تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

Introduction

أغشية البلازما، فضلا عن العديد من الأغشية داخل الخلايا، بمثابة الحواجز التي تفصل اثنين من مقصورات المائية. في حالة غشاء البلازما، والفصل هو بين الخارج والداخل من الخلية؛ لعضيات داخل الخلايا ومن بين السيتوبلازم والتجويف عضية. على سبيل المثال، غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER) يفصل بيئة المؤكسدة داخل تجويف ER من عصاري خلوي خفض البيئة ^1. ويتم تخليق البروتينات الغشاء على ريبوسوم المرتبط ER، وتحقيق طوبولوجيا النهائي داخل غشاء ER ^2. الاستيلاء على التوجه غشاء المناسب وطوبولوجيا للبروتينات هو أمر حاسم لوظيفتها الطبيعية. طوبولوجيا الصحيح يسمح المجالات ذات الصلة للبروتينات غشاء للتفاعل مع الشركاء ملزمة لها، لأنها تتيح التعديلات بعد متعدية حاسمة لتحدث، وذلك في حالة من البروتينات غشاء البلازما، بما يسمح للخلية للتفاعل مع ويستجيب رس بيئته. لنقدر تماما وظيفة بروتين الغشاء، لا بد من الواضح أن تعرف كيف يتم توجيه هذا البروتين فيما يتعلق غشاء من خلاله أنه يقيم، أي طوبولوجيا غشاء لها. بالإضافة إلى اكتساب المعرفة العلمية الأساسية، فهم طوبولوجيا من بروتين الغشاء والتي يتعرض لها جوانب سطح البروتين لبيئات مختلفة ميزت الآثار السريرية منذ تتكون البروتينات الغشاء غالبية أهداف الدوائية ^3. حتى وقت قريب، يقترب إلى تحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا كان يتطلب استثمارات كبيرة في الوقت والمال أو كان يتطلب الكواشف التي يصعب الحصول عليها.

على حد سواء قد استخدمت النهج التجريبية وفي سيليكون لتحديد طوبولوجيا غشاء البروتينات المقيمين داخل غشاء البلازما. منذ التنبؤات الأولى من المجالات الغشاء الذي يمتد على أساس للا مائية تقييمها من indiviالأحماض الأمينية المزدوجة ^3، والعديد من خوارزميات التنبؤ متوفرة الآن على شبكة الإنترنت، وببساطة تتطلب معرفة تسلسل الأحماض الأمينية والبروتين. ومع ذلك، غالبا ما تكون الافتراضات المركزية لمثل هذه البرامج النمذجة، والافتراضات التي يمكن أن تؤدي إلى مهام غير صحيحة طوبولوجيا ^4،5. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن لهذه التنبؤات القائمة على الحاسوب بتعيين مبدئيا المناطق التي تغطي الغشاء، أنها لا تحدد دائما ما إذا كان الأمينية أو مصطلحات كربوكسي البروتينات هي في السيتوبلازم، التجويف عضية أو الخارجي الخلية. حتى مع زيادة القوة الحسابية، واستخدام آلة التعلم خوارزميات ^6، مثل هذه البيانات لا تزال نموذجا، ويجب التحقق من صحة باستخدام البيانات التي حصل عليها تجريبيا. تم إجراء تقرير التجريبي المباشر للطوبولوجيا الغشاء باستخدام لوحات من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع الحواتم المعروف توزع في جميع أنحاء البروتين، حيث أحرز تقييم مناعية، قبل وبعد permeabilization الخلية. هذاالنهج يتطلب مجموعة من الأجسام المضادة، التي قد لا تكون متاحة للبروتين من الفائدة.

استراتيجية بديلة هو مهندس علامات حاتمة مثل MYC أو هيماغلوتينين (HA) في مواقع مختلفة في جميع أنحاء البروتين، ثم مرة أخرى عن طريق تحديد مناعية قبل وبعد permeabilization الغشاء. بالإضافة إلى علامات المناعية، كلها قد استخدمت علامات الأنزيمية (بما في ذلك الفوسفاتيز القلوية، β -galactosidase، أو β -lactamase) والتعديلات الكيميائية مثل مسح السيستين لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا ^7،8. طريقة إضافية تستخدم لرسم الخرائط الطوبوغرافية للبروتينات غشاء البلازما يعتمد على مقاربة مختلفة قليلا إلى علامات حاتمة. في هذه الطريقة تسلسل العلامة هو N-ربط تسلسل إجماع بالغليكوزيل NXS / T. منذ بالغليكوزيل يحدث فقط عندما مثل هذا التسلسل هو موجود في تجويف مسار السكروز، فإن وجود علامة في اللمعية مقابلويلاحظ حجرة عصاري خلوي بسهولة كما تحول الشامل على المواد الهلامية SDS-PAGE. وقد تم تطبيق هذا النهج إلى multispanning القناة الايونية CFTR ^9. في حين استخدمت كل هذه الأساليب، فمن الواضح أنهم جميعا تتطلب استثمارات كبيرة في مجال البيولوجيا الجزيئية لتوليد وتسلسل بنيات متعددة.

