Introduction
ממברנות הפלזמה, כמו גם את הקרומים תאיים הרבים, שמשו כחיץ המפריד בין שני תאים מימיים. במקרה של קרום הפלזמה, ההפרדה היא בין החוץ ופנים של התא; לאברונים תוך-תאיים הוא בין הציטופלסמה ולומן אברון. לדוגמא, קרום reticulum endoplasmic (ER) מפריד בין סביבת חמצון בתוך לומן של ER מcytosolic צמצום הסביבה 1. חלבוני קרום מסונתזים על ריבוזומים הקשורים ER, ולהשיג טופולוגיה הסופית שלהם בתוך הקרום ER 2. רכישת אוריינטצית קרום המתאימה וטופולוגיה לחלבונים היא חיונית לתפקוד הנורמלי שלהם. טופולוגיה הנכונה מאפשרת תחומים רלוונטיים של חלבונים בממברנה כדי אינטראקציה עם השותפים המחייבים שלהם, הוא מאפשר לאחר translational שינויים קריטיים להתרחש, ובמקרה של חלבוני קרום פלזמה, מאפשר לתא לקיים אינטראקציה עם ולהגיב to סביבתה. כדי להעריך את תפקודו של חלבון קרום באופן מלא, ברור שהכרחי לדעת איך חלבון שמכוון ביחס לקרום שבתוכה הוא שוכן, כלומר, טופולוגיה הממברנה שלו. בנוסף לרכישת ידע מדעי בסיסי, הבנת הטופולוגיה של חלבון קרום ואילו היבטים של משטח חלבון נחשפים לסביבות שונות סימנה השלכות קליניות מאז חלבוני קרום מהווים את רוב המטרות תרופתיות 3. עד לאחרונה, גישות לקביעת טופולוגיה חלבון קרום דורשת השקעה רבה בזמן ובכסף, או שנדרש ריאגנטים שקשה להשיג.
שני גישות ניסיוניות ובסיליקון ולהיות מועסקים על מנת לקבוע את הטופולוגיה של חלבוני הקרום המתגוררים בתוך קרום הפלזמה. מאז התחזיות הראשונות של תחומים קרום פורש המבוססים על ההערכה של הידרופוביות indiviחומצות אמינו כפולים 3, אלגוריתמים חזוי רבים זמינות כעת באינטרנט, ופשוט דורשות ידע של רצף החומצות האמיניות של החלבון. עם זאת, הנחות הן לעתים קרובות מרכזיות לתוכניות כגון דוגמנות, הנחות שיכולים להוביל למשימות לא נכונות של טופולוגיה 4,5. יתר על כן, בעוד שתחזיות מבוססות מחשב אלה יכולים בהיסוס להקצות אזורים פורש קרום, הם לא תמיד לקבוע אם אמינו או termini carboxy של חלבונים הם בציטופלסמה, לומן אברון או חיצוני תא. אפילו עם עליית כוח חישוב, והשימוש באלגוריתמי למידת מכונה 6, נתונים כאלה הוא עדיין מודל, וחייב להיות מאומת באמצעות נתונים שנרכשו באופן ניסיוני. קביעה ניסיונית ישירה של טופולוגיה קרום כבר התחייבה באמצעות פנלים של נוגדנים חד-שבטיים עם epitopes הידועה מופצת ברחבי החלבון, שבו הערכה של immunoreactivity נעשתה לפני ואחרי permeabilization התא. זהגישה דורשת מערך של נוגדנים, אשר לא יכול להיות זמינה לחלבון של עניין.
אסטרטגיה חלופית היא להנדס תגי epitope כגון myc או hemagglutinin (HA) למקומות שונים ברחבי החלבון, ואחרי שוב על ידי קביעת immunoreactivity לפני ואחרי permeabilization הקרום. בנוסף לתגים חיסוניים, תגים האנזימטית (כולל phosphatase אלקליין, β -galactosidase, או -lactamase β) ושינויים כימיים כגון סריקת ציסטאין שכל הועסקו כדי לקבוע טופולוגיה חלבון קרום 7,8. שיטה נוספת המועסקות למיפוי טופולוגי של חלבוני קרום פלזמה מסתמכת על גישה מעט שונה לתגי epitope. בשיטה זו את רצף התג הוא רצף קונסנסוס glycosylation N הצמוד NXS / T. מאז glycosylation מתרחשת רק כאשר רצף זה נוכח בלומן של מסלול biosynthetic, הנוכחות של התג בluminal לעומתתא cytosolic הוא ציין בקלות כמו שינוי מסה על ג'לי SDS-PAGE. גישה כזו הוחל ערוץ יון multispanning 9 CFTR. בעוד שכל הגישות הללו כבר נוצלו, ברור שכל מה שהם דורשים השקעות רבות בביולוגיה מולקולרית כדי ליצור רצף ומבני הסעפת.
