Protocol
Declaración de Ética: El proyecto ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación de IUCPQ previo a la contratación del paciente. A los efectos de este artículo / video, obtuvimos tejidos de 2 pacientes: 1) un paciente varón de 62 años de edad con un IMC de 50,7 kg / m 2 y 2) una paciente de 35 años de edad con un IMC de 57 kg / m 2. Los experimentos se pueden realizar con las dos compartimentos de grasa, pero se han limitado a un compartimento de grasa para el propósito de este video. Aspectos técnicos del video se realizaron con el paciente 1 e inmunofluorescencia FABP4 se realizó con células indiferenciadas del paciente 2.
Procesamiento 1. Muestra
- Pregunta a los cirujanos para recoger el tejido adiposo de los compartimentos de grasa omental y subcutáneo en el momento de la cirugía bariátrica laparoscópica.
- Traer rápidamente las muestras de tejido adiposo al laboratorio a temperatura ambiente y procesar inmediatamente.
- Realizar la digestión en el laboratorio, en un ambiente no estéril. Lacélulas eventualmente serán transferidos a la sala de cultivo y se cultivaron bajo condiciones estériles. Para evitar la contaminación, preparar tampón KRH con agua destilada y se filtró y el seguimiento de un (filtro 0.22μM) filtración antes de la digestión. Tubos Limpiar a fondo con etanol transferencia antes de la campana de cultivo celular para frasco y preparación plato.
- Coloque el tejido adiposo en un plato pesado previamente y registrar el peso. Fijar un pequeño trozo de cada muestra de tejido (menos de 1 cm 2) en tampón de formalina al 10% a temperatura ambiente durante al menos 24 h antes de la inclusión en parafina. Utilice esta muestra embebido para experimentos de inmunohistoquímica (técnica no mostrado).
- Coloque una pieza más en un tubo de 50 ml y el flash-congelación en nitrógeno líquido antes de almacenar a -80 ° C durante más estudios sobre los tejidos adiposos enteros (por ejemplo, la expresión de genes - técnica no se muestra).
2. digestión con colagenasa
- Coloque la pieza de tejido adiposo que permanece en un ml tu 50ser para la digestión.
- Añadir 4 ml de KRH-WB suplementadas con colagenasa (350 U / ml) por gramo de la muestra en el tubo de digestión.
- Picar el tejido adiposo con unas tijeras.
- Coloque picada suspensión de tejido adiposo en una coctelera, 37 ° C, 90 rpm máximo, para una incubación de 45 minutos (máximo 1 hora).
3. Purificación de los adipocitos y preadipocitos
- Vierta la solución transparente con unos trozos de grasa a través de un nylon 400 mM de malla en un vaso de plástico.
- Con pinzas, frotar la preparación de células en la malla de nylon y se lava con 5 ml de KRH-WB.
- Transferir delicadamente la suspensión celular se filtró en un tubo de 50 ml con el tubo de plástico en ella y una jeringa de 60 cc unida a la extremidad del tubo.
- Que la suspensión con adipocitos maduros reposar durante aproximadamente 10 min, permitiendo que las células alcanzan la parte superior de la memoria intermedia por flotación.
- Lentamente aspirar el tampón en la parte inferior del tubo utilizando Syrin 60ccsucción ge.
- Añadir 20 ml de KRH-WB para lavar. Repita desde el paso 3.4 para 2 lavados adicionales.
- Recoger el tampón para llevar la suspensión de adipocitos a un volumen final de 5 o 10 ml, dependiendo de la cantidad de células. Continuar con los pasos en la sección 5.
- Recuperar la fracción estromal-vascular de la memoria intermedia recogido con la jeringa de 60 cc por centrifugación (3000 rpm, RT, 5 min) para su posterior cultivo celular primario si se desea (técnica no se muestra).
4. adipocito maduro Cuenta de la célula
- Cargar 10 l de suspensión de los adipocitos sacudido suavemente en una cámara de recuento (hemocitómetro). Realizar el recuento de células por cuadruplicado.
- Calcular el número de células maduras aisladas.
5. maduro Adipocito Desdiferenciación en T-25 Frasco
- Llene un 25 cm2 tejido cultivo en matraz a ¾ del volumen con DMEM / F12-20% de suero de ternera.
- De acuerdo con el recuento de células, vierta 500.000 células maduras en el matraz. Llene el frasco completamente utilizando un tubo de 50 ml con medio y eliminar tantas burbujas como sea posible.
- Tornillo de la tapa sin ventilación en el matraz.
- Limpiar el matraz con etanol antes de la incubación para evitar la contaminación.
- Incubar el frasco boca abajo durante una semana sin tocarlo para evitar el movimiento de la cultura que puede perturbar la adhesión celular.
- Antes de invertir el matraz a 7 días de cultivo invertida, manipular suavemente el matraz y eliminar todo el medio en el matraz por aspiración, evitando movimientos bruscos.
- Añadir 12 ml de DMEM-F12-20 suero% ternera y cultivar células con técnicas estándar. A filtrada, tapa ventilada se puede añadir al matraz.
6. maduro Adipocito Desdiferenciación en una placa de 6 pocillos
- Coloque un cubreobjetos en la parte inferior de cada pocillo de una placa de 6 pocillos
- Añadir un ½ "casquillo de plástico en la parte superior de cada cubreobjetos.
- Llenar los pocillos con 8 ml de 20% de medio de suero de ternero-DMEM.
- Ponga un cubreobjetos en cada casquillo de plástico.