لتحديد المعلومات الطوبوغرافية المتعلقة البروتينات عبر الغشاء الموجود داخل عضيات داخل الخلايا وقد ثبت أن أكثر تحديا. تطبيق التكنولوجيات القائمة مضان ومع ذلك، جعلت تحديد الغشاء طوبولوجيا أبسط كثيرا. تقنية ثنائي الجزيء تكامل مضان (BiFC) تعتمد على التفاعل بين اثنين من شظايا غير الفلورية من بروتين فلوري، واستعادة خصائص الفلورسنت من أن البروتين ^10. على الرغم من وصف في البداية لتحديد تفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي ^10، كما تم استخدام هذا النهجلتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا في الخلايا النباتية ^11. ولكن هذا النهج هو أيضا الوقت المكثف لأنه يتطلب الجيل ليس فقط من البروتينات الانصهار مع بروتين من الفائدة ولكن أيضا مجموعة متنوعة من البروتينات الانصهار تستهدف العصارة الخلوية أو عضية التجويف، ويتطلب المعرفة التي بين الخلايا الأغشية البروتين من الفائدة تكمن في .

وقد وصفت نهج بديل أبسط لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا ^12. الفحص، الإسفار البروتياز الحماية (FPP) يتطلب توليد البروتين الانصهار بين GFP والجينات في المصالح. ويستند هذا النهج على إمكانية الوصول النسبي للالبروتياز غير محددة لشاردة GFP. اعتمادا على ما إذا GFP محمي من التحلل البروتيني من قبل المقيمين في لمعة من العضيات داخل الخلايا أو يتعرض لالتحلل البروتيني من خلال كونها موجودة في العصارة الخلوية. وهكذا، إذا شاردة GFP على البروتين من الفائدة تواجه السيتوبلازم، فانها ستكون معرضة لنشاط الأنزيم البروتيني وإشارة مضان خسر. على العكس، إذا شاردة GFP على البروتين من الفائدة تواجه بيئة 'محمية' من البروتيني (مثل التجويف جولجي) ثم فإن إشارة مضان تستمر.

للسماح البروتياز لدخول الخلية، ولكن لا تدخل مقصورات غشاء الخلايا ويستخدم الكوليسترول ملزمة ديجيتونين المخدرات. الكولسترول هو ستيرول المهيمن في الفقاريات، وإثراء تحديدا في غشاء البلازما نسبة إلى المقصورات داخل الخلايا. السم غليكوزيدات، ديجيتونين، يستخرج من نبات الديجيتال الأرجواني. ديجيتونين يتعاطف مع الكولسترول أغشية الغنية، حيث أنه يؤدي إلى غشاء انتقائي permeabiliztion ^14،16 (الشكل 1). بالإضافة إلى السماح بخروج عناصر عصاري خلوي صغيرة، يسمح permeabilization ديجيتونين أيضا دخول جزيئات الخارجية، مثل K بروتين أو التربسين. بروتوكول FPP يستفيد من القوات المسلحة الكونغوليةر التي تحتوي على غشاء البلازما تصل إلى 80٪ من الكولسترول الخلوي ^17، في حين العضيات الأخرى، مثل ER، جولجي، الإندوسومات، الميتوكوندريا، والتي تحتوي على محتوى الكولسترول منخفض جدا، لا تزال سليمة ^14. وقد لوحظ إدراج الانتقائي للالكولسترول في غشاء البلازما في العديد من الخلايا حقيقية النواة، السماح باستخدام تعتمد على ديجيتونين permeabilization غشاء البلازما في مثل هذه الأنواع حقيقية النواة متنوعة مثل S. الخباز لالبشري ^14،18. يوفر الفحص FPP وسيلة بسيطة وسريعة وقوية نسبيا من تحديد (أ) ما إذا كان البروتين هو غشاء ملزمة / اسوشيتد أو إنتشاري بحرية في العصارة الخلوية و (ب) والذي المجال من البروتين غشاء يواجه العصارة الخلوية أو عضية التجويف. يجب أن بروتين الغشاء لديها توجهات متعددة، فإن إشارة تنشأ من النموذج المهيمن، ولن يتم الكشف عن أشكال طفيفة. في حين يمكن أن يكون هناك بعض القلق من أن إضافة شاردة GFP للبروتين على الفائدة قد تؤثر على وظيفة، و/ أو توطين التحت خلوية، وهذا هو في الواقع أكثر من النظري الفعلية. في الواقع العديد من الدراسات قد أظهرت بوضوح أن العلامة GFP لا يغير خصائص البروتين ^19،20.

