).
- السماح الشرائح تقف في ماء الصنبور لمدة 2 دقيقة، ثم نقل إلى 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة.
- وصمة عار على الشرائح عن طريق غمس لهم في حاوية مليئة يوزين لمدة 5 دقائق.
- يذوى الشرائح في سلسلة من الحمامات الايثانول (80٪ من الإيثانول 3-4 الانخفاضات، 95٪ من الإيثانول 2 دقيقة، كرر مرة واحدة، و 100٪ من الإيثانول 2 دقيقة، كرر مرة واحدة).
- واضح مع 3 حمامات متتالية من الزيلين، 3 دقائق لكل منهما.
- ساترة مع المتوسطة المتزايدة على أساس الزيلين واسمحوا الجافة على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للتصوير. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
4.3) المناعي الكيمياء النسيجية من البرد حفظا المخ جزءا لا يتجزأ من لالجزيئية والخلوية توصيف دي نوفو المستحثة GBMS
- استرداد القطع المجمدة من التخزين C -80 درجة، ضع في ناظم البرد والسماح للتوازن درجات الحرارة لمدة 30 دقيقة.
- القسم 12-14 ميكرون أبواب سميكة وجبل 2-3 أقسام على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة. قطع أقسام متسلسل، من خلال جمع الأجزاء المجاورة على الشرائح المختلفة. وهذا يسمح للتلطيخ مع الأجسام المضادة مختلفة على أقسام الأنسجة المجاورة داخل الورم.
- الشرائح الجافة في مجفف لا يقل عن 1 ساعة بعد باجتزاء للسماح لالتزام جيد من الأنسجة.
- خلق حاجز مسعور (مع علامة مسعور) في نهاية كل من الشريحة للسماح للسائل لتغطية أقسام والبقاء على الشريحة خلال يغسل. تغطية أقسام بمحلول مكون من الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1٪ تريتون-X (PBS 0.1٪ تكساس) ويهز بلطف لمدة 5 دقائق على شاكر الأفقي لpermeabilize الأنسجة. كرر مرتين.
- منع ملزمة انوعي بمحلول مكون من 10٪ مصل الماعز العادي (أو مصل من الحيوانات التي تم رفع الأجسام المضادة الثانوية) لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف
- يعد حل الأجسام المضادة الأولية في 2٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني 0.1٪تكساس و ماصة الحل على أقسام. وضع الشرائح في غرفة رطبة مغطاة في الظلام وتبقى في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، وغسل أقسام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 0.1٪ تكساس واحتضان في الضد الثانوية الفلورية المخفف في PBS 2٪ مصل الماعز العادي 0.1٪ تكساس لمدة ساعة واحدة.
- غسل أقسام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 0.1٪ تكساس، مباين مع وصمة النووية (على سبيل المثال، دابي) لمدة 2 دقيقة، ويغسل مرة أخرى، واضحة في مجال المياه وساترة مع المياه المستندة إلى تصاعد المتوسطة التي من شأنها الحفاظ على مضان. وضع الشرائح على سطح مستو والسماح لهم علاج لمدة لا تقل عن 24 ساعة، في الظلام، حتى جاهزة للتصوير. تبقي على 4 درجات مئوية بعد ذلك.
5. جيل من خطوط الخلايا السرطانية الأولية مع التعديلات الوراثية المحددة.
- لتوليد خطوط الخلايا النائمة من الفئران الحاملة للورم تحديد ماوس مع وأكد ورم كبير (تلألؤ بيولوجي 10 -10 7 8 الفوتونات / ق / سم2 / ريال سعودي).
- الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من مخدر الأيزوفلورين، قطع رأس الحيوان وبعناية تشريح الدماغ من الجمجمة (كما هو موضح في القسم 4). وضع الدماغ في طبق بيتري نظيفة.
- باستخدام شفرة حلاقة، وجعل التخفيضات الاكليلية الأمامي والخلفي للورم. موقع الورم عادة ما يكون التعرف عليها نظرا لشفافية الدماغ.
