Introduction
Les membranes de plasma, ainsi que les nombreuses membranes intracellulaires, servent de barrières séparant deux compartiments aqueux. Dans le cas de la membrane plasmique, la séparation entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule; pour organites intracellulaires elle est comprise entre le cytoplasme et la lumière des organites. Par exemple, la membrane du réticulum endoplasmique (RE) sépare un environnement oxydant dans la lumière du RE à partir d'un environnement en réduisant une cytosolique. Les protéines membranaires sont synthétisées sur les ribosomes ER-associé, et d'atteindre leur topologie finale dans la membrane du RE 2. L'acquisition de l'orientation de la membrane appropriée et la topologie des protéines est critique pour leur fonction normale. Corriger la topologie permet les domaines pertinents de protéines membranaires d'interagir avec leurs partenaires de liaison, elle permet des modifications post-traductionnelles importantes se produisent, et dans le cas de protéines de la membrane plasmique, permet à la cellule d'interagir avec et de répondre to son environnement. Pour apprécier pleinement la fonction d'une protéine de membrane, il est impératif de connaître clairement comment cette protéine est orienté par rapport à la membrane à l'intérieur duquel il se trouve, ce est à dire, sa topologie de membrane. En plus de l'acquisition de connaissances scientifiques de base, la compréhension de la topologie d'une protéine de membrane et les aspects d'une surface de la protéine sont exposées à des environnements différents marqué a des implications cliniques depuis protéines membranaires constituent la majorité des trois cibles pharmacologiques. Jusqu'à récemment, les approches de la détermination de protéine membranaire topologie ont nécessité un investissement considérable en temps et de l'argent ou ont exigé des réactifs qui sont difficiles à trouver.
Les deux approches expérimentales et in silico ont été employées pour déterminer la topologie de membrane de protéines résidant dans la membrane plasmique. Depuis les premières prédictions de domaines membranaires se étendant sur la base de l'évaluation de l'hydrophobicité indiviacides aminés double 3, de nombreux algorithmes prédictifs sont maintenant disponibles sur l'Internet, et nécessitent tout simplement connaissance de la séquence d'acides aminés de la protéine. Cependant, les hypothèses sont souvent au cœur de ces programmes de modélisation, des hypothèses qui peuvent conduire à des affectations incorrectes de topologie 4,5. En outre, si ces prédictions informatiques peuvent affecter provisoirement régions couvrant la membrane, ils ne déterminent pas toujours si l'extrémité amino ou carboxy terminales de protéines sont dans le cytoplasme, des organites ou lumen extérieur de la cellule. Même avec une augmentation de puissance de calcul, et l'utilisation de l'apprentissage machine algorithmes 6, ces données est toujours un modèle, et doit être validée en utilisant des données expérimentales acquises. Détermination expérimentale directe de topologie de membrane a été réalisée en utilisant des panneaux d'anticorps monoclonaux avec des epitopes connus répartis dans la protéine, où l'évaluation de leur immunoréactivité a été effectuée avant et après perméabilisation de la cellule. Cetteapproche nécessite un ensemble d'anticorps, qui peuvent ne pas être disponibles pour la protéine d'intérêt.
Une autre stratégie consiste à concevoir des étiquettes d'épitopes tels que myc ou l'hémagglutinine (HA) dans divers endroits de la protéine, à nouveau suivi par la détermination de l'immunoréactivité avant et après perméabilisation de la membrane. En plus de balises immunogènes, étiquettes enzymatiques (y compris la phosphatase alcaline, β-galactosidase, β-lactamase ou) et des modifications chimiques telles que la numérisation de la cystéine ont tous été utilisée pour déterminer protéine membranaire topologie 7,8. Une autre méthode employée pour la cartographie topologique des protéines de la membrane plasmique se appuie sur une approche légèrement différente de marqueurs d'épitopes. Dans ce procédé, la séquence de marqueur est la séquence consensus de glycosylation N-lié NXS / T. Etant donné que la glycosylation ne se produit que lorsqu'une telle séquence est présente dans le lumen de la voie de biosynthèse, la présence de l'étiquette par rapport à un luminaleun compartiment cytosolique est facilement observable comme un changement de masse sur des gels de SDS-PAGE. Une telle approche a été appliquée sur le canal ionique CFTR multispanning 9. Bien que toutes ces approches ont été utilisées, il est clair que tous exigent des investissements considérables de la biologie moléculaire et la séquence pour générer les constructions multiples.
