Protocol
Ethics Statement: Das Projekt wurde von Forschungsethikkommission IUCPQ die vor der Rekrutierung von Patienten zugelassen. Für die Zwecke dieses Artikels / Video, erhalten wir Gewebe von 2 Patienten: 1) ein 62 Jahre alten männlichen Patienten mit einem BMI von 50,7 kg / m 2 und 2) eine 35-jährige Patientin mit einem BMI von 57 kg / m 2. Experimente können mit beiden Fettkompartimente geführt werden, sondern müssen eine Fettkammer für die Zwecke dieser Video beschränkt. Technische Aspekte der Video wurden mit Patienten-1 durchgeführt, und FABP4 Immunofluoreszenz wurde mit undifferenzierten Zellen von Patienten 2 durchgeführt.
1. Probenbearbeitung
- Frag Chirurgen Fettgewebe aus den omentalis und subkutane Fett Fächer bei der laparoskopischen Adipositaschirurgie zu sammeln.
- Bringen schnell adipose Proben an das Labor bei RT und sofort verarbeitet.
- Führen Verdauung im Labor, in einer nicht sterilen Atmosphäre. DieZellen werden schließlich zu dem Kulturraum überführt und unter sterilen Bedingungen kultiviert werden. Um Verunreinigungen zu vermeiden, bereiten KRH-Puffer mit destilliertem Wasser und filtriert, und folgen Sie durch eine Filtration (0,22 um Filter) vor dem Aufschluss. Gründlich reinigen Rohre mit Ethanol vor Transfer in die Zellkultur Haube für Kolben und Plattenherstellung.
- Zeigen Fettgewebe auf einem bereits gewichtet Gericht und Rekordgewicht. Fix ein kleines Stück von jeder Gewebeprobe (weniger als 1 cm 2) in 10% Formalin-Puffer bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. Verwenden Sie diese eingebetteten Probe für die Immunhistochemie Experimente (Technik nicht gezeigt).
- Stellen Sie ein weiteres Stück in einem 50-ml-Tube und Flash-freeze in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 ° C für weitere Studien auf ganzen Fettgewebe (zB Genexpression - Technik nicht gezeigt).
2. Kollagenaseverdau
- Legen Sie die übrigen Fettgewebe Stück in einem 50 ml-tuist für die Verdauung.
- 4 ml KRH-WB mit Collagenase (350 U / ml) ergänzt pro Gramm Probe in dem Aufschlußbehälter.
- Hackfleisch Fettgewebe mit einer Schere.
- Platzieren Hackfleisch Fettgewebe Suspension in einem Schüttler bei 37 ° C, 90 Upm maximale, für eine 45-minütige Inkubation (für 1 h).
3. Reinigung von Adipozyten und Präadipozyten
- Gießen Sie das durchscheinende Lösung mit wenigen Stücke von Fett durch ein 400 & mgr; M Nylon Netz in einen Kunststoffbecher.
- Mit Pinzette, reiben Sie die Zellpräparation auf der Nylon-Mesh und wäscht mit 5 ml KRH-WB.
- Die filtrierte Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen mit dem Kunststoffschlauch in ihm und einer 60 cm³-Spritze am Rohrglied befestigbar zart zu übertragen.
- Lassen Sie die Suspension mit reifen Fettzellen stehen für etwa 10 Minuten, so dass die Zellen an die Spitze des Puffers durch Flotation zu erreichen.
- Langsam absaugen Puffer am Boden des Röhrchens mit 60cc syringe Absaugung.
- 20 ml KRH-WB zu waschen. Wiederholen Sie ab Schritt 3.4 für 2 zusätzliche Wäschen.
- Sammeln Sie den Puffer, um die Adipozyten Suspension bis zu einem Endvolumen von 5 bzw. 10 ml zu bringen, abhängig von der Zellmenge. Verfolgen Sie mit den Schritten in Abschnitt 5.
- Wiederherstellen des Stroma-Kreisfraktion aus der mit dem 60 cm³-Spritze durch Zentrifugation (3000 rpm, RT, 5 min) zur weiteren primären Zellkultur gesammelt falls Puffer (Technik nicht gezeigt).