- تشريح الورم، عادة 5-7 ملم في القطر مع ملقط غرامة ووضعه في أنبوب 1.5 مل مليئة 300 ميكرولتر العصبية وسائل الإعلام الخلايا الجذعية (NSC وسائل الإعلام: DMEM / F12 مع B-27 ملحق، ملحق N2، وNormocin، على أن تستكمل مع EGF المؤتلف البشري وbFGF بتركيز 20 نانوغرام / مل لكل منهما).
- التجانس بلطف الورم مع مدقة البلاستيكية، التي تناسبها على الجدران من الأنبوب.
- إضافة 1 مل من محلول التفكك الأنسجة الخالية من الإنزيم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر، وغسل مصفاة مع 10 مل منوسائل الإعلام NSC، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 4 دقائق، طاف صب وإعادة تعليق بيليه إلى 7 مل من وسائل الاعلام NSC.
- لوحة على قارورة ثقافة T25 والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الأنسجة مع والغلاف الجوي من 95٪ الجوية و 5٪ CO 2. بعد 3 أيام، وقتل بعض الخلايا، وبعض انضمت إلى قاع الطبق الثقافة، وبعضها neurospheres تشكيل، وتطفو بحرية في وسائل الإعلام.
- إزالة هذه الخلايا مع وقف التنفيذ وإعادة لوحة على ثقافة قارورة الأنسجة T75.
- بعد ثلاثة أيام أخرى للثقافة، وجمع neurospheres، فصل كما هو موضح في الخطوة 5.6، سلالة من خلال مصفاة الخلية وعدد الخلايا. تجميد aliquots من الخلايا في الجنين مصل بقري 10٪ DMSO والخلايا في مناطق ذات كثافة مرور واحد مليون خلية في 14 مل من NSC تستكمل مع EGF وجمعية جيل المستقبل لقارورة T75. سوف يعتمد معدل النمو على الجينات المسرطنة المستخدمة لتوليد أورام. التكيف مع الظروف ثقافة الخلية لمنع فرط والحفاظ على خلايا بكثافة عالية نسبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوصيف ميزات HISTO المرضية من glioblastomas SB التي يسببها، تم حقن C57 / BL6 الفئران حديثي الولادة في P1 مع luciferase المراسل ترميز البلازميد (PT2 / SB100x لوك) في تركيبة مع البلازميدات ترميز الترانسبوزونات مع DNA أنكجنيك، أي تلك السلطات، (PT / CAGGS -NRASV12) وSV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (الشكل 3C) أو البلازميد ترميز البروتين p53 دبوس الشعر القصير مع PDGFβ ومراسل GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) في تركيبة مع تلك السلطات، (الشكل 3D). تم رصد الحيوانات لتلألؤ بيولوجي اليوم بعد الحقن (الشكل 2A) وبصورة دورية حتى الوصول إلى مرحلة الاحتضار عند الموت الرحيم كانت فيها. ويعرف مرحلة الاحتضار في المرحلة السريرية عندما يصبح الحيوان تبين أعراض ضعف الحركة، والتقوس في الجلوس، والفراء ضيع وفقدان الوزن. في بعض الأحيان، والحيوانات تطوير المضبوطات أو أنماط غير طبيعية من الحركة، مثل المشي في دوائر والقفز المفاجئ. في نهاية الحيوان التجربةتم تخدير الصورة. تم perfused لأدمغة، جزءا لا يتجزأ من البارافين، ومعالجتها لالهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ. وتظهر بيانات الأورام التي تظهر بصمات GBM البشري (الصف منظمة الصحة العالمية IV) مع النزيف (الشكل 3C)،-pallisading الزائفة نخر (الشكل 3E) وغزو ماحول الأوعية ومنتشر في لحمة الدماغ (الشكل الجيل الثالث 3G، و). ويسبق تشكيل pseudopallisades التي تمزق الأوعية glomeruloid كبيرة مع بطائن راشح (الشكل 3I) الذي ينتج في مناطق النزف مع تسلل الهائل للخلايا وحيدات النوى (الشكل 3H). mitoses شاذة (الشكل 3J) والخلايا السرطانية متعددة النوى العملاقة (الشكل 3K) هي أيضا واصمة من GBM البشري.
