Transposon mediert Integrasjon av plasmid DNA inn subventricular Zone of Neonatal Mus å generere Nye modeller av Glioblastoma
Summary
Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.
Abstract
An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest vanlige (60%) primær hjernesvulst hos voksne, med en median overlevelse på 15-21 måneder når de behandles med kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi en. Nye behandlingsformer for GBM er avgjørende. Eksperimentelle behandlingsformer krever testing i dyremodeller som tilstrekkelig gjengi de viktigste funksjonene i den menneskelige sykdommen. Strategier for å indusere GBM hos gnagere inkluderer kjemisk mutagenese med alkylerende midler, kimlinje eller somatiske genetiske forandringer, eller transplantasjon ved hjelp av glioma cellelinjer 2. De mest brukte modeller ansette implantasjon av gliom cellelinjer, enten orthotopically, inn i hjernen eller subkutant ved hjelp syngene celler hos dyr med identisk genotype; eller xenogeneiske celler, vanligvis humane GBM-cellelinjer, implantert i immun kompromittert mus tre. Xenografter tilbyr mange fordeler for studiet av intrakranielle svulster: bekvemmeligheten av reproduserbarhet, standardized vekstrater, dødstidspunktet og tumorlokalisering. Men disse modellene har begrensninger på grunn av den kunstige, invasiv kirurgisk tilnærming brukes for implantasjoner og begrenset evne til å gjengi histologiske har karakteristisk for menneskelig GBM (WHO grad IV): pseudo-pallisading nekrose, atom atypias, diffus invasjon, mikro-vaskulær spredning og dannelsen av glomeruloid karlidelser 4-7. Induksjon av GBM ved å endre genomet av somatiske celler med onkogene DNA, enten med virale vektorer 8-12, eller med transposon-mediert integrasjon 13, gjengir nærmere etiologien av sykdom hos mennesker og rekapitulerer Histo-patologiske trekk ved menneskelig GBM.
Historisk svulster i CNS er klassifisert basert på den oppfattede cellen av opprinnelse, som det ble observert, ville være en prediktiv faktor for overlevelse 14. GBMs klassifiseres inn i primær og sekundær. Emerging bevis today peker på den svært heterogen natur primære glioblastom 15. Sekundær GBM (15%), resultatet av ondartet transformasjon av lav karakter astrocytomas (WHO grad I) og anaplasic astrocytomas (WHO grad II), er assosiert med tidligere utbruddet av sykdommen, bedre prognose og en "proneural" mønster av genekspresjon , mens primær GBM (85%) viser en sen debut, dårlig prognose og glial (klassisk), nevrale eller mesenchymale uttrykk mønstre. Hvorvidt disse genekspresjonsmønster korrelerer med selve cellen opprinnelses av svulsten fremdeles aktivt undersøkt. Samler inn data viser at kombinasjon av genetiske mutasjoner assosiert med GBMs er prediktiv for å overleve. For eksempel, er tap av heterozygocity (LOH) kromosomer 1p / 19q, IDH1 mutasjoner, PDGFRα presiseringer, assosiert med sekundære GBMs, proneural uttrykk mønster og bedre prognose, mens EGFR overekspresjon, Notch og Sonic aktivering pinnsvin pathway, Nf1 og PTEN tap og mutasjoner av p53 er korrelert med nevrale, klassisk, eller mesenchymale primære GBM og dårligere prognose 16,17. Ankomsten av storskala sekvense prosjekter og akkumulering av mange pasientprøver tilgjengelig for testing bringer et vell av ny informasjon med hensyn til genetiske mutasjoner og trasé innblandet i GBM patogenesen og progresjon og mulighet for individualisert medisin, hvor behandling kan være spesielt tilpasset de genetiske avvik hos pasienten. Til syvende og sist, for å vurdere den prediktive verdien av disse mutasjonene og stier på en systematisk måte, og for å teste mulige behandlinger i hvert enkelt tilfelle, krever dyremodeller av GBM med forhåndsbestemte genetiske forandringer. Transposon mediert integrering av genomisk DNA tilbyr en mulig tilnærming.