כדי לקבוע מידע טופולוגי לגבי חלבונים הטרנסממברני ממוקמים בתוך אברונים תוך-תאיים הוכיח להיות מאתגרים יותר. היישום של טכנולוגיות מבוססות הקרינה עם זאת, הפך את הנחישות של טופולוגיה קרום הרבה יותר פשוט. הטכניקה של שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) מסתמכת על האינטראקציה בין שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי, שחזור מאפייני הניאון של החלבון ש-10. למרות שתחילה תאר לקביעת אינטראקציות בין חלבונים in vivo 10, גישה זו גם נוצלהכדי לקבוע טופולוגיה חלבון קרום בתאי צמח 11. עם זאת גישה זו היא גם זמן אינטנסיבי כפי שהוא דורש לא רק הדור של חלבוני היתוך עם החלבון של עניין, אלא גם מגוון של חלבוני היתוך ממוקדים ללום cytosol או אברון, ודורש ידע שבתאי קרומי החלבון של העניין מתגורר ב .
גישה חלופית פשוטה יותר לקביעת טופולוגיה חלבון הקרום תוארה 12. Assay, הקרינה פרוטאז ההגנה (FPP) דורשת את הדור של חלבון היתוך בין GFP והגן של עניין. הגישה מבוססת על הנגישות היחסית של פרוטאזות שאינה ספציפית למחצית GFP; תלוי אם GFP מוגן מproteolysis על ידי המתגורר בלומן של אברונים תוך-תאיים או חשוף לproteolysis מעצם נוכחותו בcytosol. לכן, אם מחצית GFP על החלבון של עניין בפני ציטופלסמה, היא תהיה חשופה לפעילות פרוטאז ואותות הקרינה לאיבוד. לעומת זאת, אם מחצית GFP על החלבון של עניין בפני סביבה 'מוגנת' מפרוטאז (כגון לום Golgi) ולאחר מכן את אות הקרינה תתמיד.
כדי לאפשר פרוטאזות להיכנס לתא, אך לא להיכנס לתאי קרום תאיים digitonin תרופת הכולסטרול מחייב משמש. כולסטרול הוא סטרולים הדומיננטיים בבעלי חוליות, והוא מועשר באופן ספציפי בקרום הפלזמה ביחס לתאים תאיים. רעלן glycoside, digitonin, מופק אצבעונית הארגמנית צמח. יש digitonin זיקה לממברנות עשירות בכולסטרול, שבו היא מובילה לקרום בררני permeabiliztion 14,16 (איור 1). בנוסף מאפשר יציאה של רכיבי cytosolic קטנים, permeabilization digitonin גם מאפשר הכניסה של מולקולות חיצוניות, כגון K proteinase או טריפסין. פרוטוקול FPP מנצל את fact שקרום הפלזמה מכיל עד 80% מכולסטרול סלולארי 17, ואילו אברונים אחרים, כגון ER, Golgi, endosomes, מיטוכונדריה, שיש להם תוכן כולסטרול נמוך מאוד, נותרה על כנן 14. ההתאגדות סלקטיבית של כולסטרול לתוך קרום הפלזמה נצפתה בתאים רבים אוקריוטים, המתירה את השימוש בpermeabilization קרום הפלזמה digitonin תלוי במינים האיקריוטים מגוונים כגון S. cerevisiae ל14,18 אנושיים. Assay FPP מספק דרך פשוטה, מהירה וחזקה למדי של קביעה (א) אם חלבון הוא קרום מחויב / קשורים או diffusible בחופשיות בcytosol ו- (ב) שהתחום של חלבון קרום פונה ללום cytosol או אברון. צריך חלבון קרום אוריינטציות מרובות, האות תנבע מהצורה הדומיננטית וצורות קטין לא תזוהה. אמנם יש יכול להיות קצת חששו כי התוספת של מחצית GFP לחלבון על ריבית עשויה להשפיע על תפקודה ו/ או לוקליזציה subcellular, זה בעצם יותר תיאורטי מאשר בפועל. ואכן מחקרים רבים הראו באופן ברור כי תג ה- GFP לא לשנות את המאפיינים של החלבון 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור ואישור של מפלצות חלבון פלואורסצנטי
- צרף חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לטרמיני אמינו או carboxyl של החלבון של עניין באמצעות אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים 13.
