Protocol
Etik deyimi: Proje öncesinde hasta alımına IUCPQ Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu haber / video amaçla, 2 hastada dokuların elde: 1) 57 kg BMI ile 50,7 kg / m 2 ve 2) 35 yaşındaki kadın hasta bir BMI ile 62 yaşındaki erkek hasta, / 2 m. Deneyler hem yağ bölmeleri ile yapılabilir, ancak bu videonun amacı için bir yağ bölmeye sınırlı kalmıştır. Videonun teknik özellikleri, hastanın 1 ile yapıldı ve FABP4 immünofloresan hasta 2 dediferansiye hücreleri ile gerçekleştirildi.
1. Örnek İşleme
- Laparoskopik obezite cerrahisi sırasında omentum ve deri altı yağ bölmelerden yağ dokusu toplamak için cerrahlara isteyin.
- Çabuk oda sıcaklığında laboratuvara yağ numuneleri getirmek ve hemen işleme.
- Steril olmayan bir atmosferde, laboratuarda sindirim yapın.hücreler daha sonra kültür odasına aktarılır ve, steril koşullar altında kültive edilir. Kontaminasyonu önlemek için, sindirim önce distile ve filtre su ile KRH tampon hazırlamak ve bir filtrasyon (0.22 um filtresi) ile izleyin. Şişeye ve plaka hazırlanması için hücre kültürü kaputu etanol önce transferi ile iyice temizleyin tüpler.
- Önceden ağırlıklı çanak ve kayıt ağırlığı yağ dokusu yerleştirin. Parafine önce en az 24 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin tamponu içinde her bir doku numunesi (yaklaşık 1 cm2), bir parça düzeltildi. Immünohistokimyası deneyler için bu gömülü örneği (gösterilmemiştir tekniği) kullanın.
- (- Teknik gösterilmemiştir örneğin, gen ekspresyonu) bütün yağ dokuları üzerinde ileri çalışmalar için -80 ° C'de depolamadan önce sıvı azot içinde bir 50 ml tüp ve flash dondurularak başka bir parça yerleştirin.
2. kollajenaz sindirimi
- 50 ml'lik tu kalan yağ dokusu parçası yerleştirinsindirim için olabilir.
- Sindirme tüpü numunenin gramı başına kolajenaz (350 U / ml) ile takviye edilmiş KRH-WB 4 ml ilave edilir.
- Makasla yağ dokusu kıyma.
- 45 dakikalık bir kuluçka süresinin (en fazla 1 saat), bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C, 90 rpm, en fazla, kıyılmış adipoz doku süspansiyonu yerleştirin.
Adipositlerinde ve preadipositlerin 3. saflaştırılması
- Bir plastik geniş şişenin içine örgü 400 uM naylondan yağ birkaç parçaları ile saydam çözelti dökülür.
- Cımbız ile, naylon örgü hücre hazırlama ovmak ve KRH-WB 5 ml suyla yıkayın.
- Incelikle içinde plastik boru ve boru ucunda bağlı bir 60cc şırınga ile bir 50 ml tüp içine süzüldü hücre süspansiyonu aktarın.
- Olgun adipositlerle süspansiyon hücreleri yüzdürme ile tampon üst ulaşmasını sağlayan, yaklaşık 10 dakika bekletin.
- Yavaş yavaş 60cc enjektörler kullanılarak tüpün altındaki tampon aspirege emme.
- KRH-WB 20 ml yıkama ekleyin. 2 ek yıkama için adım 3.4 tekrarlayın.
- Hücre miktarına bağlı olarak, 5 ya da 10 ml'lik bir son hacme adiposit süspansiyon getirmek için tampon toplayın. 5. bölümünde adımlarla takibi.
- Arzu edildiği takdirde ayrıca, birinci hücre kültürü santrifüj ile 60cc şırınga (3000 rpm, RT, 5 dk) ile toplanmış tampon stromal vasküler kısmını kurtarma (tekniği gösterilmemiştir).