Pour déterminer les informations topologiques concernant protéines transmembranaires situés dans des organites intracellulaires se est avéré être plus difficile. L'application des technologies à base de fluorescence cependant, a fait la détermination de la topologie de la membrane beaucoup plus simple. La technique de fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC) repose sur l'interaction entre deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente, la restauration des propriétés fluorescentes de 10 cette protéine. Bien qu'initialement décrit pour la détermination des interactions protéine-protéine in vivo 10, cette approche a aussi été utiliséepour déterminer la topologie membranaire protéine dans les cellules végétales 11. Toutefois, cette approche est également fastidieux car il nécessite la génération non seulement des protéines de fusion avec la protéine d'intérêt, mais également une variété de protéines de fusion ciblées vers le cytosol ou organites lumière, et nécessite des connaissances dont intracellulaire membranes de la protéine d'intérêt de réside dans .
Une approche alternative plus simple à déterminer protéine membranaire topologie a été décrite 12. L'analyse, par fluorescence de la protection de la protéase (FPP) nécessite la génération d'une protéine de fusion entre la GFP et le gène d'intérêt. L'approche est basée sur l'accessibilité relative des proteases non spécifiques à la fraction de la GFP; selon que la GFP est protégé de la protéolyse par la lumière résidant dans des organites intracellulaires ou est exposé à la protéolyse en étant présente dans le cytosol. Ainsi, si le fragment GFP de la protéine d'intérêt est confronté le cytoplasme, il est exposé àactivité de la protease et le signal de fluorescence perdues. Inversement, si le fragment GFP de la protéine d'intérêt est confronté à un environnement «protégé» à partir de la protéase (tel que la lumière de l'appareil de Golgi), le signal de fluorescence persistera.
Pour permettre d'entrer les proteases de la cellule, mais pas entre les compartiments membranaires intracellulaires la liaison cholestérol digitonine médicament est utilisé. Le cholestérol est le sterol dominant chez les vertébrés, et est spécifiquement enrichi dans la membrane de plasma par rapport à compartiments intracellulaires. La toxine de glycoside, la digitonine, est extraite de la plante Digitalis purpurea. Digitonine a une affinité pour les membranes riches en cholestérol, où elle conduit à membrane sélective permeabiliztion 14,16 (figure 1). En plus de permettre la sortie des petits composants cytosoliques, la digitonine perméabilisation permet également l'entrée de molécules exogènes, tels que la protéinase K ou de la trypsine. Le protocole FPP profite de la fact que la membrane de plasma contient jusqu'à 80% de cholestérol cellulaire 17, tandis que d'autres organelles, comme ER, l'appareil de Golgi, endosomes, les mitochondries, qui ont une très faible teneur en cholestérol, 14 restent intacts. L'incorporation sélective de cholestérol dans la membrane plasmique a été observé dans de nombreuses cellules eucaryotes, ce qui permet l'utilisation de la digitonine dépendant membrane plasmique perméabilisation de ces espèces eucaryotes aussi divers que S. cerevisiae à 14,18 humain. Le dosage FPP fournit un moyen simple, rapide et assez robustes de déterminer (a) si une protéine est liée à la membrane / associé ou librement diffusable dans le cytosol et (b) quel domaine d'une protéine de la membrane fait face le cytosol ou organites lumière. Si une protéine membranaire avoir plusieurs orientations, le signal se posera de la forme dominante et formes mineures ne sera pas détecté. Bien qu'il puisse y avoir une certaine inquiétude que l'addition d'un fragment de la protéine GFP à l'intérêt peut affecter sa fonction et/ Ou la localisation subcellulaire, ce est en fait plus théorique que réelle. En effet de nombreuses études ont clairement montré que la balise de la GFP ne modifie pas les propriétés de la protéine 19,20.
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Protocol
1. Génération et validation des chimères de protéine fluorescente
- Ajouter protéine fluorescente verte (GFP) à l'extrémité amino ou carboxy-terminales de la protéine d'intérêt en utilisant des stratégies d'ADN recombinant 13.
REMARQUE: Bien que nous ayons utilisé GFP largement, d'autres variantes telles que la protéine fluorescente cyan (CFP), la protéine fluorescente jaune (YFP), DsRed et mCherry peuvent être utilisés. L'amélioration de l'efficacité fluorophore pliage, la luminosité et photostabilité sont constamment faits, et les enquêteurs devraient se prévaloir des dernières constructions de génération.- Confirmer la séquence d'ADN correcte et se assurer que le fragment GFP est dans le cadre avec la protéine d'intérêt. Effectuer séquençage utilisant des stratégies d'ADN recombinant 21.