- Inserte punta de la pipeta entre la corredera y el tubo para inyectar células bajo la corredera (50.000 células por pocillo).
- Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante una semana.
- Cubreobjetos inversa con células unidas en cada pocillo que contiene 2 ml de medio suplementado con suero de ternera 20% y llevar a cabo la cultura.
- Utilice cubreobjetos con células que experimentan desdiferenciación para varios propósitos incluyendo inmunofluorescencia (técnica no se muestra).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los principales cambios morfológicos ocurren a adipocitos maduros durante la desdiferenciación (Figura 1). Como se muestra en la Figura 2, las células sometidas a la desdiferenciación se tiñeron con un anticuerpo anti-FABP4 para el análisis de fluorescencia. Las células con una morfología redonda expresaron la proteína FABP4 mientras que la mayoría de las células similares a fibroblastos no lo hizo. Después de desdiferenciación, células DFAT pueden cultivarse con procedimientos estándar para varios pasajes. Hemos sido capaces de llegar a más de 15 pasajes para omental humana y subcutáneos líneas celulares DFAT (datos no mostrados).
Figura 1. Morfología de dedifferentiating adipocitos maduros en el tiempo (A) a los 4 días (B) a los 7 días y (C) a los 12 días de cultivo. Fotos fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo durante la incubación utilizando un microscópicas de contraste de fasee. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Detección de la proteína FABP4 en los adipocitos de someterse a la desdiferenciación. Las células se fijaron después de 13 días de desdiferenciación y se tiñeron con anticuerpo anti-FABP4 para inmunofluorescencia. Los núcleos se visualizaron con tinción con DAPI. Izquierda: Imagen de campo claro de inmunofluorescencia correspondiente. Derecha: La imagen resultante de la fusión se muestra (FABP4 rojo, Núcleos-azul-10X). Los adipocitos con FABP4 expreso morfología redonda, un marcador de adipocitos maduros, mientras que las células alargadas ya no lo expresan. Barra de escala: 1 unidad = 0,25 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desdiferenciación de adipocitos maduros con la técnica de cultivo de techo es un nuevo enfoque para la obtención de células madre adiposas de una pequeña muestra de tejido adiposo nativo. Basándonos en nuestra experiencia y la de otros 2, un gramo de tejido es suficiente para platear un matraz de 25 cm2 y para obtener una población de células DFAT para que la homogeneidad se ha demostrado por Poloni y colaboradores 3. Desdiferenciación adipocito parece posible con células de un donante, independientemente de su edad, sexo y otras características. Entre la población resultante de DFAT obtenerse, sigue existiendo células en parte alargadas que no dedifferentiate totalmente algunos o redonda. Estas células se desechan a través del paso de cultivo, ya que flotan en la mezcla de tripsina-media.
Multipotencia de estas células se establece y apoya su uso para la terapia de células 2,3. Su alta capacidad proliferativa También se ha informado, que isa aspecto valioso de cultivo celular para aplicaciones de células madre 2. Los estudios con células DFAT humanos indicaron que pueden ser más eficientes que los ASC del mismo donante, en base a su capacidad replicativa y diferenciación 18. Un estudio reciente caso apoya que las células DFAT eran más eficaces para diferenciarse en adipocitos y osteoblastos, y tenían niveles más altos que la telomerasa ASC del mismo individuo, de un donante con la obesidad y la diabetes 18. Así, el uso de la cultura de techo puede proporcionar células madre adiposas más eficiente que la ASC ya utilizado. Sin embargo, se necesitan ensayos adicionales para evaluar claramente este punto.
Nuestra técnica de cultivo de techo placa de 6 pocillos permite el estudio del proceso de desdiferenciación sí mismo. Un número mínimo de células puede ser plateado y permite el estudio de los puntos de tiempo específicos. Por ejemplo, hemos recogido el portaobjetos de microscopio de una placa de 6 pocillos para realizar inmunofluorescencia de los adipocitos UNDERGdesdiferenciación oing (Figura 2). Realizar miscroscopy, con o sin fluorescencia, es de gran relevancia para evaluar diversos aspectos de desdiferenciación.
Además de contener aplicaciones de células, las células DFAT pueden representar un modelo interesante para estudios fisiológicos. Sólo unos pocos estudios examinaron la expresión y las funciones de ambos tipos de células de genes. En breve, ASC y DFAT desde el mismo compartimento graso mostró similitudes en la expresión génica y secreción 4. Más comparaciones entre ASC y DFAT del mismo donante son necesarios.
En conclusión, mostramos en este informe técnico cómo obtener células DFAT a partir de tejido adiposo humano usando la técnica bien establecida de digestión con colagenasa de tejido adiposo y de la técnica de cultivo de techo. Nuestra 6 pocillos formato de placa original puede ayudar a aumentar el conocimiento sobre el proceso de desdiferenciación mientras que el método de frasco más comúnmente utilizado permite la generación de pobla más grandesciones de células DFAT. La principal limitación de este protocolo es el acceso al tejido adiposo humano que se basa en la colaboración con un equipo de gestión de la cirugía y la ética de obtener el consentimiento por escrito e informado del paciente. Las células maduras son altamente sensibles que requiere precauciones en la manipulación. Hemos optimizado el protocolo, sobre todo el número de adipocitos que se sembraron en el T-25flask y el formato de placa de 6 pocillos, para obtener resultados óptimos y sin grandes modificaciones o reparación adicionales se pueden anticipar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
