Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

Die Plasmamembranen sowie die zahlreichen intrazellulären Membranen dienen als Barrieren zwischen zwei wässrigen Kompartimenten. Im Fall der Plasmamembran, ist die Trennung zwischen der Außenseite und der Innenseite der Zelle; für intrazelluläre Organellen ist zwischen dem Zytoplasma und dem Organell Lumen. Zum Beispiel, das Endoplasmatische Retikulum (ER) Membran trennt eine oxidierende Umgebung in dem Lumen des ER aus einer zytosolischen reduzierende Umgebung ^1. Membranproteine ​​sind für ER-assoziierten Ribosomen synthetisiert und erreichen ihre endgültige Topologie in der ER-Membran ^2. Die Übernahme von geeigneten Membranorientierung und Topologie für Proteine ​​ist entscheidend für ihre normale Funktion. Korrekte Topologie ermöglicht relevanten Domänen von Membranproteinen mit ihren Bindungspartnern zu interagieren, kann es entscheidend posttranslationale Modifikationen auftreten, und im Fall von Plasmamembranproteinen, ermöglicht die Zelle zu interagieren und reagieren to seiner Umgebung. Um die Funktion des Membranproteins bewusst zu werden, ist es natürlich unbedingt wissen, wie das Protein wird mit Bezug auf die Membran in dem sie sich befindet, dh seine Membrantopologie orientiert. Zusätzlich zur Übernahme von wissenschaftlicher Grundlagenforschung, das Verständnis der Topologie eines Membranproteins und welche Aspekte einer Proteinoberfläche an unterschiedliche Umgebungen ausgesetzt hat klinische Implikationen gekennzeichnet, da Membranproteine ​​umfassen die Mehrheit der pharmakologische Targets ^3. Bis vor kurzem Ansätze zur Bestimmung der Membranprotein-Topologie haben erhebliche Investitionen in Zeit und Geld erforderlich oder haben Reagenzien, die schwer zu bekommen sind erforderlich.

Sowohl experimentelle und in silico Ansätze wurden verwendet, um die Membrantopologie von Proteinen, die sich innerhalb der Plasmamembran bestimmen. Da die ersten Vorhersagen der Membran-überspannende Domänen auf der Grundlage der Auswertung Hydrophobizität indiviDual Aminosäuren ^3, zahlreiche Vorhersagealgorithmen sind jetzt im Internet verfügbar und einfach Wissen um Aminosäuresequenz des Proteins erfordern. Allerdings sind Annahmen oft von zentraler Bedeutung für eine solche Modellierungsprogramme, Annahmen, die zu falschen Zuordnungen der Topologie ^4,5 führen kann. Hinzu kommt, dass diese Computer-basierten Vorhersagen versuchsmembranüberspannenden Regionen zuzuordnen, aber nicht immer, ob die Amino- oder Carboxy-Termini von Proteinen im Zytoplasma oder Zellorganelle Lumens außen. Selbst bei erhöhter Rechenleistung und die Verwendung von Maschinenlernalgorithmen ^6, wie Daten noch ein Modell, und müssen mit experimentell ermittelten Daten validiert werden. Direkte experimentelle Bestimmung der Membrantopologie wurde unternommen unter Verwendung von Platten aus monoklonalen Antikörpern mit bekannten Epitopen gesamten Proteins, wobei die Bewertung ihrer Immunreaktivität wurde vor und nach Zellpermeabilisierung hergestellt wurde verteilt. DieseAnsatz erfordert eine Reihe von Antikörpern, die nicht für das Protein von Interesse verfügbar sein werden.

Eine alternative Strategie ist es, Epitop-Tags, wie myc und Hämagglutinin (HA) in verschiedene Positionen in dem Protein, wiederum durch Bestimmung der Immunreaktivität vor und nach einer Membranpermeabilisierung gefolgt Engineer. Neben immunogene Tags, enzymatischen Tags (einschließlich alkalischer Phosphatase, β Galactosidase oder β-Lactamase-) und chemischen Modifikationen, wie Cystein Scannen wurden alle verwendet, um Membranproteintopologie ^7,8 zu bestimmen. Eine weitere für die topologische Abbildung von Plasmamembranproteinen verwendete Methode beruht auf einem etwas anderen Ansatz, um Epitop-Tags. In diesem Verfahren wird der Tag-Sequenz ist der N-verknüpften Glykosylierung Consensussequenz NXS / T. Da nur Glykosylierung tritt auf, wenn eine solche Sequenz in das Lumen des Biosynthesewegs der Anwesenheit des Etiketts in einer Lumen Vergleich vorliegta Cytosol wird leicht als Massenverschiebung auf SDS-PAGE-Gelen beobachtet. Eine solche Vorgehensweise hat zur multispanning Ionenkanal CFTR ⁹ angewandt. Während all diese Ansätze verwendet worden, ist es klar, dass sie alle erfordern erhebliche Investitionen in der Molekularbiologie zu generieren und zu sequenzieren, die vielfältigen Konstruktionen.