4. Mature Adipocyte Zellzahl
- Last 10 ul sanft geschüttelt Adipozyten-Suspension in einer Zählkammer (Hämozytometer). Führen Zellzahl in vierfacher Ausfertigung.
- Berechnung der Anzahl der isolierten reifen Zellen.
5. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in T-25-Kolben
- Ein 25 cm 2 Zellkulturflasche auf das Volumen mit DMEM / F12-20% Kälberserum ¾ füllen.
- Nach Zellzahl, gießen 500.000 reifen Zellen in den Kolben. Der Kolben wird komplett mit einem 50 ml Röhrchen mit Medium Füllen Sie und entfernen Sie so viele Blasen wie möglich.
- Schrauben Sie den unbelüfteten Kappe auf den Kolben.
- Der Kolben wird mit Ethanol vor der Inkubation zur Vermeidung von Verunreinigungen zu säubern.
- Die Flasche auf den Kopf für eine Woche Inkubation ohne es zu berühren, um eine Bewegung in der Kultur, die Zelladhärenzfaktor stören könnten.
- Vor der Umkehr des Kolbens bei 7 Tagen nach der umgekehrten Kultur vorsichtig die Flasche zu manipulieren und entfernen Sie alle Medium im Kolben durch Aspiration, die Vermeidung abrupter Bewegungen.
- Fügen Sie 12 ml DMEM-F12-20% Kälberserum und pflegen Zellen mit Standardtechniken. Eine gefilterte, belüfteten Kappe kann in den Kolben gegeben werden.
6. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in einer 6-Well-Platte
- Legen Sie ein Deckglas auf dem Boden jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen
- Fügen Sie einen ½ "Kunststoffbuchse auf der jeweils Deckglas.
- Füllen Vertiefungen mit 8 ml 20% Kälberserum-DMEM Medium.
- Setzen Sie ein Deckglas auf jedem Kunststoffbuchse.
- Legen Pipettenspitze zwischen dem Schieber und dem Rohr, Zellen unter dem Objektträger zu injizieren (50.000 Zellen pro Vertiefung).
- Platten in einem Standardzellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 für eine Woche.
- Reverse Deckglas mit anhaftenden Zellen in jeder Vertiefung, die 2 ml Medium mit 20% Kälberserum und verfolgen Kultur.
- Verwenden Deck mit Zellen, die eine Dedifferenzierung für mehrere Zwecke, einschließlich Immunfluoreszenz (Technik nicht gezeigt).
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Representative Results
Wichtige morphologische Veränderungen auftreten, um Fettzellen während der Entdifferenzierung (Abbildung 1) zu reifen. Wie in Figur 2 gezeigt ist, wurden Zellen, die eine Dedifferenzierung mit einem Anti FABP4 Antikörper zur Fluoreszenz-Analyse gefärbt. Zellen mit einem runden Morphologie äußerte die FABP4 Protein, während die Mehrheit der Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht. Nach Entdifferenzierung kann DFAT Zellen mit Standardverfahren für mehrere Passagen kultiviert werden. Wir sind in der Lage, mehr als 15 Passagen für den menschlichen omentalis und subkutane DFAT Zelllinien zu erreichen (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1. Morphologie der Entdifferenzierung reifen Adipozyten mit der Zeit (A) bei 4 Tagen (B) nach 7 Tagen und (C) nach 12 Tagen Kultur. Bilder wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubation entnommen unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskope. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Nachweis von FABP4 Protein in Adipozyten unterzogen Entdifferenzierung. Die Zellen wurden nach 13 Tagen der Entdifferenzierung fixiert und mit anti-FABP4 Antikörper zur Immunfluoreszenz gefärbt. Die Zellkerne wurden mit DAPI-Färbung sichtbar gemacht. Links: Hellfeldaufnahme entsprechende Immunfluoreszenz. Rechts: Die zusammengefügte Bild wird angezeigt (FABP4-rot, blau-Kerne-10X). Adipozyten mit runden Morphologie ausdrückliche FABP4, einer reifen Adipozyten-Marker, während längliche Zellen exprimieren nicht mehr. Maßstab: 1 Stück = 0,25 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Entdifferenzierung von reifen Fettzellen mit der Decke Kulturtechnik ist ein neues Konzept für die Fettgewebestammzellen aus einer kleinen Probe von einheimischen Fettgewebe erhalten. Aufgrund unserer Erfahrungen und die der anderen 2 ist ein Gramm Gewebe ausreichend, um eine 25-cm 2-Kolben Platte und eine Bevölkerung von DFAT Zellen, für die Homogenität von Poloni und Mitarbeiter 3 gezeigt zu erhalten. Adipocyte Entdifferenzierung scheint mit Zellen von jedem Spender möglich, unabhängig von Alter, Geschlecht und andere Merkmale. Zu der resultierenden Population von DFAT erhalten, besteht weiterhin ein paar runden oder teilweise gestreckte Zellen, die nicht voll dedifferenzieren hat. Diese Zellen werden in der Regel durch die Kulturpassage verworfen, da sie in der Trypsin-Media-Mix zu schweben.
