Protocol
بيان الأخلاق: تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة أخلاقيات البحث IUCPQ وقبل التوظيف المريض. لأغراض هذه المادة / الفيديو، حصلنا على الأنسجة من 2 المرضى: 1) مريض الذكور البالغ من العمر 62 مع مؤشر كتلة الجسم من 50.7 كجم / م 2 و 2) مريضة البالغ من العمر 35 مع مؤشر كتلة الجسم من 57 كجم / م 2. تجارب يمكن أن يتم مع كل من المقصورات الدهون، ولكن لم تقتصر على مقصورة الدهون واحد لغرض هذا الفيديو. تم تنفيذ الجوانب التقنية للفيديو مع المريض (1) وأجري FABP4 المناعي مع الخلايا dedifferentiated من مريض 2.
تجهيز 1. عينة
- اسأل الجراحين لجمع الأنسجة الدهنية من المقصورات الدهون ثربية وتحت الجلد في وقت لعملية جراحية لعلاج البدانة بالمنظار.
- جلب عينات الدهنية بسرعة إلى المختبر في RT ومعالجة الفور.
- أداء الهضم في المختبر، في أجواء غير معقمة. الفي نهاية المطاف سوف يتم نقل الخلايا إلى غرفة الثقافة وزراعتها تحت ظروف معقمة. لتجنب التلوث، وإعداد عازلة KRH مع الماء المقطر ومرشح ومتابعة من قبل ترشيح (فلتر 0.22μM) قبل عملية الهضم. أنابيب نظيفة تماما مع الايثانول نقل مسبق في الخلية هود الثقافة لقارورة وإعداد لوحة.
- وضع الأنسجة الدهنية على طبق المرجحة قبل والوزن قياسي. إصلاح قطعة صغيرة من كل عينة الأنسجة (أقل من 1 سم 2) في 10٪ عازلة الفورمالين في RT لمدة 24 ساعة على الأقل قبل البارافين التضمين. استخدام هذه العينة جزءا لا يتجزأ من لتجارب المناعية (تقنية لا تظهر).
- ضع قطعة أخرى في أنبوب 50 مل وفلاش-تجميد في النيتروجين السائل قبل تخزينها في -80 ° C لمزيد من الدراسات على الأنسجة الدهنية كلها (على سبيل المثال، التعبير الجيني - تقنية لا تظهر).
2. كولاجيناز الهضم
- ضع قطعة الأنسجة الدهنية المتبقية في 50 مل تويكون للهضم.
- إضافة 4 مل من KRH-WB تستكمل مع كولاجيناز (350 U / مل) في كل غرام من العينة في أنبوب الهضم.
- تخطر الدهنية الأنسجة مع مقص.
- وضع مفروم تعليق الأنسجة الدهنية في شاكر، 37 ° C، و 90 دورة في الدقيقة كحد أقصى، على بعد 45 دقيقة الحضانة (بحد أقصى 1 ساعة).
3. تنقية الخلايا الشحمية وPreadipocytes
- من أجل حل شفافة مع قليل من قطع من الدهون من خلال النايلون 400 ميكرومتر شبكة في كوب من البلاستيك.
- مع ملاقط، وفرك إعداد الخلايا على شبكة من النايلون ويغسل مع 5 مل من KRH-WB.
- بدقة نقل تعليق خلية مرشح في أنبوب 50 مل مع أنابيب بلاستيكية في ذلك، وحقنة في 60cc تعلق في أقصى الأنابيب.
- السماح للتعليق مع الخلايا الشحمية ناضجة الوقوف لمدة حوالي 10 دقيقة، مما يسمح للخلايا للوصول إلى أعلى العازلة الطرح.
- نضح ببطء المخزن المؤقت في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام في 60cc syrinجنرال الكتريك الشفط.
- إضافة 20 مل من KRH-WB لغسل. كرر من الخطوة 3.4 ل2 يغسل إضافية.
- جمع المخزن المؤقت لجلب تعليق خلية شحمية إلى الحجم النهائي من 5 أو 10 مل، اعتمادا على كمية الخلايا. متابعة مع الخطوات الموجودة في القسم 5.
- استرداد جزء-انسجة الوعائية من المخزن المؤقت التي تم جمعها مع الحقنة في 60cc بواسطة الطرد المركزي (3،000 دورة في الدقيقة، RT، 5 دقائق) لمزيد من الثقافة الخلية الأولية إذا رغبت (تقنية لا تظهر).