Protocol

1. الجيل والتحقق من الوهم بروتين فلوري

1. إلحاق البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى الأمينية أو الكربوكسيل مصطلحات من البروتين ذات الاهتمام باستخدام استراتيجيات الحمض النووي المؤتلف القياسية ^13.
   ملاحظة: على الرغم من أننا قد استخدمت على نطاق واسع GFP، متغيرات أخرى مثل البروتين سماوي نيون (CFP)، والأصفر البروتين الفلوري (YFP)، DsRed وmCherry يمكن استخدام. يجري باستمرار تحسينات في fluorophore للطي الكفاءة والسطوع وصمود، ويجب أن المحققين الاستفادة من أحدث البنى جيل.
   1. تأكيد تسلسل DNA الصحيح والتأكد من أن شاردة GFP هي في الإطار مع البروتين من الفائدة. أداء التسلسل باستخدام استراتيجيات الحمض النووي المؤتلف القياسية ^21.
      ملاحظة: العديد من المؤسسات لديها مرافق DNA الأساسية، التي شجعت المحقق في الاتصال للحصول على معلومات إضافية.
   2. للبروتينات غشاء تمريرة واحدة أو مزدوجة، وتوليدكلا الإصدارين محطة جذر الأمينو والكربوكسيل من البروتينات الانصهار ^19.
   3. للبروتينات والتي تمتد متعددة إدراج GFP داخل حلقات extramembrane المفترضة، فضلا عن مصطلحات. عناية خاصة عند إنشاء الوهم عبر الغشاء مع انصهار بروتين فلوري تعلق على محطة الأمينية من البروتين الهدف وغالبا ما المشقوق متواليات إشارة من التحلل البروتيني مرة واحدة وقد مرت البروتين من خلال translocon ER.
   4. في حالة تسلسل إشارة موجودة، إدراج البروتين الفلوري الانصهار القاصي الى الموقع الانقسام وذلك لتوليد البروتين ناضجة تحتوي على الأمينية محطة بروتين فلوري الموسومة سليمة. توظيف استراتيجيات الدنا القياسية لتوليد الوهم ^21.
2. تحديد وجود ما يكفي من إشارة الفلورسنت المترجمة بشكل مناسب في خط خلية من الفائدة.
   1. مراقبة الخلايا تحت المجهر epifluorescence باستخدام مضان لا يتجزأ من GFP تحت appropriأكل مرشح تضع شروطا. لمجموعات مرشح GFP التي تشمل 510-560 نانومتر، تأكد من أن يتم استخدام مرشحات الصحيحة لfluorophore المستخدمة.
      ملاحظة: يتم تحقيق إشارة كافية عند تقييم بالعين تقدم إشارة قوية بما فيه الكفاية أن الهيكل الخلوي داخل التي تكمن في إشارة وحلها بسهولة فوق الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك يجب أن يكون نمط تلطيخ من GFP البروتين يتسق مع أن من علامات لعضية المناسبة، ويفضل أن يكون متطابقة إلى أن من البروتين غير محدد الأصلي.
3. تحديد ما إذا كان سيتم استخدام نهج ترنسفكأيشن مستقرة أو عابرة بناء على بروتين يجري تقييمها.
   ملاحظة: transfectants مستقرة تحمل عموما انخفاض مستويات التعبير من أنظمة عابرة. على الرغم من أن التعبير عابرة ينتج التعبير مستوى عال من البروتينات وشدة زيادة إشارة (~ 5-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن اعتمادا على البروتين)، فإنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى القطع الأثرية overexpression مثل البروتين aggregation أو تشبع البروتين استهداف الممرات، مما يؤدي إلى توطين التحت خلوية الخاطئ.

2. ترنسفكأيشن من خلايا والثقافة خلية

ملاحظة: مجموعة متنوعة من خلايا قابلة للتحليل FPP، بما في ذلك HEK293، هيلا، COS-7 والخلايا CHO ^14. ويستند الوصف التالي على التعبير عن البروتينات في خلايا الغشاء HEK293.