NOTE: De nombreuses institutions ont des installations d'ADN base, qui l'enquêteur est encouragé à contacter pour des informations supplémentaires. - Pour les protéines membranaires de passe simples ou doubles, générerles deux versions du terminal amino et carboxyle des protéines de fusion 19.
- Pour les protéines transmembranaires multiples insérer à l'intérieur des boucles de la GFP extramembrane putatifs, ainsi que les extrémités. Prendre des précautions particulières lors de la génération des chimères transmembranaires avec la protéine de fusion fluorescente fixée à l'extrémité amino de la protéine cible comme des séquences de signaux sont souvent clivés par protéolyse de la protéine une fois que se est écoulé à travers la translocation du RE.
- Dans le cas de séquences de signaux existants, introduire la protéine de fusion fluorescente distale par rapport au site de clivage de façon à générer une protéine mature contenant une protéine fluorescente marqué amino-terminal intact. Employer des stratégies classiques d'ADN recombinant pour la production de chimères 21.
- Confirmer la séquence d'ADN correcte et se assurer que le fragment GFP est dans le cadre avec la protéine d'intérêt. Effectuer séquençage utilisant des stratégies d'ADN recombinant 21.
- Déterminer la présence d'un signal fluorescent localisé de manière appropriée suffisante dans la lignée cellulaire d'intérêt.
- Respecter les cellules sous microscopie à épifluorescence en utilisant la fluorescence intrinsèque de la GFP sous appromangé conditions de filtre défini. Pour les ensembles de filtres GFP englobant 510-560 nm, confirment que les filtres appropriés sont utilisés pour le fluorophore utilisé.
NOTE: Un signal suffisante est atteinte lorsque l'évaluation à l'oeil fournit un signal assez fort pour que la structure cellulaire dans laquelle le signal est facilement résolu réside dessus du fond. En outre, le motif de coloration de la protéine GFP doit être compatible avec celle des marqueurs pour l'organite approprié, et de préférence identique à celle de la protéine native non marqué.
- Respecter les cellules sous microscopie à épifluorescence en utilisant la fluorescence intrinsèque de la GFP sous appromangé conditions de filtre défini. Pour les ensembles de filtres GFP englobant 510-560 nm, confirment que les filtres appropriés sont utilisés pour le fluorophore utilisé.
- Déterminer si une approche de transfection stable ou transitoire sera utilisé basé sur la protéine en cours d'évaluation.
NOTE: transfectants stables permettent généralement à des niveaux inférieurs d'expression que les systèmes transitoires. Bien que l'expression transitoire donne une expression de haut niveau de protéines et d'intensité augmentation de signal (~ 5-24 heures après la transfection en fonction de la protéine), elle peut aussi conduire à des artefacts de surexpression de protéines telles que aggrdélé- ou la saturation des protéines ciblant voies, conduisant à la localisation subcellulaire erronée.
2. La transfection de cellules et culture cellulaire
NOTE: Une variété de cellules se prêtent à l'analyse FPP, y compris Hek293, HeLa, COS-7 et des cellules CHO 14. La description suivante est basée sur l'expression de protéines membranaires dans des cellules HEK293.
- Cultiver les cellules humaines embryonnaires de rein (HEK293) sous forme de monocouches adhérentes dans 6 ml de Eagles modifié de Dulbecco (DMEM), complété avec du sérum 5% de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium à 1%, et 250 pg / ml de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2. Effectuer tous les travaux avec des cellules dans une hotte à flux laminaire de culture de tissus. Cultiver des cellules dans un milieu de culture jusqu'à ~ 80% de confluence dans un flacon T-75.
- cellules Transfecter utilisant ne importe quel haut rendement standard, à faible méthode de transfection de toxicité, y compris en lipides, technologies viral- ou à base électroporation à générer transient ou une expression stable. Typiquement, 2 pg d'ADN plasmidique par 1 x 10 6 cellules donne une bonne expression de la protéine reproductible. Maintenir des cellules de 5 à 48 h dans un milieu de culture tissulaire approprié à 37 ° C dans un incubateur de culture capable de tissu CO 2.
- Surveiller les cellules pour l'expression de la protéine GFP-fusion en utilisant la microscopie à épifluorescence en utilisant le signal de fluorescence intrinsèque de la GFP, en utilisant les jeux de filtres appropriés selon le protocole du fabricant. Le signal de fluorescence atteint habituellement un maximum dans les 24 à 72 heures après transfection. Utilisation des cellules lorsque le signal de fluorescence atteint un niveau maximum. Surveiller les niveaux d'expression de protéines par analyse par immunotransfert en utilisant des anticorps dirigés contre soit la protéine d'intérêt ou du fragment GFP.