ولدت Glioblastomas باستخدام نظام النوم ترانسبوزاز الجمال يمكن رصدها في جميع أنحاء تطور نمو الورم مع تلألؤ بيولوجي، إذا البلازميدات ضختترميز luciferase المراسل. يظهر تجربة سبيل المثال في الشكل 4A. الحيوانات عادة ما تستسلم من عبء الورم عندما يصل التلألؤ كثافة من 10 7 -10 9 الفوتونات / ق / سم 2 / ريال. بقاء متوسط الحيوانات يعتمد متوقع على مجموعات من الترانسبوزونات أنكجنيك حقنها في الدماغ حديثي الولادة، كما هو موضح في منحنيات البقاء على قيد الحياة المعروضة في الشكل 4B. لاحظ أن الأورام الأكثر عدوانية والتي يسببها مع تلك السلطات، وSV40 LGT المستضد (بقاء متوسط 30 يوما)، في حين أن متوسط بقاء الحيوانات مع GBM يسببها مع تلك السلطات، shp53 وPDGF هو 62.5 يوما، والحيوانات المحقونة مع shp53 وتلك السلطات 83 يوما.
دي نوفو يمكن وصف الأورام شكلت المناعية الكيميائيه النسيجيه التي كتبها التعبير عنها من جزيئات مميزة من الأورام الدبقية ويبين الشكل 5 ورم الوليد (22 نقطة في البوصة، تلألؤ بيولوجي 2X10 5 الفوتونات / ق / سم 2 / ريال سعودي)، الناجم مع shp53وتلك السلطات. البلازميد shp53 حقن بترميز البروتين الفلوري الأخضر ل(GFP) للسماح بتحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وذريتها (PT2 / shp53 / GFP). GFP + ورم خلايا تعبر عن وجهة العصبي الخلايا الجذعية علامة nestin وبعض GFP + الخلايا أيضا عن ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP). الشكل 6 يوضح ورم من حيوان المحتضر عند 56 نقطة في البوصة، الورم الذي يسببها أيضا مع shp53 / GFP وتلك السلطات. GFAP العديد من الخلايا النجمية + تحاصر الورم. GFP + ورم خلايا تعبر عن nestin، ولكن ليس GFAP.
وهناك ميزة كبيرة عند استخدام هذه التقنية للحث على GBMS هي القدرة على توليد رواية خطوط الخلايا GBM مع تغيرات جينية فريدة عن طريق الترانسبوزونات حقن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إنشاء خطوط الخلايا مخصصة باستخدام حيوانات معدلة وراثيا مع التركيب الجيني محدد. هذه خطوط الخلايا لها أثرها الفعال في طرح العديد من الأسئلة الميكانيكية باستخدام فحوصات البيوكيميائية. هي مناسبة بشكل مثالي أنهم لدراسات السمية الخلوية مع الفصل روايةemotherapeutic الوكلاء. ويوضح الشكل 7 neurosphere من ورم الجمال النائم يسببها مع shp53، PDGF وتلك السلطات، والتي تبين التعبير عن GFP، والتي يتم ترميز على واحدة من البلازميدات حقن. لاحظ أن التعبير ليس الشديد على قدم المساواة في جميع الخلايا، مما يدل على طبيعة غير متجانسة من هذه الخلايا GBM الأولية.