1. تنمو خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293)، والطبقات الوحيدة ملتصقة في 6 مل من Dulbecco لتعديل النسور المتوسطة (DMEM)، على أن تستكمل مع المصل 5٪ بقري جنيني (FBS)، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 250 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتومايسين على 37 درجة C مع 5٪ CO _2. أداء جميع الأعمال مع الخلايا في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة. تنمو الخلايا في مستنبت حتى ~ 80٪ متكدسة في T-75 قارورة.
2. خلايا بالنقل باستخدام أي معيار الكفاءة العالية، وانخفاض السمية طريقة ترنسفكأيشن، بما في ذلك lipid- والتكنولوجيات viral- أو القائم على Electroporation لللتوليد transienر أو التعبير مستقر. عادة 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 1 × 10 ⁶ خلايا يعطي جيد استنساخه التعبير البروتين. الحفاظ على خلايا ل5-48 ساعة في مناسبة وسائل الإعلام زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في CO ₂ قادرة حاضنة زراعة الأنسجة.
3. مراقبة الخلايا للتعبير عن البروتين GFP الانصهار باستخدام المجهر epifluorescence، وذلك باستخدام إشارة مضان الجوهرية للGFP، وذلك باستخدام مجموعات مرشح المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إشارة مضان عادة تصل كحد أقصى في غضون 24-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. استخدام الخلايا عندما تصل إشارة مضان أقصى مستوى. رصد مستويات البروتين التعبير من خلال تحليل طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد أي من البروتين من الفائدة أو شاردة GFP.
4. للخلايا لوحة تحليل التجريبية coverslips على المغلفة. عرض إما تحت تكوين الخلية الحية أو تثبيت التالية وجبل على الشرائح المجهر. خلايا لوحة لتحقيق 60٪ -80٪ ​​التقاء ضمن 24-48 ساعة.
   1. coverslips معطف مع حل بولي يسين (0.1 ملغ / مل)، بحيث يتم تغطية السطح بأكمله. احتضان لمدة 30 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة، تليها 60 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. إزالة الزائد بولي يسين وشطف لل coverslips في برنامج تلفزيوني 3 مرات.
   2. بدلا من ذلك، لوحة الخلايا على غرف غطاء من الزجاج يتكون من لوحات ثقافة الخلية مع أسفل الزجاج البصري للسماح التصوير المباشر مع الأهداف النفط الغمر. الإعداد المجهر الفعلي يعتمد على المعدات المتاحة للمحقق، ولكن ينبغي أن تكون قادرة على حل التغيرات السريعة. اعتمادا على نوع من الخلايا والخلايا الشكل، يجب أن تكون الخلايا حول 60-90٪ متكدسة في وقت الفحص FPP.

3. إعداد المجهر مضان

1. استخدام الفتحة العددية (NA) هدف عالية للنفط غمر لجمع إشارة القصوى والقرار المكانية، مثل 60X، NA 1.42 هدف الغمر النفط. استخدام عشرالبريد التالية الليزر لتحفيز fluorophores: غاز الأرجون 488 نانومتر (GFP وYFP) و 561 الصمام الثنائي (RFP، mCherry).
2. تحديد التعريض الضوئي، وزيادة والتقاط الأمثل معدل من الصور لكل بناء. ضبط كثافة الليزر وزمن التعرض لتقليل photobleaching من (راجع الخطوة 7.1.2).
3. للدراسات باستخدام fluorophores متعددة (على سبيل المثال، علامة قابلة للذوبان لpermeabilization غشاء بالتنسيق مع غشاء البروتين علامة)، واختيار مرشح مناسب يحدد لتقليل إشارة عبر الحديث وتعظيم نسب الإشارة إلى الضوضاء.

4. إنشاء الظروف المثلى لغشاء البلازما Permeabilization

1. إزالة مستنبت خلية من خلايا يعبر فقط عن البروتينات الفلورية القابلة للذوبان (مثل EGFP، DsRed). غسل الخلايا 3 مرات (1 دقيقة لكل منهما) في KHM عازلة (110 ملي خلات البوتاسيوم، 3 ملي MgCl ₂ و 20 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2). إجراء تجارب على خلايا وجميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة.
2. مكان الخلايا سن coverslips (انظر الخطوة 2.4) في المخزن KHM على مرحلة مضان المجهر وجمع الصورة الأولى، التي تمثل السيطرة "غير permeabilized" المرحلة.
3. لpermeabilize انتقائي غشاء البلازما، إضافة ديجيتونين (30 ميكرومتر) في المخزن KHM إلى الخلايا. يروي الخلايا مع عازلة (عازلة + ديجيتونين) بمعدل 5 مل / دقيقة لل10-60 ثانية.
4. تحديد تركيز ديجيتونين الأمثل تدريجيا عن طريق زيادة تركيز ديجيتونين. ويتحقق تركيز ديجيتونين الأمثل عندما يكون هناك فقدان كامل للإشارة مضان من EGFP للذوبان داخل 10-60 ثانية من تطبيق ديجيتونين. بالنسبة لكثير من خلايا تطبيق 10-50 ميكرومتر ديجيتونين يكفي لpermeabilize غشاء الخلية.
   1. للاستخدام في جميع التطبيقات أدنى تركيز ممكن من ديجيتونين. جمع الصور بعد ديجيتونين permeabilization للإشارة الخلفية permeabilized.
5. تأكد من أن الوهم GFP البروتين من الفائدة هو الغشاء فيو tegrated بتأكيد الاحتفاظ الخلوي للإشارة مضان التالية permeabilization ديجيتونين من غشاء البلازما ^16.
   1. إبداء عضية محددة البروتين الفلوري ^23. بروتينات الميتوكوندريا تعمل بشكل جيد في هذا الصدد ^16، على سبيل المثال، pDsRed2-ميتو النواقل. تحديد الظروف المثلى التعبير كما هو موضح في الخطوة 2.1.
   2. تأكد من أن تركيز ديجيتونين مناسب لنوع من الخلايا المستخدمة عن طريق ضمان أن مورفولوجية العضيات داخل الخلايا يبقى ثابتا على مدى فترات طويلة (تصل إلى 60 دقيقة) التعرض لديجيتونين.
      ملاحظة: استخدام البروتوكولات القياسية المناعي المجهري باستخدام الأجسام المضادة ضد مختلف مقصورات الخلوية، مثل الجسيمات الحالة (على سبيل المثال، LAMP1)، جولجي (على سبيل المثال، TGN38)، الشبكة الإندوبلازمية (على سبيل المثال، calnexin)، الإندوسومات (على سبيل المثال، Rab5)، الميتوكوندريا (على سبيل المثال، السيتوكروم ج). إذا عضية داخل الخلايا تغيرات مورفولوجية / سلامة اوفه بشكل كبيرص 60 دقيقة، فإنه من المرجح أن تركيز ديجيتونين كان مرتفعا للغاية، ويتطلب حدوث انخفاض في تركيز ديجيتونين و / أو وقت التعرض.
      ملاحظة: ديجيتونين سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).

