Introduction
Плазматических мембранах, а также многочисленные внутриклеточные мембраны, служат в качестве барьеров, разделяющих две водные отсеков. В случае плазменной мембраны, разделение между снаружи и внутри клетки; для внутриклеточных органелл это между цитоплазмой и органелл просвет. Например, эндоплазматический ретикулум (ЭР) мембрана отделяет окислительной среде в просвете ЭР от цитозольной восстановительной среде 1. Мембранные белки синтезируются на ER-ассоциированной рибосом, и добиться их окончательного топологию в рамках ER мембраны 2. Приобретение соответствующей ориентации мембраны и топологии для белков является критическим для их нормальной функции. Правильное топологии позволяет соответствующие домены мембранных белков взаимодействовать с их партнерами по связыванию, что позволяет критические пост-трансляционной модификации происходит, и в случае мембранных белков плазмы, позволяет клетке взаимодействовать с и реагировать то его окружении. Чтобы полностью оценить функцию мембранного белка, оно, очевидно, необходимо знать, как белок, который ориентирован относительно мембраны в котором она находится, то есть, ее мембраны топологии. В дополнение к приобретению фундаментальных научных знаний, понимания топологии мембранного белка и какие аспекты поверхности белка подвергаются различных средах имеет выраженных клинических последствия, поскольку мембранные белки составляют большинство фармакологических мишеней 3. До недавнего времени подходы к определению топологии белка мембраны потребовали значительных затрат времени и денег или требуется реагенты, которые трудно найти.
Экспериментальных и в кремнии подходы были использованы, чтобы определить мембранный топологию белков, находящихся в плазматической мембране. С первых предсказаний мембраной доменов на основе оцененного гидрофобности INDIVIдвойные аминокислоты 3, многочисленные прогностические алгоритмы теперь доступны в Интернете, и просто требуют знания последовательности что белок аминокислот. Тем не менее, предположения часто центральное место в программах моделирования, предположения, которые могут привести к неверным уступкам топологии 4,5. Кроме того, в то время как эти компьютерные предсказания может предварительно задать мембраной областей, они не всегда определить, являются ли амино или карбокси-концы белков в цитоплазме, органелл или клеток просвет внешний вид. Даже с увеличением вычислительной мощности, и использование алгоритмов машинного обучения 6, таких данных еще модели и должны быть проверены с помощью экспериментально полученных данных. Прямое экспериментальное определение мембраны топологии была предпринята с помощью панели моноклональных антител с известными эпитопов, распределенных по всему белка, где оценка их иммунореактивности было сделано до и после повышения проницаемости клеточной мембраны. Этоподход требует набор антител, которые не могут быть доступны для интересующего белка.
Альтернативной стратегией является инженер эпитопов метки, такие как Myc или гемагглютинина (HA) в различных местах по всему белка, снова с последующим определением иммунореактивности до и после мембраны проницаемости. В дополнение к иммуногенных тегов, ферментные метки (в том числе щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, или β лактамазы) и химических модификаций, таких как сканирование цистеина все были использованы для определения топологии мембранного белка 7,8. Дополнительный способ применяется для топологического отображения плазменных мембранных белков зависит от несколько иной подход к эпитопными тегов. В этом способе последовательность тег N-связанной последовательности гликозилирования консенсус NXS / T. Поскольку гликозилирование происходит только тогда, когда такая последовательность присутствует в просвете пути биосинтеза, в присутствии метки в сравнении просветацитозольного отсек легко наблюдать, как массового сдвига на ПААГ с ДСН. Такой подход был применен к multispanning ионного канала CFTR 9. В то время как все эти подходы были использованы, становится ясно, что все они требуют значительных инвестиций в области молекулярной биологии, чтобы генерировать и последовательность коллектора конструкции.