4. Olgun Adiposit Hücre Sayısı
- Yük bir sayım odasında (hemositometre) hafifçe sarsıldı adiposit süspansiyonu 10 ul. Dört nüsha olarak hücre sayısını yapın.
- Izole olgun hücrelerin sayısını hesaplayın.
T-25 şişesi içine 5. Olgun Adiposit farksızlaşma
- DMEM / F12-20% buzağı serumu ile hacminin ¾ 25 cm 2 doku kültürü şişesi doldurun.
- Hücre sayımı göre, balona 500.000 olgun hücreleri dökün. Tam ortam ile 50 ml tüp kullanarak balon doldurun ve mümkün olduğu kadar çok kabarcıklarını çıkarmak.
- Şişenin üzerindeki unvented kapağı vidalayın.
- Kontaminasyonu önlemek için inkübasyon öncesinde etanol ile şişeyi temizleyin.
- Hücresel yapışmayı bozabilir kültür hareketi önlemek için dokunmadan baş aşağı bir hafta boyunca şişeyi inkübe.
- Ters kültür 7 gün balon tersine önce, hafifçe ani hareketlerinden kaçınmak, şişeyi işlemek ve aspirasyon şişeye tüm orta kaldırmak.
- DMEM-F12-20% buzağı serumu 12 ml ekleyin ve standart tekniklerle hücreleri yetiştirmek. Filtre edilmiş, havalandırmalı kapak şişeye ilave edilebilir.
6 yuvalı plaka içine 6. Olgun Adiposit farksızlaşma
- 6 gözlü bir plakanın her bir alt kısmında bir lamel yerleştirin
- Her lamel üstüne ½ "plastik burcu ekleyin.
- % 20 dana serumu-DMEM ortamı 8 ml ile kuyu doldurun.
- Her plastik burç üzerinde bir lamel koyun.
- Slayt ve slayt altında hücresinin enjekte edilmesi için bir tüp (oyuk başına 50,000 hücre) ile pipet ucu yerleştirin.
- Bir hafta boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir standart hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
- Her bir göze% 20 dana serumu ile takviye edilmiş bir ortam 2 ml ihtiva eden ve takip kültüre ilişik hücrelerle Arka lamel.
- Hücreler immunfloresan dahil olmak üzere birçok amaçlar için dediferansiyonunu geçiren ile lamel kullanın (tekniği gösterilmemiştir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başlıca morfolojik değişimler dediferansiyasyon (Şekil 1) sırasında adipositleri olgun oluşur. Şekil 2'de gösterildiği gibi, farklılaşma bozukluğunun geçiren hücreler, floresan analizi için bir anti-FABP4 antikor ile boyandı. Fibroblast-benzeri hücrelerin bir çoğunluğu bu görülmemiştir yuvarlak morfoloji olan hücreler FABP4 proteini ifade etmiştir. Dediferansiyasyon sonra, DFAT hücreleri birkaç geçişleri için standart prosedürler ile yetiştirilebilir. İnsan omental ve deri altına DFAT hücre çizgileri için 15 kanallarına ulaşmak mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir).
4 gün sonra (B), 7 gün kültür. Resimleri 12 günde (C) 'de bir süre (A) boyunca, olgun adipositlerin dedifferentiating Şekil 1. morfolojisi, bir faz-kontrast mikroskobunun ile inkübasyon sırasında farklı zaman noktalarında alınmıştıre. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Adipositlerde FABP4 protein Şekil 2. Algılama dediferansiyonunu geçiren. Hücreler, farklılaşmanın giderilmesi için 13 gün sonra sabit ve immünofloresans anti-FABP4 antikor ile boyandı. Çekirdekler DAPI boyama ile görüntülendi. Sol: immünoflüoresans karşılık gelen aydınlık görüntü. Sağ: Birleştirilmiş görüntü gösterilir (FABP4-kırmızı, çekirdekler-mavi-10X). Uzatılmış hücreler ise yuvarlak morfoloji ekspres FABP4, olgun bir adiposit işaretleyici ile adipozitler artık bunu ifade. Ölçek çubuğu: 1 adet = 0.25mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tavan kültür tekniği ile olgun adipositlerin farksızlaşma yerli yağ dokusunun küçük bir örnek adipoz kök hücreleri elde etmek yeni bir yaklaşımdır. Deneyimlerimize ve diğerleri 2 bu göre, bir gram doku 25 cm2 bir balon plaka ve homojenliği Poloni ve arkadaşları 3 ile gösterilmiştir olan DFAT hücre popülasyonu elde etmek için yeterlidir. Adiposit farksızlaşma bağımsız olarak yaş, cinsiyet ve diğer özellikleri, herhangi bir donörden alınan hücrelerle mümkün görünüyor. DFAT elde çıkan nüfus arasında, bir kaç yuvarlak veya tamamen farksızlaştığı vermedi kısmen uzatılmış hücreler kalır. Onlar tripsin-medya karışımı yüzer gibi bu hücreler genellikle kültür geçitten atılır.