5. البروتياز علاج نيون البروتينات

1. غسل الخلايا في المخزن KHM ثم قم بإضافة البروتيني (بروتين K و 50 ميكروغرام / مل في المخزن KHM) مباشرة على الخلايا. يروي الخلايا بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة باستخدام الجاذبية تغذية نظام نضح لحمام باستمرار التحضير.
   1. متجر الحلول في 50 مل المحاقن وأنابيب البولي ايثيلين إتصال خزانات مستقلة لمشعب مع منفذ واحد في الحمام (5 مل / دقيقة معدل التدفق). ضع ماصة شفط للحفاظ على ثابت (0.5 مل) حجم حمام وتحقيق التبادل حل عن طريق التحول يدويا بين الخزانات الارواء.
2. جمع الصور لتحديد ما إذا كان فلورياستمرت إشارة escent أو يحط. خسارة من> 90٪ من كثافة إشارة أولية على 30-60 ثانية تتفق مع تدهور بروتين من الوهم GFP البروتين (انظر ممثل النتائج).
3. إذا لوحظ أي تدهور إشارة مع بروتين K، عندما يتوقع هذه الخسارة، استبدال بروتين K حل مع التربسين (4-8 ملم) في المخزن KHM. إذا لزم الأمر، واستخدام خليط من بروتين K والتربسين. ليست هناك حاجة لإخماد نشاط الأنزيم البروتيني.

6. نهج بديل لالبلازما غشاء البروتينات مع المجالات الخارجية

1. للبروتينات غشاء البلازما، وإجراء فحص للبروتينات الفلورسنت الخارجية الوهم قبل ديجيتونين permeabilization. غسل الخلايا coverslips على العازلة في KHM (5 مل / دقيقة × 3 دقيقة)، والتقاط صورة للعلاج قبل الأنزيم البروتيني وقياس ما قبل الأنزيم البروتيني إشارة مضان كما في الخطوة 7.
2. كشف الخلايا لالبروتيني (بروتين K و 50 ميكروغرام / مل أو التربسين 4-8 ملم في المخزن KHM) في ركان غياب ديجيتونين التي كتبها perfusing الخلايا مع KHM وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنزيم البروتيني (معدل تدفق 5 مل / دقيقة). جمع الصور من بروتين فلوري، لتحديد كيفية بسرعة يختفي إشارة أو كم من الوقت استمرت إشارة.
3. قبل permeabilization ديجيتونين، ويشفي كل نشاط الأنزيم البروتيني، عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات (1 دقيقة لكل منهما) في الخلية سائل الإعلام والثقافة التي تحتوي على 10٪ مصل (FBS).
4. غسل الخلايا عن طريق perfusing مع KHM عازلة (معدل التدفق من 5 مل / دقيقة) لمدة 2 دقيقة. الحصول على صورة ما قبل permeabilization. Permeabilize غشاء الخلية كما هو موضح في الخطوة 4.
5. جمع الصور التالية الأنزيم البروتيني إضافة إلى ذلك كما هو موضح في الخطوة 5.