- Pour les cellules de la plaque d'analyse expérimentales sur des lamelles revêtues. Voir soit sous une configuration des cellules vivantes ou après fixation et monter sur des lames de microscopie. cellules de la plaque pour atteindre 60% -80% de confluence dans les 24-48 heures.
- Manteau de lamelles avec une solution de poly-lysine (0,1 mg / ml), de sorte que toute la surface soit couverte. Incuber pendant 30 min sous une lumière ultraviolette à la température ambiante, puis 60 min dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C. Retirer l'excès de poly-lysine et rincer les lamelles dans du PBS trois fois.
- Alternativement, la plaque les cellules sur un couvercle de verre chambré constituée de plaques de culture cellulaire avec un fond de verre optique pour permettre l'imagerie directe avec les objectifs huile immersion. La configuration réelle de microscopie dépend de l'équipement disponible à l'enquêteur, mais devrait être capable de changements rapides de solutions. Selon la forme de type de cellule et la cellule, les cellules devraient être d'environ 60 à 90% de confluence au moment de l'essai FPP.
3. Fluorescence Microscopy Setup
- Utiliser une ouverture numérique (NA) objectif de haut immersion dans l'huile pour la collecte de signal maximal et la résolution spatiale, comme une 60X, 1,42 NA objectif à immersion d'huile. Utilisez ee suivante lasers pour stimuler les fluorophores: argon 488 nm (GFP et YFP) et 561 diode (DP, mCherry).
- Déterminer l'exposition, le gain et la capture taux optimal d'images pour chaque construction. Ajustez l'intensité du laser et le temps d'exposition afin de minimiser photoblanchiment (voir l'étape 7.1.2).
- Pour les études utilisant de multiples fluorophores (par exemple, un marqueur soluble pour perméabilisation de la membrane de concert avec un marqueur de protéine de la membrane), choisir un filtre approprié fixe pour minimiser le signal de diaphonie et de maximiser le rapport signal-bruit.
4. Mise en place des conditions optimales pour la membrane plasmique perméabilisation
- Retirer le milieu de culture cellulaire à partir de cellules exprimant seulement des protéines fluorescentes solubles (par exemple EGFP, DsRed). Laver les cellules trois fois (une minute chacun) dans du tampon KHM (110 mM d'acétate de potassium, 3 mM de MgCl2, 20 mM de HEPES-NaOH, pH 7,2). Réaliser des expériences sur des cellules et tous les réactifs à la température ambiante.
- La place des cellules on lamelles (voir l'étape 2.4) dans un tampon KHM sur une scène de microscope à fluorescence et de recueillir la première image, qui représente la commande de l'étage «non-perméabilisées '.
- Pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmatique, ajouter la digitonine (30 uM) dans du tampon KHM aux cellules. Perfuser les cellules avec du tampon (tampon digitonine +) à un débit de 5 ml / min pendant 10 à 60 sec.
- Déterminer la concentration optimale de la digitonine en augmentant progressivement la concentration de la digitonine. La concentration digitonine optimale est atteinte quand il ya perte totale de signal de fluorescence de EGFP soluble dans les 10 à 60 secondes d'application digitonine. Pour de nombreuses cellules application de 10 à 50 uM digitonine est suffisante pour perméabiliser la membrane cellulaire.
- Pour toutes les applications utilisent la concentration la plus basse possible de digitonine. Recueillir images après digitonine perméabilisation pour perméabilisée signal de fond.
- Assurez-vous que la chimère GFP-protéine d'intérêt est membraneITéS en confirmant rétention cellulaire du signal de fluorescence suivant la digitonine perméabilisation de la membrane plasmique 16.
- Exprimez un organite spécifique protéine fluorescente 23. Protéines mitochondriales fonctionnent bien à cet égard 16, par exemple, pDsRed2-Mito vecteur. Déterminer les conditions optimales d'expression tel que décrit dans l'étape 2.1.
- Se assurer que la concentration de la digitonine est approprié pour le type de cellule employé en se assurant que la morphologie des organites intracellulaires et constants (jusqu'à 60 min) une exposition prolongée à la digitonine.