Для определения топологической информации о трансмембранных белков, расположенных в пределах внутриклеточных органелл оказалась более сложной. Применение технологий, основанных флуоресценции однако, сделали вывод о том мембранной топологии намного проще. Методика бимолекулярного флуоресценции комплементации (BiFC) опирается на взаимодействие двух нефлуоресцирующих фрагментов флуоресцентного белка, восстановление флуоресцентные свойства этого белка 10. Хотя первоначально описано для определения белок-белковых взаимодействий в естественных условиях 10, этот подход был также использованчтобы определить топологию белка мембраны в клетках растений 11. Однако этот подход также занимают много времени, так как требует поколение не только слитых белков с интересующим белком, но и различных слитых белков, направленных на цитозоле или органелл просвет, и требует знания которых внутриклеточных мембран интерес белка находится в ,
Альтернативный простой подход к определению топологию белка мембраны было описано 12. Анализ, флуоресценции протеазы защиты (FPP) требуется генерирование слитого белка между GFP и гена. Этот подход основан на относительной доступности неспецифических протеаз в GFP части; в зависимости от того, GFP защищен от протеолиза, проживающих в просвет внутриклеточных органелл или подвергается протеолиза присутствует в цитозоле. Таким образом, если GFP фрагмент на интерес белка сталкивается в цитоплазму, она будет подвергаться воздействиюпротеазной активности, и сигнал флуоресценции потеряны. С другой стороны, если фрагмент GFP от интересующего белка сталкивается среды "защищены" от протеазы (например, Гольджи просвет), то сигнал флуоресценции будет сохраняться.
Чтобы протеазы войти в клетку, но не входят внутриклеточные мембранные отделения холестерина связывания препарат дигитонин используется. Холестерин является доминирующим стерин у позвоночных, и в частности, обогащенный плазматической мембраны относительно внутриклеточных компартментах. Гликозид токсин, дигитонин, добывается из растения наперстянки пурпурной. Дигитонинового имеет сродство к холестерина богатых мембран, к чему это приведет мембрану permeabiliztion 14,16 (рис 1). В дополнение к возможности выхода мелких цитозольных компонентов, дигитонин пермеабилизации также позволяет запись экзогенных молекул, таких как протеиназы К или трипсином. Протокол FPP использует КВСт, что плазменная мембрана содержит до 80% клеточного холестерина 17, в то время как другие органеллы, такие как ER, Гольджи, эндосомы, митохондрии, имеющие очень низкое содержание холестерина, остаются нетронутыми 14. Селективное введение холестерина в плазматической мембране было отмечено во многих эукариотических клетках, позволяя использовать дигитониновым-зависимой проницаемости плазматической мембраны в таких разнообразных видов эукариот, как S. Cerevisiae человеческой 14,18. FPP анализ обеспечивает простое, быстрое и довольно эффективные средства определения () является ли белок мембраной / Associated или свободно диффундируют в цитоплазме и (б) какой домен белка мембраны сталкивается с цитозоле или органелл просвет. Если белок мембраны имеют несколько ориентаций, сигнал будет возникать из доминантной формы и незначительные формы не будут обнаружены. В то время как может быть опасение, что добавление GFP фрагмента к белку на интерес, могут влиять на его функцию и/ Или субклеточном локализации, это на самом деле больше теоретический, чем фактическая. Действительно, многие исследования ясно показали, что GFP тегов не изменяет свойства белка 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация и проверка флуоресцентный белок химерами
- Добавление зеленый флуоресцентный белок (GFP) в амино- или карбоксильной концах интересующего белка с использованием стандартных рекомбинантных ДНК стратегии 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы использовали GFP широко, другие варианты, такие как голубой флуоресцентный белок (СФП), желтый флуоресцентный белок (YFP), DsRed и mCherry могут быть использованы. Улучшения в флюорофора складывающиеся эффективности, яркости и фотостабильностью постоянно вносятся, и следователи должны воспользоваться новейшими конструкциями поколения.- Подтверждение правильности последовательности ДНК и гарантировать, что GFP фрагмент в рамке с белком, представляющего интерес. Выполните последовательность с использованием стандартных рекомбинантных стратегии ДНК 21.
