Определение мембранного белка топологии с помощью флуоресцентной протеазы Защита (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

Плазматических мембранах, а также многочисленные внутриклеточные мембраны, служат в качестве барьеров, разделяющих две водные отсеков. В случае плазменной мембраны, разделение между снаружи и внутри клетки; для внутриклеточных органелл это между цитоплазмой и органелл просвет. Например, эндоплазматический ретикулум (ЭР) мембрана отделяет окислительной среде в просвете ЭР от цитозольной восстановительной среде ^1. Мембранные белки синтезируются на ER-ассоциированной рибосом, и добиться их окончательного топологию в рамках ER мембраны ^2. Приобретение соответствующей ориентации мембраны и топологии для белков является критическим для их нормальной функции. Правильное топологии позволяет соответствующие домены мембранных белков взаимодействовать с их партнерами по связыванию, что позволяет критические пост-трансляционной модификации происходит, и в случае мембранных белков плазмы, позволяет клетке взаимодействовать с и реагировать то его окружении. Чтобы полностью оценить функцию мембранного белка, оно, очевидно, необходимо знать, как белок, который ориентирован относительно мембраны в котором она находится, то есть, ее мембраны топологии. В дополнение к приобретению фундаментальных научных знаний, понимания топологии мембранного белка и какие аспекты поверхности белка подвергаются различных средах имеет выраженных клинических последствия, поскольку мембранные белки составляют большинство фармакологических мишеней ^3. До недавнего времени подходы к определению топологии белка мембраны потребовали значительных затрат времени и денег или требуется реагенты, которые трудно найти.

Экспериментальных и в кремнии подходы были использованы, чтобы определить мембранный топологию белков, находящихся в плазматической мембране. С первых предсказаний мембраной доменов на основе оцененного гидрофобности INDIVIдвойные аминокислоты ^3, многочисленные прогностические алгоритмы теперь доступны в Интернете, и просто требуют знания последовательности что белок аминокислот. Тем не менее, предположения часто центральное место в программах моделирования, предположения, которые могут привести к неверным уступкам топологии ^4,5. Кроме того, в то время как эти компьютерные предсказания может предварительно задать мембраной областей, они не всегда определить, являются ли амино или карбокси-концы белков в цитоплазме, органелл или клеток просвет внешний вид. Даже с увеличением вычислительной мощности, и использование алгоритмов машинного обучения ^6, таких данных еще модели и должны быть проверены с помощью экспериментально полученных данных. Прямое экспериментальное определение мембраны топологии была предпринята с помощью панели моноклональных антител с известными эпитопов, распределенных по всему белка, где оценка их иммунореактивности было сделано до и после повышения проницаемости клеточной мембраны. Этоподход требует набор антител, которые не могут быть доступны для интересующего белка.

Альтернативной стратегией является инженер эпитопов метки, такие как Myc или гемагглютинина (HA) в различных местах по всему белка, снова с последующим определением иммунореактивности до и после мембраны проницаемости. В дополнение к иммуногенных тегов, ферментные метки (в том числе щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, или β лактамазы) и химических модификаций, таких как сканирование цистеина все были использованы для определения топологии мембранного белка ^7,8. Дополнительный способ применяется для топологического отображения плазменных мембранных белков зависит от несколько иной подход к эпитопными тегов. В этом способе последовательность тег N-связанной последовательности гликозилирования консенсус NXS / T. Поскольку гликозилирование происходит только тогда, когда такая последовательность присутствует в просвете пути биосинтеза, в присутствии метки в сравнении просветацитозольного отсек легко наблюдать, как массового сдвига на ПААГ с ДСН. Такой подход был применен к multispanning ионного канала CFTR ^9. В то время как все эти подходы были использованы, становится ясно, что все они требуют значительных инвестиций в области молекулярной биологии, чтобы генерировать и последовательность коллектора конструкции.