7. تحليل صورة

1. استخدام مجهر مقلوب قادرة على "العيش خلية" التسجيل، الذي فقدان إشارة مضان يمكن رصدها في الوقت الحقيقي. للمراقبة المستمرة، وتوظيف المعلمات متطابقة (زمن التعرض، وزيادة وكثافة الليزر، الخ).
   1. تحديد والخبيرالمعلمات imental من خلال مراقبة إشارة مضان من GFP البروتين الفائدة في ظل ظروف السيطرة (أي KBH العازلة وحدها). ضبط إعدادات مكاسب، وكثافة الليزر والتعرض الوقت على المجهر يحركها الكمبيوتر لضمان عدم وجود أي خسائر ملموسة من كثافة إشارة على مدى فترة 10-20 دقيقة.
      ملاحظة: شدة الإشارة ليست قيمة مطلقة، ولكن على أساس نظام المجهر والإعدادات المتاحة لكل PI. رصد التغيرات في كثافة مضان النسبية.
2. بدلا من ذلك، علاج الخلايا في مجموعة نقاط الوقت في ديجيتونين تليها الأنزيم البروتيني، وإصلاح الخلايا قبل تصاعد coverslips على للتصوير. تحديد نقاط زمنية وفقا للإجراءات في الخطوتين 4 و 5. للحصول على التحقيق الأولي تجريبيا، وبدء في 0، 30، 60، 120 و 300 بالإضافة آخر ثانية من ديجيتونين أو البروتيني.
   1. إصلاح الخلايا (20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) باستخدام كمية كافية من تثبيتي (3.7٪ امتصاص العرق في PBS) لغمر عشر بالكاملخلايا البريد.
   2. إخماد امتصاص العرق المتبقي قبل الشطف الخلايا مع PBS تحتوي على 20 ملي الجلايسين (3 × 5 دقائق).
   3. جبل coverslips عن طريق إزالة السائل الزائد من ساترة وعكس ساترة على 50 ميكرولتر وسائل الاعلام المتزايدة على المجهر الشرائح الزجاجية للتصوير. تسمح الشرائح لتجف بين عشية وضحاها قبل التصوير.
3. جمع الصور مضان المجهر (تحت الفلاتر المناسبة يحدد متوافق مع fluorophore المستخدمة) باستخدام وظيفة التقاط صورة الفيديو على الكمبيوتر التي تسيطر عليها المجهر مضان.
4. قياس شدة إشارة الفلورسنت بوصفها وظيفة من حالة الحضانة. الحصول على كثافة بكسل يعني داخل المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ان يرفق خلية فردية.

Representative Results

البلازما غشاء Permeabilization

يتم تحديد كفاءة permeabilization غشاء البلازما عن طريق استخدام البروتينات الفلورية القابلة للذوبان (على سبيل المثال، GFP، DsRed) (الخطوة 4). هذه البروتينات، عندما أعرب في الخلايا، أحرار في نشر في العصارة الخلوية، وتضيع عند permeabilized غشاء البلازما باستخدام ديجيتونين (الشكل 2). واختفاء كامل للإشارة الفلورسنت يجب أن يحدث في غضون 10-60 ثانية من تطبيق ديجيتونين. ويتحقق تأكيد أن يرتبط البروتين في المصالح مع العضيات داخل الخلايا بالإشارة إلى الإبقاء على إشارة الفلورسنت التالية permeabilization ديجيتونين.

البروتيني العلاج

وبعد جيل ناجح من الوهم الفلورسنت بين البروتين من الفائدة والبروتين الفلوري (GFP، YFP، وما إلى ذلك) (الخطوة 1) والتعبير عن بروتين فلوري في الخلايا (الخطوة 2)، والعلاج سوف خلايا permeabilized مع البروتيني توفر معلومات عما إذا كان fluorophore (والمجاور للنطاق البروتين) هي في العصارة الخلوية والوصول إلى البروتيني الهضم، أو تقع داخل التجويف عضية وبالتالي حمايتها من البروتيني الهضم (الخطوة 4). LMTK2 عبارة عن غشاء الراسية كيناز ^15، واستخدمت المقايسات حماية مضان البروتيني لتحديد طوبولوجيا غشاء لها ^(16). وقد تنصهر الذيل الكربوكسيل من LMTK2 إلى GFP وأعرب عابر. فقد الفلورسنت إشارة LMTK2-GFP بسرعة بعد إضافة بروتين K، مما يدل على مكان وجود محطة الكربوكسيل من LMTK2 كونها تقع داخل العصارة الخلوية (الشكل 3). Caveolin-GFP (Cav1-GFP) ¹⁷ هو بروتين غشاء البلازما مع-شاردة GFP المرفقة إلى المجال عصاري خلوي. كما هو الحال مع LMTK2، إشارة من caveolin-YFP وديجيتونين حساسة، ولكن حساسية لإضافة لاحقة من البروتيني (الشكل 3).

ر "> ويمكن أيضا تحديد اللمعية البروتينات القابلة للذوبان باستخدام بروتوكول FPP. في هذا المثال، يتم إلحاق ER إشارة الاحتفاظ KDEL إلى DsRed. وعلى النقيض من إشارات من LMTK2 وcaveolin، إشارة من KDEL-DsRed هي حساسة لكلا ديجيتونين والبروتيني، كما ديجيتونين غير قادر على permeabilize غشاء ER وإشارة الفلورسنت محمي من التدهور البروتيني. مثال على نطاق الغشاء الموجود داخل تجويف تعطى من قبل البروتين الميتوكوندريا وعضية هو فرعية الثامن من السيتوكروم البشري ج أوكسيديز ^18،19. pDsRed-غمر، يشفر بروتين أحمر فلوري من Discosoma س. تنصهر في الميتوكوندريا استهداف تسلسل من السيتوكروم ج أوكسيديز. وفي الخلايا معربا عن pDsRed-ميتو، ويعتبر إشارة الفلورسنت في الخلية. وبعد permeabilization ديجيتونين، إشارة الفلورسنت المرتبطة pDSRed-ميتو تبقى مستقرة. وعلاوة على ذلك، بعد إضافة بروتين K، مضان المرتبطة pDsRed-ميتو لا يزال قائما، يخدع sistent مع fluorophore في الميتوكوندريا ولم تتعرض لالعصارة الخلوية وبالتالي حمايتهم من نشاط الأنزيم البروتيني (الشكل 3).