הערה: למרות שיש לנו בשימוש נרחב GFP, גרסאות אחרות כגון חלבון ציאן ניאון (CFP), חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), יכולים להיות מועסקות DsRed וmCherry. השיפורים בfluorophore מתקפל יעילות, בהירות וphotostability כל הזמן שנעשים, וחוקרים צריכים להיעזר בבונת הדור האחרונה.- לאשר רצף ה- DNA נכון ולוודא שמחצית GFP היא במסגרת עם החלבון של עניין. לבצע רצף באמצעות אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים 21.
הערה: יש מוסדות רבים מתקני DNA ליבה, שהחוקר מומלץ לפנות לקבלת מידע נוספת. - לחלבוני קרום לעבור יחידים או כפולים, ליצורשני גרסאות מסוף amino- וcarboxyl של חלבוני היתוך 19.
- לחלבונים פורש רב להכניס GFP בתוך לולאות extramembrane המשוערות, כמו גם טרמיני. קח טיפול מיוחד בעת יצירת מפלצות הטרנסממברני עם חלבון היתוך הניאון הצמוד לתחנה הסופית אמינו של חלבון המטרה כרצפי אות לעתים קרובות ביקעו ידי proteolysis פעם החלבון עבר דרך translocon ER.
- במקרה של רצפי אות קיימים, להכניס את דיסטלי חלבון היתוך הניאון לאתר המחשוף כדי ליצור חלבון בוגר המכיל חלבון פלואורסצנטי מתויג אמינו מסוף בשלמותה. להעסיק אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים עבור הדור של מפלצות 21.
- לאשר רצף ה- DNA נכון ולוודא שמחצית GFP היא במסגרת עם החלבון של עניין. לבצע רצף באמצעות אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים 21.
- לקבוע את הנוכחות של אות ניאון מקומי כראוי מספיק בשורת התאים של עניין.
- שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות הקרינה הפנימית של ה- GFP תחת נאות,אכלתי תנאי מסנן מוגדר. למערכות סינון GFP שיקיפו 510-560 ננומטר, לאשר כי המסננים הנכונים משמשים לfluorophore המועסק.
הערה: אות מספיק מושגת כאשר הערכה לפי העין מספקת מספיק איתות חזקה שהמבנה התאי שבתוכה האות מתגוררת הוא בקלות לפתור מעל רקע. בנוסף דפוס ההכתמה של GFP החלבון צריך להיות בקנה אחד עם זו של סמנים לאברון המתאים, ורצוי זהה לזה של החלבון לא מתויג כשפה אם.
- שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות הקרינה הפנימית של ה- GFP תחת נאות,אכלתי תנאי מסנן מוגדר. למערכות סינון GFP שיקיפו 510-560 ננומטר, לאשר כי המסננים הנכונים משמשים לfluorophore המועסק.
- לקבוע אם גישת transfection יציבה או חולפת תשמש מבוססת על נבדק החלבון.
הערה: transfectants יציב בדרך כלל להרשות לעצמם רמות נמוכות יותר של ביטוי מאשר מערכות חולפות. למרות שביטוי חולף מניב ביטוי ברמה הגבוהה של חלבונים ועוצמת אות גידול (~ לאחר transfection 5-24 שעות בהתאם לחלבון), זה גם יכול להוביל חפצי ביטוי יתר כגון aggr חלבוןegation או הרוויה של מסלולי חלבון מיקוד, שהוביל ללוקליזציה subcellular שגויה.
2. Transfection של תאים ותרבית תאים
הערה: מגוון רחב של תאי נוחות לניתוח FPP, כולל HEK293, הלה, COS-7 ותאי CHO 14. התיאור שלהלן מבוסס על ביטוי חלבוני קרום בתאי HEK293.
- לגדל תאים עובריים אנושיים בכליות (HEK293) כמו monolayers חסיד ב 6 מיליליטר של שינוי Dulbecco של נשרים בינוניים (DMEM), בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS), 1% פירובט נתרן, ו -250 מיקרוגרם / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר ב 37 מעלות C עם 5% CO 2. לבצע את כל העבודה עם תאים בתרבית רקמת מכסה המנוע זרימה למינרית. לגדל תאים במדיום התרבות עד ~ 80% ומחוברות בבקבוק T-75.
- תאי Transfect שימוש בכל יעילות גבוהה סטנדרטית, שיטת transfection רעילות נמוכה, כולל lipid-, טכנולוגיות viral- או מבוסס electroporation ליצור transient או ביטוי יציב. בדרך כלל 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד לכל 1 x 10 6 תאים נותן ביטוי חלבון לשחזור טוב. שמור על תאים ל5-48 שעות בתקשורת ותרבות רקמות המתאימות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה מסוגלת CO 2.