الشكل (1): (أ) تمثيل تخطيطي يوضح "قص ولصق" الآلية المستخدمة من قبل ترانسبوزاز الجمال النائم لدمج الترانسبوزونات في الحمض النووي الصبغي المضيف وصفت البلازميد ينقول المانحة مع الجينات في المصالح يحيط بها يكرر مقلوب / يكرر المباشرة. (IR / DR، صناديق الأسهم الحمراء) متواليات. وترانسبوزاز SB (الأخضر) بربط IR / DR، المكوس وينقول ويعيد التكامل في ما بين العشوائية TA أزواج قاعدة ثنائي النوكليوتيد على الحمض النووي الصبغي المضيف. (ب) مثال الاستنساخالجين من الفائدة (mPDGFβ) في العمود الفقري لناقلات SB (PKT-IRES-Katushka). متجه SB يحتوي على اثنين من الأشعة تحت الحمراء / DR تكرار تسلسل (الحمراء) والكاسيت التعبير الجيني الذي يتضمن المروج ومحسن متواليات، وهو موقع استنساخ متعددة (MCS، الزرقاء)، ومواقع دخول الريباسي الداخلية (IRES)، وهو مراسل علامة فلوري (Katushka: الأصفر)، وموقع polyadenilation (بوليا). ويرد في pGEMT ناقلات الاستنساخ، والجين الورمي من الفائدة (برتقالي mPDGFβ). يتم تحرير الجين الورمي، ويحيط بها تقييد مواقع محددة (جنة التحقيق الوطنية السودانية / ساسي) من خلال الهضم الأنزيمي، وقلل من قبل انزيم تصد. وخطي ناقلات وقلل أيضا. وأخيرا، يتم إدراج الجين الورمي mPDGFβ في ناقلات المانحة عن طريق رد فعل حادة في نهاية ربط لتوليد البلازميد ينقول الجديد ناقلات: PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة س و هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد التجريبية وأدلة لحقن البطين داخل في الفئران حديثي الولادة (أ) يتم تركيبها إطار التجسيمي (2) مع الأوجه ميكرومتر مع حاقن آلي يحمل حقنة 10 ميكرولتر (4). داخل الإطار U، وتثبيتها إطار محول حديثي الولادة بشكل آمن (3). لوحة التحكم حاقن آلي (1) تسمح لاختيار دقيقة من الحقنة، وحجم ومعدل التدفق (ب) صورة لفأر حديثي الولادة (P1) مع إبرة تدخل في الإحداثيات المطلوبة للحقن في البطين الجانبي: 1.5 مم بطني و 0.8 ملم الوحشي لامدا. (ج) توضيحات من قسم الاكليلية من خلال الدماغ على فأرة الحاسوب حديثي الولادة (P1) تسليط الضوء على أبعاد النسبية وموقف البطينين.
ه = "دائما"> 
الشكل (3): الأورام الناجمة عن النوم مع نظام ينقول الجمال تظهر بصمات النسيجية من GBM الإنسان (أ) صورة ضوء بارد من الأطفال حديثي الولادة الجرو 24 ساعة بعد الحقن داخل البطينات مع البلازميدات ترميز تلك السلطات، SV40 LGT (ب) صورة ضوء بارد من حيوان بالغ (. 50 نقطة في البوصة) مع وجود ورم كبير يسببها مع تلك السلطات، shp53 وPDGF. (ج) Hematoxilin ويوزين وصمة عار لمقطع الاكليلية من دماغ الفأر مطولا مع وجود ورم يسببها مع تلك السلطات، وLGT (28 نقطة في البوصة). (د) القسم الاكليل من دماغ الفأر مطولا مع وجود ورم يحرض مع shp53 تلك السلطات، وPDGF. (ه) Pseudopalisading نخر، السمة المميزة النسيجية من GBM البشري لوحظ في دي نوفو الأورام ولدت. السهم نقاط إلى الخلايا مرتبة في الحواجز المهاجرة بعيدا عن المنطقة الوسطى من نخر (N) (و) و (ز) دي نوفو ولدت الأورام الغازية للغاية، والتي تبين الغزو على طول الأوعية الدموية (ز) ومنتشر (و) في لحمة المخ المعتادة. (ح) المنطقة النزف مع الغزو الهائل من خلايا وحيدات النوى (السهم)، والمرحلة الأولى من مساحة pseudopalisading النخر. (ط) سفينة glomeruloid كبيرة مع البطانة راشح (السهم) في أصل نشرها نزيف داخل الورم الناجم مع تلك السلطات، وSV40 -LgT. (ي) الانقسام شاذة في الخلايا السرطانية (رأس السهم). (ك) الخلايا السرطانية عملاقة مع نوى كبيرة متعددة (رأس السهم).