4. الناضجة خلية شحمية عدد الخلايا
- تحميل 10 ميكرولتر من هز بلطف تعليق خلية شحمية في غرفة العد (haemocytometer). أداء عدد الخلايا في quadruplicate.
- حساب عدد الخلايا الناضجة معزولة.
5. الناضجة خلية شحمية فقد التمايز إلى T-25 قارورة
- ملء 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة إلى ¾ من حجم مع DMEM / F12-20٪ العجل المصل.
- وفقا لعدد خلايا، صب 500000 خلايا ناضجة في قارورة. ملء قارورة تماما باستخدام أنبوب 50ML مع المتوسطة وإزالة العديد من الفقاعات ممكن.
- المسمار غطاء unvented على القارورة.
- تنظيف القارورة مع الايثانول قبل الحضانة لتجنب التلوث.
- احتضان القارورة رأسا على عقب لمدة أسبوع دون لمسها لتجنب الحركة في الثقافة والذي قد يضر الالتزام الخلوية.
- قبل عكس القارورة في 7 أيام من ثقافة مقلوب، والتعامل معها بلطف القارورة وإزالة كافة المتوسطة في قارورة بواسطة الشفط، وتجنب الحركات المفاجئة.
- إضافة 12 مل من DMEM-F12-20٪ العجل المصل وزراعة الخلايا مع التقنيات القياسية. يمكن إضافة تصفيتها، وكأب تنفيس للقارورة.
6. الناضجة خلية شحمية فقد التمايز إلى لوحة 6 جيدا
- وضع ساترة على الجزء السفلي من كل بئر من لوحة 6 جيدا
- إضافة ½ "جلبة من البلاستيك على رأس كل ساترة.
- ملء الآبار مع 8 مل من 20٪ العجل المصل DMEM المتوسطة.
- وضع ساترة على كل جلبة البلاستيكية.
- إدراج طرف الماصة بين الشريحة والأنبوب لحقن الخلايا تحت الشريحة (50،000 الخلايا لكل بئر).
- احتضان لوحات في معيار ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة أسبوع.
- ساترة العكسية مع خلايا المرفقة إلى كل منها يحتوي أيضا 2 مل من وسائل الإعلام تستكمل مع 20٪ مصل العجل ومتابعة الثقافة.
- استخدام ساترة مع الخلايا التي تمر فقد التمايز لأغراض عدة بما في ذلك المناعي (تقنية لا تظهر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحدث تغيرات شكلية الرئيسية لتنضج الخلايا الشحمية خلال فقد التمايز (الشكل 1). كما هو مبين في الشكل 2، كانت ملطخة الخلايا التي تمر فقد التمايز مع الأجسام المضادة لمكافحة FABP4 لتحليل مضان. أعربت الخلايا مع التشكل الجولة البروتين FABP4 في حين أن الغالبية العظمى من الخلايا مثل الخلايا الليفية لم يفعل ذلك. بعد فقد التمايز، وخلايا DFAT يمكن زراعتها مع الإجراءات القياسية لعدة مقاطع. لقد كنا قادرين على الوصول إلى أكثر من 15 ممرات للثربي البشري وخطوط الخلايا DFAT تحت الجلد (لا تظهر البيانات).