- צג תאים לביטוי של חלבון ה- GFP-ההיתוך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, באמצעות אותות הקרינה הפנימיים של ה- GFP, באמצעות מערכות סינון מתאימות על פי הפרוטוקול של היצרן. אות הקרינה בדרך כלל מגיעה לשיא תוך 24-72 שעות הבאות transfection. השתמש בתאים כאשר אות הקרינה מגיעה לרמה המקסימלית. לעקוב אחר רמות ביטוי חלבון על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדנים מכוונים נגד שני החלבון של עניין או מחצית GFP.
- לתאי צלחת ניתוח ניסיוניים על coverslips המצופה. צפה גם בתצורת תאי חיים או הקיבעון הבא והר בשקופיות מיקרוסקופ. תאי צלחת להשיג 60% מפגש -80% תוך 24-48 שעות.
- coverslips מעיל עם פתרון poly ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר), כך שכל פני השטח מכוסים. דגירה למשך 30 דקות תחת אור אולטרה סגול בטמפרטורת חדר, ואחריו 60 דקות בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס. הסר פולי-ליזין העודף ולשטוף coverslips ב PBS 3 פעמים.
- לחלופין, צלחת התאים על כיסוי זכוכית לתאים בהיקף של צלחות תרבית תאים עם תחתית זכוכית אופטית, כדי לאפשר הדמיה ישירה עם מטרות נפט טבילה. התקנת מיקרוסקופיה בפועל תלויה בציוד העומד לרשות החוקרת, אבל צריך להיות מסוגלים שינויי פתרון מהירים. בהתאם לצורת סוג התא ותא, תאים צריכים להיות בסביבות 60-90% ומחוברות בזמן assay FPP.
התקנת 3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- השתמש במטרת נפט טבילה גבוהה צמצם מספרי (NA) לאיסוף מקסימאלי אות ורזולוציה מרחבית, כגון 60x, 1.42 אובייקטיבי טבילת שמן NA. השתמש הדואר הבא לייזרים כדי לעורר את fluorophores: גז ארגון 488 ננומטר (GFP וYFP) ודיודה 561 (RFP, mCherry).
- לקבוע את שיעור חשיפה, רווח וללכוד האופטימלי של תמונות לכל מבנה. להתאים את עוצמת לייזר וזמן חשיפה ללמזער photobleaching (ראה שלב 7.1.2).
- ללימודים באמצעות fluorophores מרובה (לדוגמא, סמן מסיס לpermeabilization קרום בתיאום עם סמן חלבון קרום), לבחור מסנן מתאים קובע למזער אות הצטלבות ומקסם את יחסי אות לרעש.
4. קביעת תנאים אופטימליים לפלזמה ממברנה permeabilization
- הסר את מדיום תרבית תאים מהתאים לבטא רק חלבוני ניאון מסיסים (למשל EGFP, DsRed). שוטף את התאים 3 פעמים (1 דקות כל אחד) במאגר KHM (110 אצטט אשלגן מ"מ, 3 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ HEPES-NaOH, pH 7.2). לבצע ניסויים עם תאים וכל חומרים כימיים בטמפרטורת חדר.
- תאי מקום on coverslips (ראה שלב 2.4) במאגר KHM על במה מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולאסוף את התמונה הראשונה, המייצגת את שליטת שלב '-permeabilized שאינה ".
- באופן סלקטיבי לpermeabilize קרום הפלזמה, להוסיף digitonin (30 מיקרומטר) במאגר KHM לתאים. Perfuse תאים עם חיץ (חיץ + digitonin) בשיעור של 5 מיליליטר / דקה ל10-60 שניות.
- קבע את ריכוז digitonin האופטימלי על ידי הגדלת הריכוז של digitonin בהדרגה. ריכוז digitonin האופטימלי מושגת כאשר יש אובדן מוחלט של אותות הקרינה מEGFP המסיס בתוך 10-60 שניות של יישום digitonin. לתאים רבים יישום של 10-50 digitonin מיקרומטר מספיק כדי permeabilize קרום התא.
- עבור כל היישומים להשתמש בריכוז הנמוך ביותר האפשרי של digitonin. לאסוף תמונות לאחר digitonin permeabilization לאות רקע permeabilized.
- ודא שהכימרה GFP-החלבון של עניין הוא קרום בtegrated יאשר ההחזקה סלולרית של אות הקרינה הבאה permeabilization digitonin של קרום הפלזמה 16.
- הגעה חלבון פלואורסצנטי אברון ספציפי 23. חלבוני מיטוכונדריאלי לעבוד גם בעניין זה 16, למשל, וקטור pDsRed2-מיטו. לקבוע תנאים אופטימליים ביטוי כמתואר בשלב 2.1.