يمكن رصد الورم الحاملة للحيوانات مع تلألؤ بيولوجي طوال فترة تطور المرض: الشكل 4. ومن المتوقع أن متوسط بقاء الحيوانات عن طريق الجمع بينحقن أنكجنيك DNA. (أ) مثال على آثار للإضاءة الحيوية من لفيف من 7 C57 / BL6 الفئران. لاحظ أن الفئران تستسلم بعد حوالي أسبوع من تلألؤ بيولوجي يصل 10 8 الفوتونات / ق / CM2 / ريال. (ب) منحنيات البقاء على قيد الحياة عينة مقارنة متوسط بقاء الحيوانات مع النوم الأورام الجمال ولدت مع مجموعات بلازميد مختلفة. البقاء على قيد الحياة وسيطة من الأورام التي يسببها مع تلك السلطات، وSV40 LGT هو 30 نقطة في البوصة في حين من الحيوانات مع الأورام الناجمة عن تلك السلطات، مع shp53 وPDGF أو shp53 وتلك السلطات، هو 62.5 نقطة في البوصة أو 83 نقطة في البوصة على التوالي. نقطة في البوصة: آخر أيام الحقن.
الشكل 5: الوليدة العيانية GBM (22 نقطة في البوصة) التي يسببها مع shp53 وتلك السلطات، تظهر التعبير عن nestin وGFAP في GFP + ورم الخلايا (الميكروسكوب متحد البؤر) لوحة (أ) تبين وجود ورم الناشئ معربا عن GFP. لوحة (ب) يمثل نفس المجال تبين التعبير nestin. لوحة
الشكل 6: GBM يسببها مع shp53، تلك السلطات، وPDGF من حيوان المحتضر (56 نقطة في البوصة) تظهر GFP والتعبير nestin في خلايا الورم وتلطيخ وفيرة لناضجة الدبقية GFAP علامة المحيطة الورم لوحة (أ) يمثل وصمة عار نيسل من قسم acoronal. من خلال دماغ الحيوان المحتضر مع ورم (مكثفة الزرقاء تلطيخ ومدمج زيادة الخلوية) التي يسببها النوم مع نظام ينقول الجمال باستخدام shp53، PDGFΒ وتلك السلطات. لوحة (ب)، والقسم المجاور الإكليلي إلى واحد هو موضح في لوحة (أ) ملطخة وصمة عار النووية دابي، والتي تبين التعبير عن GFP في الخلايا السرطانية. لوحة (ج) يمثل صورة مجهرية مبائر من الحدود الورم تظهر التعبير GFP في الورم، التي حددها الكثافة النووية عالية مع دابي. يوضح لوحة (د) نفس مجال الرؤية كما في (أ)، والتي تبين مكثفة التعبير GFAP في الخلايا المجاورة للورم. لوحة (ه) يمثل تراكب لوحات (ج) و (د). لوحة (و) هو صورة مجهرية مبائر من الحدود الورم، والتي تبين GFP التعبير في الخلايا السرطانية. لوحة (ز) يمثل نفس مجال الرؤية كما في (و)، والتي تبين التعبير عن nestin في الخلايا السرطانية. لوحة (ح) هو إسقاط تراكب لوحات (و) و (ز) 
الرقم 7: Neurospheres من ورم الجمال النائم يسببها مع shp53، PDGF وتلك السلطات، بعد 5 أيام في الثقافة، والمرور 2. خلايا يعبرون عن GFP المشفرة على shp53 PDGF بلازميد (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) لوحة (أ) صورة مجهرية brightfield من neurosphere. لوحة (ب) يمثل صورة مجهرية-برنامج التحصين الموسع الفلورسنت من وجهة النظر نفسها كما في (أ) تبين التعبير عن GFP في الخلايا neurosphere. لوحة (ج) يمثل تراكب لوحات (أ) و (ب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، نحن بالتفصيل طريقة تنوعا وقابلة للتكرار لتوليد نماذج جديدة من GBM باستخدام التكامل SB transposase- بوساطة من DNA البلازميد أنكجنيك في الخلايا المحيطة بمنطقة subventricular من الفئران حديثي الولادة. نقدم بروتوكول لتوليد البلازميدات ينقول مع جينات جديدة من الفائدة، وتوضيح كيفية مراقبة تطور الأورام في الحيوانات الحية، وكيفية تميز ميزات HISTO المرضية والمناعية النسيجية لهذه الأورام.