اتخذت الشكل 1. مورفولوجيا الخلايا الشحمية من dedifferentiating ناضجة مع مرور الوقت (A) في 4 أيام (B) في 7 أيام و(C) في 12 يوما من الثقافة. صور في مختلف نقاط وقت خلال حضانة باستخدام microscop على النقيض من المرحلةه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الكشف عن البروتين FABP4 في الخلايا الشحمية تمر فقد التمايز. تم إصلاح الخلايا بعد 13 يوما من فقد التمايز وملطخة الأجسام المضادة لمكافحة FABP4 لالمناعي. تم تصور نوى مع دابي تلطيخ. اليسار: صورة من Brightfield المناعي المقابلة. اليمين: تظهر صورة المدمجة (FABP4 الأحمر، نوى والأزرق و10X). الخلايا الشحمية مع التشكل الجولة FABP4 صريحة، وهي خلية شحمية علامة ناضجة، في حين أن الخلايا ممدود لم يعد التعبير عن ذلك. شريط مقياس: 1 وحدة = 0.25mm الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فقد التمايز من الخلايا الشحمية ناضجة مع تقنية ثقافة السقف هو نهج جديد للحصول على الخلايا الجذعية الدهنية من عينة صغيرة من الأنسجة الدهنية الأم. بناء على خبرتنا وأن الآخرين 2، غرام واحد من الأنسجة غير كافية لوحة 25 سم 2 قارورة والحصول على عدد سكانها خلايا DFAT التي تم تظاهر التجانس التي كتبها بولوني والمتعاونين 3. يبدو خلية شحمية فقد التمايز ممكن مع الخلايا من أي جهة مانحة، بصرف النظر عن السن والجنس وغيرها من الخصائص. بين الناتج السكان من الحصول على DFAT، لا تزال هناك جولة قليلة أو الخلايا ممدود جزئيا التي لم dedifferentiate بالكامل. عادة ما يتم تجاهل هذه الخلايا من خلال مرور ثقافة لأنها تطفو في مزيج التربسين وسائل الإعلام.
تم تأسيس Multipotency من هذه الخلايا ويدعم استخدامها لعلاج الخلايا 2،3. كما تم الإبلاغ عن طاقتها التكاثري عالية، والتي طسا الجانب قيما للثقافة الخلية لتطبيقات الخلايا الجذعية 2. أشارت الدراسات مع الخلايا DFAT الإنسان أنها قد تكون أكثر كفاءة من ASC من نفس الجهات المانحة، على أساس تنسخي والتمايز قدرتها 18. وتدعم دراسة حالة حديثة أن الخلايا DFAT كانت أكثر كفاءة لتفرق في الخلايا الشحمية وبانيات، وكان التيلوميراز مستويات أعلى من ASC من نفس الشخص، إحدى الجهات المانحة مع السمنة ومرض السكري 18. وهكذا، واستخدام الثقافة السقف قد توفر الخلايا الجذعية الدهنية أكثر كفاءة من ASC استخدمت بالفعل. ومع ذلك، هناك حاجة لتجارب إضافية لتقييم بوضوح على هذه النقطة.
لدينا 6 جيدا تقنية ثقافة لوحة السقف تسمح لدراسة عملية فقد التمايز نفسها. وهناك عدد ضئيل من خلايا يمكن مطلي ويسمح لدراسة نقاط زمنية محددة. على سبيل المثال، جمعنا شريحة المجهر من لوحة 6 جيدا لأداء المناعي من الخلايا الشحمية undergoing فقد التمايز (الشكل 2). أداء miscroscopy، مع أو بدون مضان، هي ذات أهمية كبيرة لتقييم مختلف جوانب فقد التمايز.
وبالإضافة إلى ذلك لوقف التطبيقات الخلوية، قد خلايا DFAT تمثل نموذجا للاهتمام للدراسات الفسيولوجية. درست فقط عدد قليل من الدراسات التعبير الجيني وظائف كل أنواع الخلايا. وباختصار، ASC وDFAT من نفس المكان الدهون أظهرت التشابه في التعبير الجيني وإفراز 4. المزيد من المقارنات بين ASC وDFAT من نفس المانحة ضرورية.
في الختام، وتبين لنا في هذا التقرير الفني كيفية الحصول على خلايا DFAT من الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان باستخدام تقنية راسخة من الدهنية كولاجيناز الأنسجة الهضم وتقنية ثقافة السقف. لدينا الأصلي شكل لوحة 6 جيدا قد يساعد في زيادة المعرفة حول عملية فقد التمايز في حين يسمح للطريقة قارورة أكثر شيوعا لتوليد الشعبية التي أكبرجماعات سكانية من خلايا DFAT. فإن القيود الرئيسية من هذا البروتوكول هو الوصول إلى الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان والتي تعتمد على التعاون مع فريق جراحة وأخلاقيات الإدارة في الحصول على موافقة خطية وأبلغ المريض. خلايا ناضجة حساسة للغاية الأمر الذي يتطلب احتياطات في التلاعب. نحن الأمثل البروتوكول، وخاصة عدد الخلايا الشحمية أن مطلي في T-25flask وشكل لوحة 6 جيدا، للحصول على أفضل النتائج وأي تعديلات إضافية كبيرة او حل قد يكون متوقعا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