Примечание: Многие организации имеют основные средства ДНК, которые следователь рекомендуется обращаться за дополнительной информацией. - Для одинарных или двойных белков проход мембранных, генерироватьоба амино- и карбоксильные концевые варианты слитых белков 19.
- Для мульти-охватывающей белков вставить GFP в пределах предполагаемых петель extramembrane, а также Термини. Обратите особое внимание при генерации трансмембранных химеры с флуоресцентным слитого белка, прикрепленного к амино-концу белка-мишени, как сигнальные последовательности часто расщеплен путем протеолиза когда белок прошел через ER транслокона.
- В случае существующих сигнальных последовательностей, вставки флуоресцентного слитого белка дистальнее сайта расщепления с тем, чтобы генерировать зрелый белок, содержащий интактный аминоконцевой тегами флуоресцентный белок. Используют стандартные стратегии рекомбинантных ДНК для генерации химер 21.
- Подтверждение правильности последовательности ДНК и гарантировать, что GFP фрагмент в рамке с белком, представляющего интерес. Выполните последовательность с использованием стандартных рекомбинантных стратегии ДНК 21.
- Определить наличие достаточного соответствующим локализованного флуоресцентного сигнала в клеточной линии, представляющей интерес.
- Соблюдайте клеток под эпифлуоресцентной микроскопии с использованием собственного флуоресценции GFP под appropriели фильтра установить условия. Для GFP наборы фильтров, которые охватывают 510-560 нм, подтверждают, что правильные фильтры используются для флуорофора, используемого.
ПРИМЕЧАНИЕ: достаточно сигнала достигается тогда, когда оценка на глаз обеспечивает достаточно сильный сигнал, что клеточная структура, в рамках которой сигнал находится легко решается выше фона. Кроме того окрашивание картина GFP-белка должны быть совместимы с тем из маркеров для соответствующего органеллы, и предпочтительно идентична нативной немеченого белка.
- Соблюдайте клеток под эпифлуоресцентной микроскопии с использованием собственного флуоресценции GFP под appropriели фильтра установить условия. Для GFP наборы фильтров, которые охватывают 510-560 нм, подтверждают, что правильные фильтры используются для флуорофора, используемого.
- Определить, будет ли использована стабильную или транзиторную трансфекцию подход основан на белок оценивается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильный трансфектанты как правило, позволить себе более низкие уровни экспрессии, чем переходных систем. Хотя переходный выражение дает высокий уровень экспрессии белков и интенсивности увеличение сигнала (~ 5-24 часов после трансфекции в зависимости от белка), что также может привести к избыточной экспрессии артефактов, таких как белок Aggregation или насыщение белка ориентации путей, что приводит к ошибочному субклеточном локализации.
2. трансфекции клеток и клеточных культур
Примечание: выбор клеток поддаются анализу FPP, в том числе HEK293, HeLa, COS-7 и СНО клеток 14. Нижеследующее описание основано на экспрессии мембранных белков в клетках НЕК293.
- Выращивать человеческие эмбриональные клетки почки (HEK293) как адгезивных монослоев в 6 мл Дульбекко модифицированной Игла среде (DMEM), дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пирувата натрия и 250 мкг / мл пенициллина / стрептомицина при 37 ° С с 5% СО 2. Провести все работы, с клетками в ламинарного потока капот культуры ткани. растут клетки в культуральной среде до ~ 80% сливной в Т-75 колбу.
- Трансфекции клеток с помощью любого стандартного высокой эффективностью, низким метод трансфекции токсичность, включая липидо-, viral- или электропорации на основе технологий для генерации transienт или стабильная экспрессия. Обычно 2 мкг плазмидной ДНК в 1 × 10 6 клеток дает хорошую экспрессию белка воспроизводимое. Поддержание клеток для 5-48 ч в соответствующем среды культуры ткани при 37 ° С в СО 2, способный инкубаторе тканевых культур.