كما مختبرنا (الشكل 3) وغيرها 13 أظهروا، وهذا النموذج يخلق موثوق الأورام مع الخصائص البارزة لGBM البشري بما في ذلك (1) نخر الزائفة التطويق، (2) انتشار الأوعية الدموية، (3) لانمطية نووية، (4) mitoses غير طبيعية و( 5) حول الأوعية والغزو منتشر. استخدام الفئران حديثي الولادة هو الأمثل من وجهة نظر لوجستية، وتوفير إجراء تقني من السهل نسبيا مع الحد الأدنى من المعدات وحد ذاتهاdation الوقت / الانتعاش، مما يسمح لتوليد السريع لعينة أحجام كبيرة من الأورام مع تغيرات جينية محددة. هذه الأورام تتسبب الحيوانات فريسة لعبء الورم مع بقاء متوسط يمكن التنبؤ به يعتمد على تغيرات جينية المستحث. وأخيرا، تم استخدام نموذج SB كشاشة التدخل العلاجية للاستجابة العلاج 24.
هناك العديد من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند إعداد الحلول المستخدمة في الحقن حديثي الولادة. حلول DNA يجب أن تكون عقيمة، الذيفان الداخلي مجانا ومركزة (2-7 ميكروغرام / ميكرولتر) للسماح الحد الأدنى من حجم الحقن. النسبة المثلى من مخلفات النيتروجين في polyethyleneimine (PEI) إلى مخلفات الفوسفات في الحمض النووي (N نسبة / P) هي 7. وهذا يضمن تشكيل المجمعات الجسيمات موجبة الشحنة والتي سوف تربط الأنصاف الأيونية على أسطح الخلايا وسيتم endocytosed. مرة واحدة في السيتوبلازم، وتدفق الاسموزي تسبب الجسيمات للانفجار والإفراج عن encapsulatإد بلازميد الحمض النووي. في الجسم الحي طائرة-PEI حل لديه تركيز 150 ملي كما أعرب مخلفات النيتروجين. وبالنظر إلى أن DNA ميكروغرام واحد لديه 3 نانومول من الفوسفات أنيوني، ومقدار كاشف ترنسفكأيشن ضروري ويمكن حساب مع الصيغة:
ميكرولتر من طائرة في الجسم الحي-PEI = [(DNA ميكروغرام × 3) × N نسبة / P] / 150.
على سبيل المثال، لإعداد 40 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / حل DNA ميكرولتر مع N نسبة / P من 7، 20 ميكروغرام من الحمض النووي المطلوبة. فإن حجم PEI المطلوبة أن يكون 20 * 3 * 7/150 = 2.8 ميكرولتر.
يمكن حقنها يصل إلى خمسة البلازميدات مختلفة في نفس الوقت. التجارب المقدمة في هذه الوثيقة تسليم ترانسبوزاز الجمال النائم في العابرة على البلازميد الذي يشفر أيضا luciferase المراسل (SBLuc). كما ذكر في المقدمة، نسبة الجزيئات ترانسبوزاز إلى الترانسبوزونات مهمة لضمان تبديل الأمثل. النسبة المثلى (التي أنشئت تجريبيا) من البلازميد SB100x إلى TRANSPأصون DNA البلازميد هو 1: 4. وبالتالي، إذا كان أحد يستخدم اثنين البلازميدات ينقول مختلفة، T1 و T2 على سبيل المثال، فإن نسبة SBLuc: T1: T2 سوف تكون 1: 2: 2. أو ما مجموعه 20 ميكروغرام DNA في حل 40 ميكرولتر سوف تكون مختلطة 4 ميكروغرام من SBLuc مع 8 ميكروغرام من T1 و 8 ميكروغرام من T2. لمدة ثلاثة ينقول مختلف البلازميدات ستكون النسبة SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1.33: 1.33: 1.33 ولمدة أربعة الترانسبوزونات: 1: 1: 1: 1: 1.