Multipotenz dieser Zellen aufgebaut und unterstützt deren Verwendung zur Zelltherapie 2,3. Ihre hohe proliferative Kapazität ist auch berichtet worden, die ichsa wertvollen Aspekt der Zellkultur für die Stammzellanwendungen 2. Studien mit menschlichen DFAT Zellen zeigte, dass sie effizienter ist als ASC vom gleichen Spender sein kann, auf der Grundlage ihrer replikativen und Differenzierungskapazität 18. Ein jüngster Fall Studie unterstützt die DFAT Zellen effizienter zu Adipocyten und Osteoblasten zu differenzieren, und hatten höhere Niveaus als Telomerase ASC von demselben Individuum, einem Spender mit Adipositas und Diabetes 18. Somit kann die Verwendung von Decken Kultur effizienter Fettgewebsstammzellen als das bereits verwendet ASC bereitzustellen. Allerdings sind weitere Experimente erforderlich, um diesen Punkt klar zu beurteilen.
Unsere 6-Well-Platte Deckenkulturtechnik ermöglicht die Untersuchung der Entdifferenzierung Prozesses. Eine minimale Anzahl von Zellen plattiert und erlaubt die Untersuchung der spezifischen Zeitpunkten werden. Beispielsweise haben wir für die Mikroskop-Objektträger von einer Platte mit 6 Vertiefungen zu Immunofluoreszenz von Adipozyten underg auszuführenoing Dedifferenzierung (Abbildung 2). Darstellende miscroscopy, mit oder ohne Fluoreszenz ist äußerst relevant für verschiedene Aspekte der Entdifferenzierung beurteilen.
Neben Zellanwendungen stammen, kann DFAT Zellen ein interessantes Modell für physiologische Studien darstellen. Nur wenige Studien untersuchten Gen-Expression und Funktion der beiden Zelltypen. Kurz gesagt, ASC und DFAT aus dem gleichen Fettraum zeigten Ähnlichkeiten in der Genexpression und Sekretion 4. Weitere Vergleiche zwischen ASC und DFAT vom gleichen Spender erforderlich.
Abschließend zeigen wir in diesem technischen Bericht, wie man DFAT Zellen aus mit Hilfe der gut etablierte Technik des Fettgewebes Kollagenaseverdau und die Decke Kulturtechnik menschlichen Fettgewebe erhalten. Unsere ursprüngliche 6-Well-Plattenformat kann dazu beitragen, Wissen über die Entdifferenzierung Prozess, während die häufiger verwendeten Kolbenmethode ermöglicht die Erzeugung von größeren popuschriften der DFAT Zellen. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist der Zugang zu menschlichen Fettgewebe, die auf die Zusammenarbeit mit einem OP-Team und Ethikmanagement der Patienten geschrieben und informierte Zustimmung erhalten stützt. Reifen Zellen sind sehr empfindlich, welche Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung erfordert. Wir optimiert das Protokoll, insbesondere die Anzahl von Adipozyten in der T-25flask plattiert werden und die 6-well-Platten-Format, um ein optimales Ergebnis zu erhalten, und nicht erhebliche zusätzliche Modifikationen oder Fehlerbehebung kann erwartet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
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