- ודא שריכוז digitonin מתאים לסוג התא מועסק על ידי הבטחה כי המורפולוגיה של אברונים תוך-תאיים נשארה קבועה על חשיפה (עד 60 דקות) ממושכת לdigitonin.
הערה: פרוטוקולים השתמשו במיקרוסקופ immunofluorescence הסטנדרטי באמצעות נוגדנים נגד תאים סלולריים שונים, כגון lysosomes (למשל, LAMP1), Golgi (למשל, TGN38), reticulum endoplasmic (למשל, calnexin), endosomes (למשל, Rab5), מיטוכונדריה (למשל, ציטוכרום ג). אם שינויי מורפולוגיה / שלמות אברון תוך-התאי אובה באופן דרמטיr 60 דקות, סביר להניח שריכוז digitonin היה גבוה מדי, ודורש הפחתה בריכוז digitonin ו / או זמן חשיפה.
הערה: digitonin הוא רעיל על ידי שאיפה ומגע עם עור. ללבוש ציוד מתאים להגנה אישית (PPE).
5. פרוטאז טיפול בחלבוני ניאון
- לשטוף את התאים במאגר KHM ולאחר מכן להוסיף פרוטאז (K proteinase; 50 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר KHM) ישירות על גבי התאים. Perfuse תאים בקצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה באמצעות מערכת זלוף הכבידה מוזן ברציפות להתרחץ ההכנה.
- פתרונות חנות ב 50 מיליליטר מזרקים וצינורות פוליאתילן מחוברים מאגרים עצמאיים לסעפת עם שקע יחיד באמבטיה (קצב זרימה 5 מיליליטר / דקה). מקם פיפטה יניקה כדי לשמור קבוע (0.5 מיליליטר) אמבטיה נפח ולהשיג תמורת פתרון על ידי מעבר ידני בין מאגרי זלוף.
- לאסוף תמונות כדי לקבוע אם פלואורידאות escent נמשכת או משפילה. אובדן> 90% מעוצמת האות הראשונית על 30-60 שניות עולה בקנה אחד עם השפלה מפרקי חלבונים של הכימרה GFP-החלבון (ראה תוצאות נציג).
- אם אין השפלה אות הוא ציין עם proteinase K, כאשר אובדן כזה צפוי, להחליף את פתרון K proteinase עם טריפסין (4-8 מ"מ) במאגר KHM. אם יש צורך, לנצל תערובת של proteinase K וטריפסין. אין צורך כדי להרוות את פעילות פרוטאז.
6. גישה חלופית לפלזמת החלבונים ממברנה עם תחומים חיצוניים
- לחלבוני קרום פלזמה, לבצע את assay למפלצות לפני digitonin permeabilization חלבוני ניאון חיצוניים. לשטוף את התאים על coverslips במאגר KHM (5 מיליליטר / דקה x 3 דקות), ולקחת את תמונה לטיפול טרום-פרוטאז ולכמת אות הקרינה מראש פרוטאז כמו בשלב 7.
- לחשוף תאים לפרוטאז (proteinase K; 50 מיקרוגרם / מיליליטר או טריפסין 4-8 מ"מ במאגר KHM) בtהוא היעדר digitonin ידי מרוסס התאים עם פרוטאז מדיה המכילה KHM (קצב זרימה 5 מיליליטר / דקה). לאסוף תמונות של חלבון פלואורסצנטי, כדי לקבוע כמה מהר את האות נעלמת או כמה זמן נמשכת האות.
- לפני permeabilization digitonin, להרוות את כל פעילות פרוטאז, על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים (1 דקות כל אחד) בתקשורת ותרבות תא המכילה סרום 10% (FBS).
- לשטוף את התאים על ידי מרוסס עם חיץ KHM (קצב זרימה של 5 מיליליטר / min) למשך 2 דקות. לרכוש תמונה שלפני permeabilization. Permeabilize קרום התא, כמתואר בשלב 4.
- לאסוף תמונות הבאות בנוסף פרוטאז, כמתואר בשלב 5.
ניתוח 7. תמונה
- שימוש במיקרוסקופ הפוכה מסוגל להקליט "חי תא", שבו אובדן אות הקרינה יכול להיות במעקב בזמן אמת. לניטור רציף, להעסיק פרמטרים זהים (זמן חשיפה, רווח, עוצמת לייזר, וכו ').
- לקבוע experפרמטרים imental על ידי התבוננות אות הקרינה מGFP-החלבון של עניין בתנאי שליטה (כלומר, KBH חיץ לבד). התאם את ההגדרות להרוויח זמן, עוצמת לייזר וחשיפה על המיקרוסקופ מונחה מחשב כדי להבטיח שאין אובדן ניכר של עוצמת אות על פני תקופה 10-20 דקות.