- Монитор клеток для экспрессии GFP-белка, слитого с использованием эпифлуоресцентной микроскопии с использованием собственной флуоресценции сигнал GFP, с использованием соответствующих наборов фильтров в соответствии с протоколом производителя. Сигнал флуоресценции обычно достигает максимума в течение 24-72 ч после трансфекции. Использование клеток, когда сигнал флуоресценции достигает максимального уровня. Монитор уровни экспрессии белка иммуноблот-анализа с использованием антитела, направленные против либо белка, представляющего интерес, или GFP фрагмента.
- Для анализа экспериментальных пластин клеток на покровных покрытием. Смотреть либо в конфигурации живых клеток или после фиксации и крепления на микроскопии слайдов. Пластина клеток для достижения 60% -80% слияния в течение 24-48 ч,
- Coat покровные с поли-лизина раствор (0,1 мг / мл), так, чтобы вся поверхность покрыта. Инкубировать в течение 30 мин под ультрафиолетовым светом при комнатной температуре, после чего 60 минут в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С. Удалите излишки поли-лизин и промойте покровные в PBS 3 раза.
- Кроме того, плиты ячейки на патрон крышки стекла, состоящей из клеточной культуры пластин с оптическим стеклянным дном, чтобы позволить прямой визуализации с целями масло-погружения в воду. Фактическое установки микроскопии зависит от доступного оборудования для исследователя, но должна быть способна быстрых изменений в растворе. В зависимости от типа клеток и клеток формы, клетки должна быть около 60-90% сливной во время анализа FPP.
3. флуоресцентной микроскопии Setup
- Использование высокой числовой апертуры (NA) масла-иммерсионный объектив для максимального сбора сигнала и пространственным разрешением, например, 60X, 1,42 NA масла иммерсионный объектив. Используйте йе после лазеров для стимулирования флуорофоры: газ аргон 488 нм (GFP и YFP) и 561 диод (ППП, mCherry).
- Определить оптимальную скорость экспозиции, усиления и захвата изображений для каждой конструкции. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции, чтобы минимизировать фотообесцвечивания (см шаг 7.1.2).
- Для исследований с использованием нескольких флуорофоры (например, водорастворимого маркера для мембранной проницаемости в концерте с маркерный белок мембраны), выберите соответствующий фильтр устанавливает свести к минимуму сигнала перекрестные помехи и максимально сигнал-шум.
4. Создание оптимальных условий для плазменной мембране пермеабилизирующего
- Извлеките клеточной культуральной среды от клеток, экспрессирующих только растворимые флуоресцентные белки (например, EGFP, DsRed). Вымойте клетки 3 раза (1 мин каждый) в KHM буфера (110 мМ ацетата калия, 3 мМ MgCl 2, 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7,2). Выполнение экспериментов с клетками и все реагенты при комнатной температуре.
- Место клетки выводап покровные (см шаг 2,4) в KHM буфера на этапе флуоресцентный микроскоп и собирать первый образ, который представляет контроль »непермеабилизированных» стадии.
- Для селективно проницаемыми плазматическую мембрану, добавить дигитонина (30 мкМ) в буфере KHM к клеткам. Заливать клетки с буфером (буфер + дигитонином) со скоростью 5 мл / мин в течение 10-60 сек.
- Определение оптимальной концентрации дигитониновых постепенным увеличением концентрации дигитонином. Оптимальная дигитонин концентрация достигается, когда есть полная потеря сигнала флуоресценции от растворимого EGFP в течение 10-60 сек дигитонинового применения. В течение многих клетках применение 10-50 мкМ дигитонином достаточно проницаемыми клеточные мембраны.
- Для всех приложений использовать самую низкую возможную концентрацию дигитонина. Собирать изображения, после дигитонинового пермеабилизации для проницаемыми фонового сигнала.
- Убедитесь, что GFP-белок химеры интерес мембранаtegrated, подтвердив сотовой сохранение сигнала флуоресценции после дигитонинового проницаемости мембраны плазмы 16.