Um zu bestimmen, topologische Informationen bezüglich Transmembranproteine ​​innerhalb der intrazellulären Organellen hat sich als schwieriger. Die Applikation der fluoreszenzbasierten Technologien hat jedoch die Bestimmung der Membrantopologie viel einfacher. Die Technik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) beruht auf der Wechselwirkung zwischen zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins, das Wiederherstellen der fluoreszierenden Eigenschaften des Proteins ^10. Obwohl zunächst zur Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo ¹⁰ beschrieben, hat dieser Ansatz auch dazu verwendet worden,Membranproteintopologie in pflanzlichen Zellen ¹¹ zu bestimmen. Dieser Ansatz ist aber auch zeitintensiv, da sie die Bildung nicht nur von Fusionsproteinen mit dem Protein von Interesse, sondern auch eine Vielzahl von Fusionsproteinen in das Cytosol oder Organell Lumen gezielte benötigt und erfordert die Kenntnis über den intrazelluläre Membranen, die das Protein von Interesse besteht in .

Ein alternativer einfacherer Ansatz zur Bestimmung Membranprotein Topologie beschrieben worden ^12. Der Assay, Fluoreszenz-Protease Protection (FPP) erfordert die Erzeugung eines Fusionsproteins zwischen GFP und das Gen von Interesse. Der Ansatz basiert auf der relativen Zugänglichkeit unspezifische Proteasen zu dem GFP-Einheit basiert; je nachdem, ob GFP aus Proteolyse durch die sich in das Lumen des intrazellulären Organellen oder geschützt wird, um die Proteolyse durch wobei im Cytosol vorliegende ausgesetzt. Wenn somit das GFP Einheit an das Protein von Interesse steht das Zytoplasma, wird es zu belichtendenProtease-Aktivität und das Fluoreszenzsignal verloren. Umgekehrt, wenn das GFP-Einheit an das Protein von Interesse sieht eine Umgebung "geschützt" aus der Protease (wie die Golgi-Lumen) anschließend wird das Fluoreszenz-Signal bestehen.

Damit Proteasen in die Zelle eindringen, aber nicht in den intrazellulären Membran Abteile der Cholesterinbindungsarzneimittel Digitonin verwendet. Cholesterin ist der dominierende Sterol in Vertebraten, und ist speziell in der Plasmamembran relativ zu intrazellulären Kompartimenten angereichert. Die Glycosid-Toxin, Digitonin, wird aus der Anlage Digitalis purpurea extrahiert. Digitonin eine Affinität für Cholesterin reiche Membranen, wo sie führt zu einer selektiven Membran permeabiliztion ^14,16 (Figur 1). Zusätzlich dazu, dass die Ausfahrt der kleinen cytosolischen Komponenten ermöglicht Digitonin Permeabilisierung auch den Eintritt von exogenen Molekülen, wie Proteinase K oder Trypsin. Die FPP-Protokoll nutzt die fact, dass die Plasmamembran enthält bis zu 80% des zellulären Cholesterin ^17, wohingegen andere Zellorganellen, wie ER, Golgi, Endosomen, Mitochondrien, die einen sehr geringen Cholesteringehalt aufweisen, intakte ¹⁴ verbleiben. Die selektiven Einbau von Cholesterin in die Plasmamembran wurde in vielen eukaryotischen Zellen beobachtet worden, die die Verwendung von Digitonin-abhängigen Plasma Membranpermeabilisierung in so unterschiedlichen eukaryotischen Spezies wie S. cerevisiae die menschliche ^14,18. Die FPP-Assay bietet eine einfache, schnelle und ziemlich robust Mittel zur Bestimmung (a) ob ein Protein membrangebunden / verknüpften oder im Cytosol und (b) die Domäne eines Membranprotein frei diffusions Gesichter der Cytosol oder Organelle Lumen. Sollte ein Membranprotein mehrere Orientierungen, wird das Signal von der dominanten Form entstehen und kleinere Formen werden nicht erkannt. Zwar gibt es einige Bedenken, dass die Zugabe eines GFP-Einheit an das Protein an Interesse kann die Funktion beeinträchtigen und/ Oder subzelluläre Lokalisierung, das ist eigentlich mehr theoretisch als tatsächlich. Tatsächlich wurden viele Studien haben klar gezeigt, dass die GFP-Tag nicht die Eigenschaften des Proteins ^19,20 verändern.

Protocol

1. Erzeugung und Validierung von Fluorescent Protein Chimären Append grün fluoreszierende Protein (GFP) an die Amino- oder Carboxytermini des Proteins von Interesse unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien, 13. HINWEIS: Auch wenn wir GFP ausgiebig genutzt, andere Varianten wie zum Beispiel Cyan Fluorescent Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), DsRed und mCherry eingesetzt werden. Verbesserungen in der Fluorophor Faltungseffizienz, Helligkeit und Lichtstabili…

Representative Results

Plasma Membranpermeabilisierung Effiziente Plasma Membranpermeabilisierung wird durch die Verwendung von löslichen, fluoreszierenden Proteinen (zB GFP, DsRed) (Schritt 4) bestimmt. Diese Proteine, wenn sie in Zellen exprimiert wird, frei im Cytosol diffundieren und gehen verloren, wenn die Plasmamembran mit Digitonin (Abbildung 2) permeabilisiert. Ein vollständiges Verschwinden der Fluoreszenz-Signal sollte innerhalb von 10 bis 60 sec von Digitonin Anwend…

Discussion

Die richtige Orientierung und Topologie von Membranproteinen ist von wesentlicher Bedeutung für die ordnungsgemäße Funktion. Trotz der Bedeutung des Verständnisses Membranproteintopologie gibt viele Proteine, für die diese Daten vollständig fehlen. FPP bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit zur Bestimmung Membranproteintopologie und eine, die von den meisten Labors durchgeführt werden können. Die FPP-Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber den bisherigen Methoden zur Bestimmung von Protein-Topolog…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704