Sleeping Beauty transposon system, medlem av TC1 / mariner klasse av transposoner, ble "vekket" (konstruert) i en flertrinns behss av stedsspesifikk mutagenese fra en enn laks transposase genet, som ble sovende mer enn 10 millioner år siden 18,19. I hovedsak DNA transposoner flankert av spesifikke sekvenser (inverterte gjentar / direkte gjentar: IR / DR) kan integreres i genomet i en "klipp og lim" måte ved hjelp av aktiviteten til Sleeping Beauty transposase. Den transposase gjenkjenner endene av de infrarøde områder, Toll transposonet og integrerer det tilfeldig inn i et annet DNA-område mellom basene T og A, baser som er duplisert ved hver ende av transposonet under innarbeiding (Figur 1a). Sleeping Beauty transposase består av tre domener, en transposon bindende domene, en kjernefysisk lokalisering sekvens og en katalytisk domene. Fire transposase molekyler er nødvendig for å bringe de to endene av transposonet sammen og tillater innarbeiding, men hvis for mange molekyler av transposase er til stede, kan de dimerisere og tetramerize å inhibereinnarbeiding reaksjon 20. En effektiv innarbeiding reaksjonen krever et optimalt forhold av transposase til transposoner. Den DNA som koder for transposase kan leveres på samme plasmid med transposonet (cis) eller på et annet plasmid (trans). For å sikre det optimale forholdet mellom transposase og transposoner, kan en promoter med tilstrekkelig aktivitet velges for ekspresjonen av transposase (for "cis" modell) eller forholdet av plasmidene i injeksjonsvæsken kan optimaliseres (for "trans" modell). Sleeping Beauty transposon systemet kan brukes med hell for funksjonell genomforskning, insertional mutagenese, transgenesis og somatisk genterapi 21. Å være en syntetisk konstruksjon re-konstruert for å en funksjonell molekyl fra en sovende enn laks variant, gjør Sleeping Beauty transposase ikke binde seg til andre transposoner hos mennesker eller andre pattedyr 20. Siden den ble oppdaget, har molekylær ingeniør ekstrautstyred innarbeiding effekt av SB transposon systemet gjennom forandringer i IR-sekvenser og tilsetning av TATA dinukleotider som flankerer transposonet, noe som resulterer i PT2 transposoner. Disse transposoner er optimalisert binding til SB til IR-området og økt effekt av eksisjon. SB transposase også gjennomgikk betydelig forbedring; den transposase brukt i eksperimenter som presenteres her er SB100X, en hyperaktiv transposase generert av en DNA shuffling strategien som følges av en stor-skala genetisk skjerm i pattedyrceller 22.
I denne rapporten presenterer vi en hurtig, fleksibel og reproduserbar metode for å indusere indre GBM i mus med ikke-viral, transposon-mediert integrasjon av plasmid DNA inn i celler av under ventrikulær sone av neonatale mus 23. Vi presenterer en enkel måte å lage transposoner med nye gener mottagelig for genomisk integrasjon med Sleeping Beauty transposase og demonstrere hvordan du kan overvåke plasmid opptak ogsykdomsprogresjon ved hjelp Bioluminescens. Vi også prege histologiske og immun-histokjemisk funksjoner av GBM gjengitt med denne modellen. I tillegg presenterer vi en rask metode for å generere primære GBM cellelinjer fra disse svulstene. The Sleeping Beauty modellen, der svulster blir indusert fra celler originale til dyret, tillater funksjonell vurdering av den rollen kandidat GBM gener i induksjon og progresjon av svulster. Dette systemet er også velegnet for testing av nye GBM behandlinger, inkludert immunterapier i immuno-kompetente mus, uten behov for invasive inflammatoriske kirurgiske prosedyrer, som kan endre den lokale mikromiljøet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen, vi detalj en allsidig og reproduserbar metode for generering av nye modeller av GBM ved bruk av SB transposase- mediert integrasjon av onkogen plasmid-DNA inn i celler som omgir subventricular sone av neonatale mus. Vi presenterer en protokoll for å generere transposon plasmider med nye gener av interesse, illustrere hvordan å overvåke progresjon av svulstene i levende dyr, og hvordan å karakter Histo-patologisk og immun-histokjemisk trekk ved disse svulstene.
Som vå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex’s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick’s Foundation Fellowship to CK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | for the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | for the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | for the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70um | Fisher Scientific | 08-771-2 | for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution ( intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- . Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