הערה: עוצמת האות אינה ערך מוחלט, אלא מבוססת על מערכת מיקרוסקופ והגדרות זמינה לכל צרכן. לעקוב אחר שינויים בעוצמת הקרינה היחסית.
- לקבוע experפרמטרים imental על ידי התבוננות אות הקרינה מGFP-החלבון של עניין בתנאי שליטה (כלומר, KBH חיץ לבד). התאם את ההגדרות להרוויח זמן, עוצמת לייזר וחשיפה על המיקרוסקופ מונחה מחשב כדי להבטיח שאין אובדן ניכר של עוצמת אות על פני תקופה 10-20 דקות.
- לחלופין, טיפול בתאים בזמן נקודות סט בdigitonin אחרי פרוטאז, ולתקן את התאים לפני ההרכבה על coverslips להדמיה. לקבוע נקודות זמן אמפירית בעקבות הליכים בשלבים 4 ו -5 לחקירה הראשונית, להתחיל ב 0, 30, 60, 120 ו -300 שלאחר שניות תוספת של digitonin או פרוטאז.
- תקן תאים (20 דקות בטמפרטורת חדר) באמצעות כמות מספקת של מקבע (paraformaldehyde 3.7% בPBS) כדי להטביע ה מלאתאי דואר.
- להרוות paraformaldehyde שייר על ידי שטיפת תאים עם PBS המכיל 20 מ"מ גליצין (3 x 5 דקות).
- coverslips ההר על ידי הסרת נוזלי עודפים מcoverslip והיפוך coverslip על גבי מדיה הרכבה 50 μl על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות הדמיה. לאפשר שקופיות לייבוש למשך לילה לפני ההדמיה.
- לאסוף תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (תחת המסננים המתאימים קובע תואם בשימוש fluorophore) על ידי שימוש בפונקצית לכידת תמונת וידאו במיקרוסקופ פלואורסצנטי מחשב נשלט.
- לכמת עוצמות אות ניאון כפונקציה של מצב דגירה. השג את העצמה הממוצעת פיקסל בתוך אזור של העניין (ROI) המקיפה תא בודד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פלזמה ממברנה permeabilization
permeabilization קרום פלזמה יעיל נקבע על ידי השימוש בחלבונים מסיסים ניאון (למשל, GFP, DsRed) (שלב 4). חלבונים אלה, כאשר באו לידי ביטוי בתאים, חופשיים מפוזר בcytosol, והולכים לאיבוד כאשר קרום פלזמת permeabilized באמצעות digitonin (איור 2). היעלמות מוחלטת של אות ניאון צריכה להתרחש בתוך 10-60 שניות של יישום digitonin. אישור לכך שהחלבון של עניין קשור באברונים תוך-תאיים מושגת על ידי וציין את השמירה של אות הניאון הבאה permeabilization digitonin.
פרוטאז טיפול
בעקבות דור מוצלח של מפלצות ניאון בין החלבון של עניין וחלבון פלואורסצנטי (GFP, YFP, וכו ') (שלב 1) והביטוי של החלבון בתאי הניאון (שלב 2), טיפול תאים של permeabilized עם פרוטאז יספק מידע על אם fluorophore (ותחום החלבון הסמוך) נמצא בcytosol ונגיש לפרוטאז עיכול, או נמצאים בתוך לומן אברון וכך מוגן מפני עיכול פרוטאז (שלב 4). LMTK2 הוא קינאז קרום מעוגן 15, ומבחני הגנת פרוטאז הקרינה היו בשימוש כדי לקבוע טופולוגיה הממברנה שלו 16. זנב carboxyl של LMTK2 היה התמזג GFP והביע זמני. אות LMTK2-GFP פלורסנט אבדה במהירות הבאה תוספת של proteinase K, המציינת את המיקום של התחנה הסופית carboxyl של LMTK2 להיות ממוקם בתוך cytosol (איור 3). Caveolin-GFP (Cav1-GFP) 17 הוא חלבון קרום פלזמה עם GFP-מחצית המצורפת לתחום cytosolic. כמו בLMTK2, האות מcaveolin-YFP היא digitonin חסר רגישות, אבל רגישה לתוספת הבאה של פרוטאז (איור 3).
