Protocol
Etikk uttalelse: Prosjektet er godkjent av IUCPQ forskningsetiske komité før rekruttering av pasienter. For hensikten med denne artikkelen / video, vi innhentet vev fra to pasienter: 1) en 62 år gammel mannlig pasient med en BMI på 50,7 kg / m 2 og 2) en 35 år gammel kvinnelig pasient med en BMI på 57 kg / m 2. Forsøkene kan utføres med både fett kamre, men er begrenset til en fettlomme for formålet med denne videoen. Tekniske aspektene av videoen ble utført med pasienten en og FABP4 immunfluorescens ble utført med dedifferensierte celler fra pasienten to.
1. prøvebehandling
- Spør kirurger å samle fettvev fra omentfaktorene og underhudsfett avdelinger på tidspunktet for laparoskopisk fedmekirurgi.
- Raskt bringe adipose prøver til laboratoriet ved RT og behandle umiddelbart.
- Utføre fordøyelse i laboratoriet, i en ikke-steril atmosfære. DenCellene vil til slutt bli overført til dyrkningsrommet og dyrkes under sterile forhold. For å unngå forurensning, forberede KRH buffer med destillert og filtrert vann, og en filtrering (0.22μM filter) før fordøyelsen. Grundig rene rør med etanol før overføring i panseret cellekultur for kolbe og plate forberedelse.
- Plasser fettvev på en pre-vektet fatet og rekord vekt. Løs et lite stykke av hver vevsprøve (mindre enn 1 cm 2) i 10% formalin-buffer ved romtemperatur i minst 24 timer før parafin innebygging. Bruk denne innebygde prøven for immunhistokjemi eksperimenter (teknikk ikke vist).
- Plasser en annen brikke i et 50 ml rør og flash-frysing i flytende nitrogen før lagring ved -80 ° C for videre studier på hele adipose vev (f.eks genekspresjon - teknikk ikke vist).
2. Kollagenase Fordøyelse
- Legg den gjenværende fettvev brikke i et 50 ml tuvære for fordøyelsen.
- Tilsett 4 ml KRH-WB supplert med collagenase (350 U / ml) per gram prøve i fordøyelsen røret.
- Finhakk fettvev med saks.
- Plassere hakket fettvev suspensjon i en shaker, 37 ° C, 90 rpm maksimum, for en 45-minutters inkubasjon (maksimum 1 time).
3. Rensing av Adipocytter og preadipocytes
- Hell gjennomskinnelig løsning med noen få biter av fett gjennom en 400 pm nylonnett i et plastbegerglass.
- Med pinsett, gni cellen forberedelse på nylon mesh og vask med 5 ml av KRH-WB.
- Delikat overføre den filtrerte cellesuspensjonen i et 50 ml rør med plastrøret i den og en sprøyte 60c festet på røret ekstremitet.
- La suspensjonen med modne adipocytter stå i ca 10 min, slik at cellene til å nå toppen av bufferen ved flotasjon.
- Sakte Aspirer buffer ved bunnen av røret ved hjelp 60c syringe sug.
- Tilsett 20 ml av KRH-WB å vaske. Gjenta fra trinn 3.4 for to ekstra vask.
- Samle buffer til å bringe fettceller suspensjonen til et endelig volum på 5 eller 10 ml, avhengig av cellemengde. Forfølge med trinnene i § 5.
- Gjenvinne stromal-vaskulære fraksjon fra bufferen oppsamlet med sprøyte 60c ved sentrifugering (3000 rpm, RT, 5 min) for videre primær cellekultur hvis ønskelig (teknikk ikke vist).
4. Moden adipocytt Cell Count
- Last 10 mL av forsiktig ristet adipocyte suspensjon i et tellekammer (hemocytometer). Utføre celletall i fire eksemplarer.
- Beregne antall isolerte modne celler.
5. Eldre adipocytt Dedifferentiation inn i T-25 Flask
- Fyll en 25 cm 2 vevskulturkolbe til ¾ av volumet med DMEM / F12-20% kalveserum.
- Ifølge legemer, hell 500000 modne celler i kolben. Fyll kolben fullstendig ved en 50ml tube med medium og fjerne så mange bobler som mulig.
- Skru de uventilerte tak på kolben.
- Rens kolbe med etanol før inkubering for å unngå forurensning.
- Inkuber kolben opp ned for en uke uten å berøre den for å unngå bevegelse i den kulturen som kan forstyrre mobilnettet tilslutning.
- Før reverse kolben ved 7 dager invertert kultur, forsiktig manipulerer kolben og fjerne all medium i kolben ved aspirasjon, unngå brå bevegelser.
- Tilsett 12 ml DMEM-F12-20% kalveserum og dyrke celler med standardteknikker. En filtrert, ventilert hette, kan tilsettes til kolben.
6. Eldre adipocytt Dedifferentiation til en 6-brønns plate
- Plassere et dekkglass på bunnen av hver brønn i en 6-brønns plate
- Legg en ½ "plasthylsen på toppen av hver dekkglass.
- Fylle brønnene med 8 ml av 20% kalveserum-DMEM-medium.
- Sett en dekkglass på hver plasthylsen.
- Sett pipettespissen mellom raset og røret for å injisere celler under raset (50.000 celler per brønn).