ومن المفيد للتحقق من امتصاص الحمض النووي البلازميد التي كتبها تلألؤ بيولوجي 24-72 ساعة بعد الحقن. كما الحيوانات تنمو، وزيادة الكثافة البصرية من الفراء والجلد والجمجمة والدماغ، ويمنع رصد تطور الورم حتى وصل الورم حجم عتبة، ما يقرب من 1-2 مم 3 بالنسبة للفئران C57BL6 المصطبغة نحو مظلم. نقل أفضل للضوء هو ممكن في هذه الفئران إذا تم حلق فرائها، أو عند استخدام الفئران مع الأبيض أو أي الفراء.
تحتاج العديد من القيود التي يتعين النظر فيها عند استخدام هذا النموذج. الأول، الجينالمواد التشنج عرض مع البلازميدات حقن يمكن أن تكون متكاملة بشكل عشوائي في الجينوم المضيف في مواقع مختلفة وعدد من النسخ. هذا قد يؤدي إلى التباين بين الخلايا السرطانية وبين الأورام. ثانيا، يتم إدخال DNA أدخلت في المقام الأول إلى intronic TA تكرار تسلسل DNA 25، ومع ذلك، وإمكانية التدخل في ترميز الحمض النووي الجيني المضيف لا يزال قائما. قد يسبب الثالثة، والحقن داخل البطين معدل صغير ولكن مستمر من استسقاء الرأس في الفئران الشابة، التي تصبح مرئية سريريا وأعراض في الأسبوع 3-4th من الحياة. بعض سلالات من الفئران أكثر عرضة للاستسقاء الرأس من غيرها (أي C57 / BL6 أكثر من FVB). لتقليل خطر التسبب في استسقاء الرأس، فمن المستحسن لحقن صغيرة كوحدة تخزين ممكن (أقل من 1 ميكرولتر في C57 / BL6 الفئران)، للتأكد من أن الإبر الحادة، والحلول لها ملوحة منخفضة وتوفير الجراء المتنامية مع المخصب الطعام، من أجل السماح لالتحجر في الوقت المناسب من بون الجمجمةوفاق. وأخيرا، والأورام في مرحلة متأخرة وغالبا ما تضع نخر، والتي لابد من أخذها في الاعتبار عند مراقبة الفئران عن طريق تلألؤ بيولوجي. قراءة أقل قد تشير إلى وجود ورم متقدمة مع مناطق واسعة من النخر وليس بالضرورة قرارا من الورم نتيجة لتلقي العلاج. في نهاية المطاف، يبقى التحليل النسيجي المعيار الذهبي لتقييم تطور الورم.
ظهور الورم بأكمله تسلسل الجينوم في السنوات الأخيرة قد فتحت الباب لاستكشاف دور الجينات الطافرة متكرر في GBM. نموذج الجمال النائم هو الأمثل للتحقق من صحة الجينات المسرطنة المحتملة أو المكثفات الورم. كما في المثال المذكور في هذه الورقة مع PDGFβ يجند، استنساخ فأر تسلسل [كدنا] من الجين الورمي مرشح إلى المنشأة SB بلازميد العمود الفقري سيؤدي إلى التعبير التأسيسي داخل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. تقييم دور المكثفات الورم لا يمكن أن يؤديها بشكل فعال عن طريق الاستنساخ في العمود الفقري البلازميد SB مع تسلسل المرشح (أتوفرة على سبيل المثال في قاعدة بيانات الدستور رني 26)، لإنشاء تعبير قوي من الجيل الثاني مير دبابيس الشعر القصيرة.
نقاش الحالية في مجال البحث GBM هي ذات الصلة إلى هوية منشأ خلايا وف-وي. وقد تم مؤخرا تبين أن في الفئران، والأورام الناجمة عن البروتين p53 أسفل تنظيم وNF1 في الخلايا الجذعية العصبية، تنشأ من خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف 27. باستخدام الجمال النائم نموذج ينقول، يمكن تصميم دراسات مماثلة لاختبار ما إذا تغيرات جينية أخرى تستهدف تفضيلي غيرهم من السكان من الخلايا الجذعية / خلايا السلائف لتوليد GBMS. سوف المعرفة من مثل هذه الدراسات يعزز إلى حد كبير فهمنا للGBM المسببات وتوفير السبل لطرق علاجية جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20 oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | For the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | For the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | For the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70 um | Fisher Scientific | 08-771-2 | For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution (intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