- Экспресс органеллы конкретных флуоресцентный белок 23. Митохондриальных белков хорошо работать в этой связи 16, например, pDsRed2-Mito вектора. Определить оптимальные условия экспрессии, как описано в шаге 2.1.
- Убедитесь, что дигитонин концентрация подходит для этого типа клеток, занятых счет того, что морфология внутриклеточных органелл остается постоянной в течение длительного (до 60 мин) воздействия дигитонинового.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте протоколы стандарт иммунофлюоресценции микроскопии с использованием антител против различных клеточных отсеках, такие как лизосомы (например, LAMP1), Гольджи (например, TGN38), эндоплазматическая сеть (например, калнексину), эндосомы (например, Rab5), митохондрии (например, цитохром в). Если изменения морфологии / целостности внутриклеточный органелл резко ОвеR 60 мин, вполне вероятно, что дигитонин концентрация была слишком высокой, и требуется снижение дигитониновым концентрации и / или времени экспозиции.
ПРИМЕЧАНИЕ: дигитонинового является токсичным при вдыхании и попадании на кожу. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
5. протеазы Лечение флуоресцентных белков
- Промыть клетки в KHM буфера, а затем добавить протеазу (протеиназы К; 50 мкг / мл в буфере KHM) непосредственно на клетки. Заливать клеток при скорости потока 5 мл / мин с использованием самотеком систему перфузии непрерывно бане подготовку.
- Хранить растворы в 50 мл шприцев и полиэтиленовых труб связано независимых резервуаров к коллектору с одной выходом на ванну (скорость 5 мл / мин поток). Установите всасывающий пипетки для поддержания постоянной (0,5 мл) объема ванны и добиться обмена решение вручную переключаться между перфузии водоемов.
- Собирать изображения, чтобы определить, является ли фтораescent сигнал сохраняется или ухудшается. Потеря> 90% от начальной интенсивности сигнала в течение 30-60 сек соответствует протеолитической деградации в GFP-белка химеры (см Репрезентативные результаты).
- Если никакой деградации сигнала не наблюдается с протеиназы К, когда такие потери Ожидается, замените протеиназы К решение с трипсином (4-8 мм), KHM буфера. При необходимости использовать смеси протеиназы К и трипсин. Там нет необходимости, чтобы утолить активность протеаз.
6. Альтернативный подход для белков плазматической мембраны с внешних доменов
- Для плазменных мембранных белков, проведение анализов для внешних белков люминесцентные химер предшествующих дигитонинового пермеабилизации. Промыть клеток на покровных стеклах в KHM буфера (5 мл / мин х 3 мин), и принимают изображение для предварительного протеазы лечения и количественно предварительно протеазы сигнала флуоресценции, как на стадии 7.
- Защиту клетки протеазы (протеиназы К; 50 мкг / мл трипсина или 4-8 мм в буфере KHM) в тОн отсутствие дигитонином путем перфузии клетки с KHM средах, содержащих протеазы (скорости потока 5 мл / мин). Собирают изображения флуоресцентного белка, чтобы определить, как быстро сигнал исчезает или как долго сигнал сохраняется.
- Перед дигитониновым проницаемости, погасить все протеазной активностью, путем промывки клеток в три раза (1 мин каждый) в среде для культивирования клеток, содержащей 10% сыворотки (FBS).
- Промыть клеток путем перфузии с KHM буфера (скорость потока 5 мл / мин) в течение 2 мин. Приобретать предварительно пермеабилизирующего изображение. Проницаемыми клеточные мембраны, как описано в пункте 4.
- Собирать изображения, следующие протеазы того, как описано в шаге 5.
Анализ 7. Изображение
- Используйте инвертированный микроскоп, способный "живая клетка" записи, в которых потеря сигнала флуоресценции можно наблюдать в режиме реального времени. Для непрерывного мониторинга, использовать одинаковые параметры (время экспозиции, усиление, интенсивности лазерного излучения и т.д.).