خارج الخلية المجالات

العلاج البروتيني من الخلايا غير permeabilized يجب أن يطفئ بسرعة إشارة مضان عندما شاردة الفلورسنت تعلق على بروتين الغشاء يواجه الخارج الخلية. وglycosylphosphatidylinositol (GPI) الراسية بروتين بي ار بي ²⁰ بمثابة مثال ممتاز. وبناء تحتوي على بروتين فلوري أصفر (YFP) تعلق على محطة الأمينية من بي ار بي (YFP-بي ار بي) ^21،22، هدية سخية من الدكتور ايهود كوهين، من الجامعة العبرية في القدس. قبل البروتيني العلاج، وكانت إشارة الفلورسنت من YFP خارج الخلية مشرق (الشكل 4). بعد العلاج البروتيني، اختفت إشارة مضان خارج الخلية بسرعة.

اعتبارات الوقت

الحمار = "jove_content"> الخطوة 2 تتطلب ساعة للعد الخلايا، وترنسفكأيشن والطلاء، بالإضافة إلى 6-24 ساعة للكشف عن البروتين التعبير في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. الخطوات 4-6 تتطلب حوالي 20-30 دقيقة لكل ساترة لجمع الصور من قبل المعالجة، ديجيتونين والبروتيني الإضافات. الخطوة 7، وتحليل البيانات، وإشارة الكميات تتطلب 10-30 دقيقة أخرى في العينة.

الشكل 1: permeabilization الانتقائي للغشاء البلازما (أ) نموذج الكرتون للمقايسة FPP تظهر خلية واحدة تمر من خلال بروتوكول تجريبي. يمثل رمز أحمر فلوري بروتين أحمر (RFP) في العصارة الخلوية، رموز الأخضر والأزرق تمثل البروتينات عبر الغشاء مع العلامة الفلورسنت إما تواجه التجويف عضية (الأزرق) أو العصارة الخلوية (الخضراء). (ب) وبعد permeabilization ديجيتونين، عصاري خلوي مجاناالبروتينات منتشر بعيدا، والحد من إشارة RFP. (ج) وبعد تطبيق بروتين K، وتتحلل إشارة خضراء عصاري خلوي، في حين أن إشارة الزرقاء محمي من التدهور من خلال وجودها في لمعة عضية.

الشكل 2: العلاج ديجيتونين permeabilizes غشاء البلازما والنشرات GFP عصاري خلوي (أ) كارتون من خلية واحدة معربا عن GFP القابلة للذوبان، قبل وبعد العلاج ديجيتونين. (ب) permeabilizes العلاج ديجيتونين غشاء البلازما والنشرات GFP عصاري خلوي. يتم رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول الخلايا CHO معربا عن ذوبان GFP. بعد العلاج مع ديجيتونين (50 ميكرون)، واتخذت صورة قبل وبعد إضافة ديجيتونين، وعند نقاط الزمنية المشار إليها. شريط المقياس، 10 ميكرون. (ج) القياس الكمي لfluoreويرد شدة مسرح الحادث من كامل السلاسل الزمنية (AF).

الشكل 3: FPP يكشف عن طوبولوجيا من البروتين LMTK2 endosomal (أ) من الكرتون FPP تظهر فقدان DsRed (الكرات الحمراء) ولكن الاحتفاظ LMTK2-GFP (الكرات الخضراء) بعد permeabilization ديجيتونين، يليه فقدان إشارة على تطبيق بروتين K. (ب) FPP فحص خلايا CHO معربا عن DsRed وLMTK2-GFP. واتخذت صورة قبل وبعد ديجيتونين العلاج، وبعد بروتين K، كما هو مبين. شريط مقياس: 10 ميكرون.

الشكل (4): (أ) نموذج الكرتون تبين طوبولوجيا وموقع YFP-بي ار بي (الأخضر) قبل وبعد بروتين K العلاج. خلايا CHO التعبيرتعرض YFP-بي ار بي إلى بروتين K ل 100 ثانية. (ب) الصور الملتقطة قبل وبعد العلاج البروتيني تظهر في الأوقات المشار إليها. فقدت إشارة YFP-بي ار بي تماما التالية البروتيني في غياب ديجيتونين. المنطقة الصفراء البرامج ذات الاهتمام (ROI) تستخدم لتحديد الكميات المبينة في (ج).