Для определения топологической информации о трансмембранных белков, расположенных в пределах внутриклеточных органелл оказалась более сложной. Применение технологий, основанных флуоресценции однако, сделали вывод о том мембранной топологии намного проще. Методика бимолекулярного флуоресценции комплементации (BiFC) опирается на взаимодействие двух нефлуоресцирующих фрагментов флуоресцентного белка, восстановление флуоресцентные свойства этого белка ^10. Хотя первоначально описано для определения белок-белковых взаимодействий в естественных условиях ^10, этот подход был также использованчтобы определить топологию белка мембраны в клетках растений ^11. Однако этот подход также занимают много времени, так как требует поколение не только слитых белков с интересующим белком, но и различных слитых белков, направленных на цитозоле или органелл просвет, и требует знания которых внутриклеточных мембран интерес белка находится в ,

Альтернативный простой подход к определению топологию белка мембраны было описано ^12. Анализ, флуоресценции протеазы защиты (FPP) требуется генерирование слитого белка между GFP и гена. Этот подход основан на относительной доступности неспецифических протеаз в GFP части; в зависимости от того, GFP защищен от протеолиза, проживающих в просвет внутриклеточных органелл или подвергается протеолиза присутствует в цитозоле. Таким образом, если GFP фрагмент на интерес белка сталкивается в цитоплазму, она будет подвергаться воздействиюпротеазной активности, и сигнал флуоресценции потеряны. С другой стороны, если фрагмент GFP от интересующего белка сталкивается среды "защищены" от протеазы (например, Гольджи просвет), то сигнал флуоресценции будет сохраняться.

Чтобы протеазы войти в клетку, но не входят внутриклеточные мембранные отделения холестерина связывания препарат дигитонин используется. Холестерин является доминирующим стерин у позвоночных, и в частности, обогащенный плазматической мембраны относительно внутриклеточных компартментах. Гликозид токсин, дигитонин, добывается из растения наперстянки пурпурной. Дигитонинового имеет сродство к холестерина богатых мембран, к чему это приведет мембрану permeabiliztion ^14,16 (рис 1). В дополнение к возможности выхода мелких цитозольных компонентов, дигитонин пермеабилизации также позволяет запись экзогенных молекул, таких как протеиназы К или трипсином. Протокол FPP использует КВСт, что плазменная мембрана содержит до 80% клеточного холестерина ^17, в то время как другие органеллы, такие как ER, Гольджи, эндосомы, митохондрии, имеющие очень низкое содержание холестерина, остаются нетронутыми ^14. Селективное введение холестерина в плазматической мембране было отмечено во многих эукариотических клетках, позволяя использовать дигитониновым-зависимой проницаемости плазматической мембраны в таких разнообразных видов эукариот, как S. Cerevisiae человеческой ^14,18. FPP анализ обеспечивает простое, быстрое и довольно эффективные средства определения () является ли белок мембраной / Associated или свободно диффундируют в цитоплазме и (б) какой домен белка мембраны сталкивается с цитозоле или органелл просвет. Если белок мембраны имеют несколько ориентаций, сигнал будет возникать из доминантной формы и незначительные формы не будут обнаружены. В то время как может быть опасение, что добавление GFP фрагмента к белку на интерес, могут влиять на его функцию и/ Или субклеточном локализации, это на самом деле больше теоретический, чем фактическая. Действительно, многие исследования ясно показали, что GFP тегов не изменяет свойства белка ^19,20.

Protocol

1. Генерация и проверка флуоресцентный белок химерами Добавление зеленый флуоресцентный белок (GFP) в амино- или карбоксильной концах интересующего белка с использованием стандартных рекомбинантных ДНК стратегии 13. ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы использовали GFP широко, другие вари?…

Representative Results

Плазматической мембраны пермеабилизирующего Эффективное плазматической мембраны пермеабилизации определяется с использованием растворимых флуоресцирующих белков (например, GFP, DsRed) (этап 4). Эти белки, когда экспрессируется в клетках, могут свободно диффунди…

Discussion

Правильной ориентации и топологии мембранных белков имеет важное значение для их нормальной работы. Несмотря на важность понимания топологии белка мембраны, есть много белков, для которых эти данные полностью отсутствуют. ФПП обеспечивает простой и эффективный способ определения то?…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704