- Определить Experментальные параметры, наблюдая сигнал флуоресценции от GFP-белка процентов в условиях контроля (например, СТК буфер в одиночку). Отрегулируйте усиление, интенсивности и экспозиции лазерного настройки на компьютере приводом микроскопа время, чтобы убедиться, что нет никакой заметной потери интенсивности сигнала в течение 10-20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: интенсивность сигнала не абсолютное значение, но на основе системы микроскопа и настройки, доступные каждому PI. Мониторинг изменений в относительной интенсивности флуоресценции.
- Определить Experментальные параметры, наблюдая сигнал флуоресценции от GFP-белка процентов в условиях контроля (например, СТК буфер в одиночку). Отрегулируйте усиление, интенсивности и экспозиции лазерного настройки на компьютере приводом микроскопа время, чтобы убедиться, что нет никакой заметной потери интенсивности сигнала в течение 10-20 мин.
- Кроме того, лечить клетки при заданных временных точках в дигитонина последующим протеазы, и исправить клеток перед монтажом на покровных для визуализации. Определите моменты времени эмпирически следующие процедуры шагов 4 и 5. Для первоначального расследования, начинаются с 0, 30, 60, 120 и 300 сек после того дигитонинового или протеазы.
- Закрепить клетки (20 мин при комнатной температуре) с использованием достаточного количества фиксатора (3,7% параформальдегида в PBS), чтобы полностью погрузить тысе клетки.
- Гасят остаточного параформальдегида путем промывки клеток ФБР, содержащим 20 мМ глицина (3 х 5 мин).
- Mount покровные путем удаления избытка жидкости из покровного и обращая покровное на 50 мкл монтажных СМИ на предметные стекла микроскопа для работы с изображениями. Разрешить слайды высохнуть в течение ночи перед визуализации.
- Сбор флуоресцентной микроскопии изображений (при соответствующих фильтров, совместимых с флюорофор используется), используя функцию захвата видео изображение на компьютере под контролем флуоресцентного микроскопа.
- Количественная флуоресцентные интенсивности сигнала как функции условия инкубации. Получить средняя интенсивность пикселя в пределах области интереса (ROI), который охватывает отдельную ячейку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Плазматической мембраны пермеабилизирующего
Эффективное плазматической мембраны пермеабилизации определяется с использованием растворимых флуоресцирующих белков (например, GFP, DsRed) (этап 4). Эти белки, когда экспрессируется в клетках, могут свободно диффундируют в цитоплазме, и теряются, когда плазма мембраны проницаемыми с помощью дигитонин (рисунок 2). Полное исчезновение флуоресцентного сигнала должно происходить в течение 10-60 сек дигитонинового применения. Подтверждение того, что представляющий интерес белок связывается с внутриклеточных органелл достигается отметить сохранение флуоресцентного сигнала следующую дигитониновым проницаемости.
Протеазы Лечение
После успешной генерации флуоресцентных химер между интересующего белка и флуоресцентного белка (GFP, YFP, и т.д.) (Этап 1) и экспрессии флуоресцентного белка в клетках (Шаг 2), лечение из проницаемыми клетки с протеазы будут предоставлять информацию о том флюорофор (и прилегающей к нему домен белка) в цитозоле и доступны для протеазы пищеварения, или находятся в органелл просвета и, таким образом, защищен от протеазы пищеварения (Шаг 4). LMTK2 является мембрана закреплена киназы 15, и анализы защиты протеазы флуоресценции были использованы для определения его мембранной топологии 16. Карбоксильной хвост LMTK2 был присоединен к GFP и выразил временно. Флуоресцентный сигнал LMTK2-GFP быстро потерял после добавления протеиназы К, что указывает на расположение С-конца LMTK2 расположены в цитозоле (рисунок 3). Кавеолин-GFP (CAV1-GFP), 17 плазматической мембраны белок с GFP-фрагмента, прикрепленного к цитозольного домена. Как LMTK2, сигнал от кавеолина-YFP в дигитониновых нечувствительным, но чувствительны к последующим добавлением протеазы (рисунок 3).