Discussion

التوجه الصحيح وطوبولوجيا من بروتينات الغشاء أمر ضروري لوظيفتها المناسبة. وعلى الرغم من أهمية فهم بروتين الغشاء طوبولوجيا، هناك العديد من البروتينات التي مثل هذه البيانات غير موجودة تماما. يوفر FPP طريقة سهلة وفعالة لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا، واحد التي يمكن القيام بها من قبل معظم المختبرات. النهج FPP يتيح مزايا هامة على الطرق السابقة لتحديد بروتين طوبولوجيا. على سبيل المثال، ليست هناك حاجة إلى وجود فريق من الأجسام المضادة الموجهة متعددة المجالات مرة أخرى مختلفة من البروتين من الفائدة ^31. في كثير من الحالات مثل لجنة من الأجسام المضادة ليست المتاحة؛ هذا ينطبق بشكل خاص على البروتينات المستنسخة حديثا. كما الفحص لا يمكن أن يؤديها على مستوى خلية واحدة، كميات كبيرة من البروتين البيوكيميائية ليست مطلوبة لالبيوكيميائية المصب يحلل مثل التحلل البروتيني أو SDS-PAGE. في الواقع، هناك حاجة إلى عدد قليل نسبيا من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لتعيين بشكل لا لبس فيهطوبولوجيا للبروتين من الفائدة. وهذا أمر مهم إذا المحقق هو تقييم طوبولوجيا في الخلايا الصعب بالنقل مثل الخلايا الظهارية أو الخلايا العصبية. إضافة بسيطة من شاردة GFP إما إلى الكربوكسيل أو الأمينية محطة من البروتين يمكن أن يتحقق بسهولة باستخدام العديد من GFP متوفرة تجاريا تحتوي على البلازميدات، وفي معظم الحالات، إضافة شاردة GFP لا تعيق قابلة للطي البروتين المناسب أو توطين التحت خلوية. ومع ذلك، يجب على الباحث يؤكد أن هذا صحيح بالنسبة البروتين، كما هناك احتمال لGFP تؤثر على البروتين من الفائدة ^23،24. العديد من البروتينات متاحة بالفعل كما البروتينات GFP الانصهار، مما يتطلب الحد الأدنى من الجهد الإضافي لبدء الدراسات الطوبوغرافية. وعلى الرغم من الرصد المستمر لمضان يوفر وسيلة سريعة وفعالة لتحديد بروتين طوبولوجيا، للمحققين الذين لا يحصلون على العيش خلايا معدات التصوير، ويتم تكييف الفحص بسهولة إلى التطبيق الفورمالديهايد التثبيتصرصور باستخدام epifluorescence معيار من المجهري متحد البؤر.

غير أن هناك بعض القيود في تطبيق الفحص FPP. يجب أن بروتين معالجة، أو غيرها من التعديلات بعد متعدية يؤدي في طبولوجيا غشاء مختلفة قليلا عن بروتين من الفائدة، فإن فحص FPP تقييم فقط شكل البروتين السائد. وبالإضافة إلى ذلك، بإلحاق شاردة GFP إلى مصطلحات من بعض البروتينات يمكن أن تؤثر على وظيفتها، على سبيل المثال التدخل في المجالات PDZ محطة الكربوكسيل. ومع ذلك، فإن فحص FPP يتيح مقاربة بسيطة لإنشاء التوجيه وطوبولوجيا من العديد من البروتينات الغشاء.

ومن الأهمية بمكان أن التجارب الأولية أن يؤديها لتحديد تركيز الصحيح من ديجيتونين للافراج عن GFP القابلة للذوبان داخل الخلايا. إذا لم GFP منتشر خارج الخلية التالية تطبيق ديجيتونين، ينبغي زيادة تركيز ديجيتونين تدريجيا، لتحديد الحد الأدنى من تركيز إعادةفلكل لتسهيل الافراج عنهم. ومع ذلك، فإن الكثير من ديجيتونين تؤثر على مورفولوجية حويصلات داخل الخلايا، التي ينبغي التأكيد على ما يلي تطبيق ديجيتونين النزاهة. العضيات في بعض خلايا حساسة للغاية ويمكن أن تتطلب تكوين عازلة أكثر استقرار ^25. إذا كانت إشارة مضان من الوهم يجري تقييمها منخفضة، واختيار استنساخ واحد مع مستوى التعبير العالي، أو أداء تعبير عابرة، وغالبا ما تزيد من قوة إشارة إلى مستوى مقبول. السعي إلى أحدث وينبغي النظر أيضا في البلازميدات أكثر إشراقا مع انخفاض كثافة إشارة. وأخيرا، ينبغي توخي الحذر لضمان أن فقدان إشارة ينظر ومن المقرر أن تدهور البروتيني وعدم photobleaching من fluorophores من. والحد من شدة الضوء و / أو معدل الاستحواذ تساعد على تقليل photobleaching من.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704