- Inkuber platene i en standard cellekulturinkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i en uke.
- Omvendt dekkglass med festede celler i hver brønn inneholdende 2 ml media supplert med 20% kalveserum og forfølge kultur.
- Bruk dekkglass med celler som gjennomgår dedifferentiation for flere formål, inkludert immunfluorescens (teknikk ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Store morfologiske endringer skjer til modne adipocytter under dedifferentiation (figur 1). Som vist i figur 2, ble celler som gjennomgår dedifferentiation farget med et anti-FABP4 antistoff for fluorescens-analyse. Celler med en rund morfologi uttrykte FABP4 proteinet, mens de fleste av fibroblast-lignende celler ikke. Etter dedifferentiation, kan DFAT celler dyrkes med standardprosedyrer for flere passasjer. Vi har vært i stand til å nå mer enn 15 passeringer for human oment og subkutane DFAT-cellelinjer (data ikke vist).
Figur 1. Morfologi av dedifferentiating modne adipocytter over tid (A) i 4 dager (B) i 7 dager og (C) etter 12 dagers dyrking. Bilder ble tatt på forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjonen ved hjelp av et fasekontrast microscope. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Påvisning av FABP4 protein i adipocytter gjennomgår dedifferentiation. Celler ble løst etter 13 dager med dedifferentiation og farget med anti-FABP4 antistoff for immunfluorescens. Kjerner ble visualisert med DAPI farging. Venstre: Lysfelt bilde av tilsvarende immunfluorescens. Høyre: Den sammenslåtte bildet vises (FABP4-rød, Nuclei-blå-10X). Adipocytter med rund morfologi uttrykkelig FABP4, en moden markør fettceller, mens langstrakte celler ikke lenger uttrykke det. Målestokk: 1 enhet = 0,25 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dedifferentiation av modne adipocytter med taket kultur teknikk er en ny tilnærming for å oppnå adipose stamceller fra et lite utvalg av innfødte fettvev. Basert på vår erfaring og andres to, er ett gram vev tilstrekkelig til plate en 25-cm 2 kolbe og for å få en befolkning på DFAT celler som homogenitet har blitt demonstrert av Poloni og samarbeidspartnere tre. Fettceller dedifferentiation synes mulig med celler fra noen donor, uavhengig av alder, kjønn og andre egenskaper. Blant de resulterende populasjon av DFAT oppnådd, er det fortsatt noen få runde eller delvis langstrakte celler som ikke fullt ut dedifferentiate. Disse cellene er vanligvis forkastet gjennom kultur passasje som de flyter i trypsin-mediemiksen.
Multipotency av disse cellene er etablert og støtter deres anvendelse for celleterapi 2,3. Deres høye proliferativ Kapasiteten er også rapportert, som jegsa verdifull del av cellekultur for stamcelle applikasjoner to. Studier med humane DFAT celler indikerte at de kan være mer effektive enn ASC fra den samme donor, basert på deres replikative og differensieringskapasitet 18. En fersk case study støtter at DFAT cellene var mer effektivt å differensiere i adipocytter og osteoblaster, og hadde høyere telomerase nivåer enn ASC fra samme individ, en donor med fedme og diabetes 18. Således kan bruken av taket kultur gi mer effektive adipose stamceller enn den som allerede er brukt ASC. Imidlertid er flere eksperimenter for å vurdere klart dette punktet.
Vår 6-brønns plate tak dyrkningsteknikk tillater studiet av dedifferentiation prosessen. Et minimalt antall celler kan bli belagt, og gjør det mulig for studiet av bestemte tidspunkter. For eksempel, vi samlet mikroskop lysbilde fra en seks-brønns plate å utføre immunfluorescens fra adipocytter undergoing dedifferentiation (figur 2). Utføre miscroscopy, med eller uten fluorescens, er svært relevant å vurdere ulike sider ved dedifferentiation.
I tillegg til stamcelle applikasjoner, kan DFAT celler representerer en interessant modell for fysiologiske studier. Bare noen få studier undersøkt genuttrykk og funksjoner av begge celletyper. I korte trekk, ASC og DFAT fra samme fett rommet viste likheter i genuttrykk og sekresjon 4. Flere sammenligninger mellom ASC og DFAT fra den samme donor er nødvendig.
I konklusjonen, vi viser i denne tekniske rapporten hvordan du får tak DFAT celler fra humant fettvev bruker veletablert teknikk av fettvev collagenase fordøyelsen og taket kultur teknikk. Vår opprinnelige seks-brønns plate format kan bidra til å øke kunnskapen om dedifferentiation prosessen mens den mer brukte kolbe metoden gjør det mulig for generering av større befolklinger av DFAT celler. Den store begrensning av denne protokollen er tilgangen til humant fettvev som er avhengig av samarbeid med en operasjon team og etikk ledelsen å få pasienten skrevet og informert samtykke. Modne celler er svært følsomme som krever forholdsregler i manipulasjon. Vi optimalisert protokollen, spesielt antallet adipocytter å bli belagt i T-25flask og 6-brønners plateformat, for å oppnå optimale resultater, og kan forventes ingen vesentlige ytterligere modifikasjoner eller feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