t "> יכולים גם להיות מזוהים חלבונים מסיסים Luminal באמצעות פרוטוקול FPP. בדוגמא זו, KDEL אות שימור ER מצורף לDsRed. בניגוד לאותות מLMTK2 וcaveolin, האות מKDEL-DsRed אינה רגישה לשניהם digitonin ופרוטאז, כdigitonin אינו מסוגל permeabilize קרום ER ואות הניאון מוגן מפני השפלה פרוטאז. דוגמא לתחום קרום נמצא בתוך לומן של אברון ניתן על ידי חלבון המיטוכונדריה היא המקטע השמיני של מונואמין ג ציטוכרום האדם 18,19. PDsRed-Mit, מקודד את החלבון האדום הניאון מsp Discosoma. התמזג המיטוכונדריה מיקוד רצף ממונואמין ציטוכרום C. בתאים לבטא pDsRed-מיטו, אות ניאון נראית בתא. בעקבות permeabilization digitonin, אות הניאון הקשורים לpDSRed-מיטו נותר יציב. יתר על כן, בעקבות תוספת של proteinase K, הקרינה הקשורים pDsRed-מיטו נמשך, con עולה בקנה עם fluorophore במיטוכונדריה ואינו חשוף לcytosol וכך מוגן מפני פעילות פרוטאז (איור 3).תאי Domains
טיפול פרוטאז של תאים-permeabilized שאינם צריך במהירות להרוות את אותות הקרינה כאשר מחצית הניאון מחוברת לחלבון קרום פונה חיצונית התא. החלבון המעוגן glycosylphosphatidylinositol (GPI) PRP 20 משמש כדוגמא מצוינת. מבנה המכיל את חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP) מחובר לתחנה הסופית אמינו של PRP (YFP-PRP) 21,22, מתנה נדיבה מד"ר אהוד כהן, מאוניברסיטת עברית ירושלים. לפני פרוטאז טיפול, אות הניאון מYFP תאי הייתה בהירה (איור 4). בעקבות טיפול פרוטאז, אות הקרינה תאית נעלמה במהירות.
שיקולי זמן
התחת = "jove_content"> שלב 2 דורש שעה לספירת תאים, transfection וציפוי, בתוספת 6-24 שעות כדי לזהות ביטוי חלבון בתאי transfected. צעדים 4-6 ידרשו כ 20-30 דקות לכל coverslip לאוסף תמונה של תוספות טיפול מראש, digitonin ופרוטאז. שלב 7, ניתוח נתונים, וquantitation האות דורשים 10-30 דקות נוספות לדגימה.
איור 1: permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה (א) מודל Cartoon של assay FPP מראה תא בודד עובר את פרוטוקול הניסוי.. הסמל האדום מייצג חלבון אדום פלורסנט (RFP) בcytosol, סימנים ירוק וכחול מייצגים חלבונים הטרנסממברני עם תג הניאון או מול לום אברון (הכחול) או cytosol (ירוק). (ב) בעקבות permeabilization digitonin, cytosolic החופשיחלבונים מפוזר משם, הפחתת אות RFP. (ג) כתוצאה מיישום proteinase K, האות הירוקה cytosolic נפגעת, ואילו האות הכחולה מוגנת מפני השפלה על ידי נוכחותה בלומן אברון.
איור 2: טיפול digitonin permeabilizes קרום הפלזמה ומשחרר GFP cytosolic (א) Cartoon של תא בודד להביע GFP המסיס, לפני ואחרי טיפול digitonin.. (ב) טיפול digitonin permeabilizes קרום הפלזמה ומשחרר GFP cytosolic. אזור של העניין (ROI) נמשך סביב תאי CHO להביע GFP המסיס. בעקבות טיפול עם digitonin (50 מיקרומטר), תמונות צולמו לפני ואחרי התוספת של digitonin, ובנקודתי זמן המצוינות. בר סולם, 10 מיקרומטר. (ג) כימות של fluoreעוצמות Scence של הזמן-הסדרה המלאה (AF) מוצגת.
איור 3: FPP חושף את הטופולוגיה של LMTK2 חלבון endosomal (א) Cartoon של FPP מראה אובדן DsRed (כדורים אדומים), אך שמירה של LMTK2-GFP (כדורים ירוקים) הבא permeabilization digitonin, ואחריו אובדן אות על יישום של proteinase K. . (ב) assay FPP של תאי CHO להביע DsRed וLMTK2-GFP. תמונות צולמו לפני ואחרי טיפול digitonin, ובעקבות proteinase K, כפי שצוין. בר סולם: 10 מיקרומטר.