T "> просвета растворимые белки также могут быть идентифицированы с использованием протокола FPP. В этом примере, ER сигнала удержания KDEL прилагается к DsRed. В отличие от сигналов от LMTK2 и кавеолином, сигнал от KDEL-DsRed нечувствителен к обоим дигитонин и протеазы, как дигитонин не может проницаемыми ER мембрану и флуоресцентный сигнал защищен от деградации протеазы. пример мембранного домена, расположенного в просвете органеллы задается митохондриальной субъединицы белка VIII из человеческой цитохром с оксидазы 18,19. pDsRed-Mit, кодирует красный флуоресцентный белок из Discosoma Sp. слитый с митохондриальной последовательности из цитохром с оксидазы ориентации. В клетках, экспрессирующих pDsRed-Мито, флуоресцентный сигнал можно увидеть в ячейке. После дигитонинового пермеабилизации, флуоресцентный сигнал связано с pDSRed-Мито остается стабильным. Кроме того, после того протеиназы К, флуоресценции, связанного с pDsRed-Mito сохраняется, Консогласуется с флуорофора в митохондриях и не подвергаться в цитозоль и, таким образом, защищен от активности протеазы (рис 3).Внеклеточные домены
Протеазы лечение непермеабилизированных клетки должны быстро утолить сигнала флуоресценции, когда флуоресцентный фрагмент, присоединенный к белку мембраны обращен к наружной частью клетки. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) якорь белка PrP 20 служит в качестве отличного примера. Конструкция, содержащая желтый флуоресцентный белок (YFP), присоединенный к амино-концу PRP (YFP-PRP) 21,22, щедрый подарок от доктора Эхуда Коэн, из Еврейского университета в Иерусалиме. До лечения протеазы, флуоресцентный сигнал от внеклеточного YFP было светло (фиг.4). После обработки протеазы, внеклеточный сигнал флуоресценции быстро исчезли.
Время Соображения
Рисунок 1: Избирательное пермеабилизации плазматической мембраны (а) мультфильмов модель анализа FPP, показывающий одну ячейку, проходящий через экспериментального протокола.. Красный символ олицетворяет красный флуоресцентный белок (RFP) в цитозоле, зеленые и синие символы представляют трансмембранных белков с флуоресцентной меткой либо сталкиваются органелл просвет (синий) или цитозоль (зеленый). (Б) После дигитонинового проницаемости, бесплатно цитозольныйбелки диффундируют прочь, уменьшая сигнал RFP. (С) после применения протеиназы К, цитозольного зеленый сигнал деградирует, в то время как синий сигнал защищен от деградации его присутствия в просвете органелл.
Рисунок 2: Лечение дигитониновых permeabilizes плазматической мембране и освобождает цитозольного GFP (а) мультфильмов из одной клетки экспрессирующие растворимый GFP, до и после лечения дигитониновым.. (Б) лечения дигитонинового permeabilizes плазматической мембраной и релизы цитозольный GFP. Область интереса (ROI) обращается вокруг СНО клеток, экспрессирующих растворимый GFP. После обработки дигитонин (50 мкМ), изображения были взяты до и после добавления дигитонин, и в указанных временных точках. Масштабная линейка, 10 мкм. (C) количественная оценка fluoreScence интенсивности полного временного ряда (AF) показан.
Рисунок 3: FPP показывает топологию эндосомный LMTK2 белка () Мультфильм FPP, показывая потерю DsRed (красные шары), но сохранение LMTK2-GFP (зеленые шарики) после дигитонинового пермеабилизации, а затем потери сигнала на применении протеиназы К. . (б) ФПП анализа клеток СНО, экспрессирующих DsRed и LMTK2-GFP. Изображения были сделаны до и после лечения дигитониновых, и после протеиназы К, как указано. Масштабная линейка: 10 мкм.