Bu hücrelerin multipotency kurulmuş ve hücre tedavisi 2,3 için onların kullanımını destekler. Bunların yüksek çoğalma kapasitesi de rapor edilmiştir ki bu ikök hücre uygulamaları 2 için hücre kültürü sa değerli yönü. İnsan DFAT hücreleri ile yapılan çalışmalar, bu da tekrar eden ve farklılaşma kapasitesi 18 göre aynı donörden ASC daha etkili olabileceğini göstermiştir. Son zamanlarda vaka çalışması DFAT hücreleri adipositler ve osteoblast içine ayırt etmek daha verimli ve aynı birey, obezite ve diyabet 18 ile bir donörden ASC daha yüksek telomeraz düzeyleri olduğunu desteklemektedir. Böylece, tavan kültürünün kullanımı zaten kullanılan ASC daha verimli yağ kök hücreleri sağlayabilir. Bununla birlikte, ilave deneyler açıkça bu noktayı belirlemek için önemlidir.
Bizim 6-yuvalı plaka tavan kültürü tekniği farksızlaşma prosesinin bir çalışma sağlar. Hücrelerin en az sayıda kaplanmış ve spesifik zaman noktalarında çalışma sağlar edilebilir. Örneğin, adipositler underg gelen immünofloresan gerçekleştirmek için bir 6-yuvalı plaka mikroskop lamı toplananmeler farksızlaşma (Şekil 2). Veya floresan olmayan, miscroscopy Sahne, dediferansiyasyon çeşitli yönlerini değerlendirmek için büyük önem taşımaktadır.
Kök hücre uygulamaları yanı sıra, DFAT hücreler fizyolojik çalışmalar için ilginç bir modelini temsil eder. Sadece bir kaç çalışmada, gen ekspresyonu ve her iki hücre tipinde işlevlerini incelenmiştir. Aynı yağ bölmeden kısa, ASC ve DFAT gen ifadesi ve salgılanması 4 benzerlikler gösterdi. Aynı vericiden alınan ASC ve DFAT arasında daha fazla karşılaştırmalar gereklidir.
Sonuç olarak, biz adipoz doku kollajenaz sindirim köklü teknik ve tavan kültür tekniği kullanılarak insan adipoz dokudan DFAT hücreleri elde etmek için nasıl bu teknik raporda göstermek. Bizim orijinal 6-plaka formatı daha yaygın kullanılan şişe yöntemi büyük populasyona üretimi için izin verir ise farksızlaşma süreci hakkında bilgi artırmaya yardımcı olabilirDFAT hücre saplamalar. Bu protokolün en önemli kısıtlılığı, hasta yazılı ve bilgilendirilmiş onam elde etmek için bir ameliyat ekibi ve etik yönetimi ile işbirliği dayanan insan yağ dokusu erişim olduğunu. Olgun hücreler manipülasyon önlemleri gerektiren son derece duyarlıdır. Bu en iyi sonuçları elde etmek için, protokol, özellikle T-25flask olarak kaplama için adipositlerin sayısı ve 6-yuvalı plaka formatı optimize edilmiş ve önemli bir ek modifikasyonlar ya da sorun beklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