איור 4: (א) מודל Cartoon מראה את הטופולוגיה ומיקום של YFP-PRP (ירוק) לפני ואחרי טיפול K proteinase. תאי CHO להביעYFP-PRP היו נתונים לproteinase K עבור 100 שניות. (ב) תמונות שצולמו לפני ואחרי טיפול פרוטאז מוצגים במועדים המצוין. אות YFP-PRP אבדה לחלוטין הבא פרוטאז בהעדר digitonin. אזור צהוב מופעים של העניין (ROI) המשמש לquantitation מוצג ב( ג).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתמצאות וטופולוגיה הנכונות של חלבונים בממברנה היא חיוני לתפקוד התקין שלהם. למרות החשיבות של הבנת טופולוגיה חלבון קרום, יש חלבונים רבים שעבורם נתונים כאלה חסרים לחלוטין. FPP מספק דרך קלה ויעילה לקביעת טופולוגיה חלבון קרום, ואחד שיכול להתבצע על ידי רוב המעבדות. גישת FPP מעניקה יתרונות משמעותיים על פני שיטות קודמות לקביעת טופולוגיה חלבון. לדוגמא, אין צורך להיות פנל של נוגדנים מרובים המכוונים תחומים שוב שונים של החלבון של עניין 31. במקרים רבים פנל כזה של נוגדנים אינו זמין; זה נכון במיוחד עבור חלבונים משובטים חדש. כassay יכול להתבצע ברמה תא בודדת, כמויות גדולות של חלבון ביוכימיים אינן נדרשים ביוכימיים במורד הזרם מנתח כגון proteolysis או SDS-PAGE. ואכן, יש צורך במספר קטן יחסית של תאים transfected להקצות באופן חד משמעיטופולוגיה לחלבון של עניין. זה חשוב אם החוקר בוחן טופולוגיה בתאים קשה transfect כגון תאים או תאי עצב אפיתל. בנוסף פשוט של מחצית GFP לאו התחנה הסופית carboxyl או אמינו של החלבון יכול להיות מושגת בקלות באמצעות GFP זמין מסחרי רב המכילים פלסמידים, וברוב המקרים, התוספת של מחצית GFP לא להפריע קיפול חלבונים נכון או לוקליזציה subcellular. עם זאת, החוקר חייב לאשר כי זה נכון לחלבון שלהם, כפי שיש הפוטנציאל לGFP להשפיע על החלבון של העניין 23,24. חלבונים רבים כבר זמינים כחלבוני היתוך GFP, ולכן דורשים מאמץ נוסף מינימאלי ליזום מחקרי טופולוגי. למרות ניטור רציף של הקרינה מספק אמצעי מהיר ויעיל של קביעת טופולוגיה חלבון, לחוקרים שאין להם גישה לחיים-תא ציוד הדמיה, assay מותאם בקלות ליישום קיבעון פורמלדהידמקק באמצעות epifluorescence הסטנדרטי של מיקרוסקופיה confocal.
עם זאת ישנם כמה מגבלות בתחולתה של assay FPP. צריך פרוטאוליטים עיבוד, או שלאחר translational שינויים אחרים לגרום לטופולוגיות קרום מעט שונות לחלבון של עניין, assay FPP רק להעריך את צורת החלבון הדומיננטית. בנוסף, צירוף מחצית GFP לtermini של חלבונים מסוימים יכול להשפיע על התפקוד שלהם, למשל להתערב בתחומי PDZ מסוף carboxyl. עם זאת, assay FPP מאפשר גישה פשוטה להקמת התמצאות והטופולוגיה של חלבונים בממברנה רבות.
זה קריטי, כי ניסויים ראשוניים שיש לבצע כדי לקבוע את הריכוז הנכון של digitonin לשחרר GFP המסיס תאיים. אם GFP אינו מפוזר מחוץ לתא הבא יישום digitonin, הריכוז של digitonin צריך להיות בהדרגה, כדי לקבוע את הריכוז המינימלי מחדשרכישתו כדי להקל על שחרור. עם זאת, יותר מדי digitonin ישפיע על המורפולוגיה של שלפוחית תאית, ששלמותה צריכה להיות מאושרת על היישום הבא digitonin. אברונים בתאים מסוימים רגישים מאוד ועשויים לדרוש הרכב חיץ יותר ייצוב 25. אם אות הקרינה מהכימרה נבדקת היא נמוכה, בחירת שיבוט אחד עם רמת ביטוי גבוהה יותר, או ביצוע ביטוי חולף, לעתים קרובות להגביר את עוצמת האות לרמה מקובלת. מחפש את חדש יותר, בהירים יותר פלסמידים צריכים להיות גם נחשבים עם עוצמת אות נמוכה. לבסוף, יש להקפיד על מנת להבטיח כי אובדן האות ראה הוא עקב הידרדרות פרוטאז ולא לphotobleaching של fluorophores. הפחתת עוצמת אור ו / או שיעור רכישה תעזור להפחית photobleaching.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