Рисунок 4: (а) мультфильмов модель показывает топологию и расположение YFP-PrP (зеленый) до и после протеиназы К лечения. Клетки СНО, экспрессирующиеYFP-PrP подвергали протеиназы К в течение 100 сек. (Б) изображения до и после обработки протеазы приведены в указанных времен. Сигнал YFP-ОТП полностью утрачена следующие протеазы в отсутствие дигитонином. Желтый шоу область интереса (ROI) для количественного показано в (с).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Правильной ориентации и топологии мембранных белков имеет важное значение для их нормальной работы. Несмотря на важность понимания топологии белка мембраны, есть много белков, для которых эти данные полностью отсутствуют. ФПП обеспечивает простой и эффективный способ определения топологию белка мембраны, и тот, который может быть выполнен в большинстве лабораторий. Подход ФПП дает значительные преимущества по сравнению с предыдущими методами для определения топологию белка. Например, нет необходимости иметь панель из нескольких антител, направленных снова различные домены белка, представляющего интерес 31. Во многих случаях такие панель антител не имеется; это особенно верно для вновь клонированных белков. Как анализ может быть выполнен на одном уровне клетки, большие биохимические количества белка не требуются для вниз по течению биохимических анализов, таких как протеолиза или SDS-PAGE. В самом деле, относительно мало трансфицированные клетки необходимы, чтобы однозначно задатьТопология в интересующего белка. Это важно, если исследователь оценивает топологию в жестких для трансфекции клеток, таких как эпителиальные клетки или нейроны. Простой добавление GFP фрагмента либо в карбоксильную или амино-конца белка может быть легко достигнуто с помощью многочисленных коммерчески доступный GFP, содержащие плазмиды, и в большинстве случаев, добавление GFP фрагмента не мешает правильное сворачивание белка или внутриклеточную локализацию. Тем не менее, следователь должен подтвердить, что это верно для их белка, так как есть потенциал для GFP повлиять на интерес белок 23,24. Многие белки, уже доступен в GFP слитых белков, таким образом, требует минимальной дополнительной усилия, чтобы начать топологические исследования. Хотя постоянный мониторинг флуоресценции обеспечивает быстрые и эффективные средства определения топологии белка, для исследователей, которые не имеют доступа к жизненно-клеток, средства обработки изображений, анализа легко адаптируется к формальдегида фиксации приложенияплотва, используя стандартный эпифлуоресцентной конфокальной микроскопии.
Есть, однако, некоторые ограничения в применимости анализа FPP. Если протеолитического процессинга, или другие пост-трансляционные модификации привести к небольшому различных топологий мембрана для интересующего белка, анализ FPP только оценить доминирующей формой белка. Кроме того, если добавить GFP фрагмент в концах некоторых белков может повлиять на их функцию, например, помехи с PDZ доменов карбоксильной терминала. Тем не менее, анализ ФПП дает простой подход к созданию ориентацию и топологию многих мембранных белков.
Очень важно, чтобы первые эксперименты проводятся для определения правильной концентрации дигитонинового для высвобождения внутриклеточных растворимых GFP. Если GFP не диффундирует из клетки следующие дигитониновым применения, концентрация дигитонином следует постепенно увеличивать, чтобы определить минимальную концентрацию Reпотребовавшие, чтобы облегчить освобождение. Однако, слишком много дигитонин повлияет на морфологию внутриклеточных везикул, чьи целостности должны быть подтверждены следующие дигитониновым применения. Органеллы в некоторых клетках очень чувствительны и могут потребовать более стабилизирующую буфера состав 25. Если сигнал флуоресценции от химеры оценивается низкий, выборе одного клона с более высоким уровнем экспрессии, или выполняет временную экспрессию, часто увеличивает уровень сигнала до приемлемого уровня. Взыскание новые, яркие плазмиды также должны быть рассмотрены с низкой интенсивностью сигнала. И, наконец, следует соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что потеря сигнала видно из-за деградации протеазы и не фотообесцвечивание флуорофоров. Снижение интенсивности света и / или скорость сбора поможет уменьшить фотообесцвечивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