REMARQUE: utiliser des protocoles de microscopie d'immunofluorescence standard en utilisant des anticorps contre divers compartiments cellulaires, telles que les lysosomes (par exemple, LAMPE1), l'appareil de Golgi (par exemple, TGN38), réticulum endoplasmique (par exemple, la calnexine), endosomes (par exemple, Rab5), les mitochondries (par exemple, le cytochrome c). Si organite intracellulaire changements morphologie / intégrité considérablement over 60 min, il est probable que la concentration de la digitonine est trop élevé, et nécessite une réduction de la concentration de la digitonine et / ou le temps d'exposition.
REMARQUE: Digitonine est toxique par inhalation et par contact avec la peau. Porter un équipement de protection individuelle (EPI).
5. Traitement de la protéase protéines fluorescentes
- Laver les cellules dans un tampon KHM puis ajouter protéase (protéinase K; 50 pg / ml dans un tampon KHM) directement sur les cellules. Perfuser les cellules à un débit de 5 ml / min en utilisant un système de perfusion alimenté par gravité pour la préparation en continu bain de flux.
- Stocker les solutions à 50 ml seringues et des tuyaux en polyéthylène raccordés réservoirs indépendants à un collecteur avec une sortie unique, dans le bain (débit 5 ml / min). Positionner une pipette d'aspiration pour maintenir un (0,5 ml) Volume du bain constante et réaliser l'échange de solution par commutation manuelle entre les réservoirs de perfusion.
- Recueillir des images pour déterminer si le fluorsignal de Escent persiste ou se dégrade. Une perte de> 90% de l'intensité de signal initial sur 30 à 60 secondes est compatible avec la dégradation protéolytique de la protéine chimère-GFP (voir résultats représentatifs).
- Si aucune dégradation du signal est observé avec la protéinase K, lorsqu'une telle perte est prévu, remplacer la solution de protéinase K avec de la trypsine (4-8 mM) dans le tampon KHM. Si nécessaire, utiliser un mélange de trypsine et la proteinase K. Il ne est pas nécessaire pour éteindre l'activité de protease.
6. Approche alternative pour le plasma protéines membranaires avec des domaines externes
- Pour les protéines de la membrane plasmique, pour réaliser le dosage des protéines fluorescentes externes chimères avant la digitonine perméabilisation. Laver les cellules sur des lamelles dans du tampon KHM (5 ml / min x 3 min), et de prendre une image pour le traitement pré-protéase et quantifier signal de fluorescence pré-protéase comme à l'étape 7.
- Exposer les cellules de la protéase (protéinase K; 50 pg / ml ou trypsine 4-8 mM dans un tampon KHM) en til absence de digitonine par perfusion des cellules avec un milieu contenant KHM protéase (débit 5 ml / min). Recueillir des images de la protéine fluorescente, afin de déterminer comment rapidement le signal disparaît ou combien de temps le signal persiste.
- Avant de perméabilisation de la digitonine, étancher toute activité de protease, par lavage des cellules trois fois (une minute chacun) dans des milieux de culture cellulaire contenant 10% de sérum (FBS).
- Laver les cellules avec du tampon de perfusion KHM (taux de 5 ml / min) pendant 2 min. Acquérir une image pré-perméabilisation. Perméabiliser la membrane cellulaire comme décrit dans l'étape 4.
- Recueillir images suivantes plus protéase comme décrit à l'étape 5.
Analyse 7. Image
- Utilisation d'un microscope inversé capable de «cellules vivantes" enregistrement, dans lequel la perte du signal de fluorescence peut être surveillé en temps réel. Pour la surveillance continue, utiliser des paramètres identiques (temps d'exposition, le gain, l'intensité du laser, etc.).
- Déterminer experexpérimen- paramètres en observant le signal de fluorescence de la GFP-protéine d'intérêt dans des conditions témoins (à savoir, KBH tampon seul). Ajuster le gain, l'intensité du laser et des paramètres de temps d'exposition sur le microscope commandé par ordinateur pour se assurer qu'il n'y a pas de perte sensible de l'intensité du signal sur une période de 10-20 min.
REMARQUE: l'intensité du signal ne est pas une valeur absolue, mais est basé sur le système de microscope et les paramètres disponibles à chaque PI. Suivre l'évolution de l'intensité relative de fluorescence.
- Déterminer experexpérimen- paramètres en observant le signal de fluorescence de la GFP-protéine d'intérêt dans des conditions témoins (à savoir, KBH tampon seul). Ajuster le gain, l'intensité du laser et des paramètres de temps d'exposition sur le microscope commandé par ordinateur pour se assurer qu'il n'y a pas de perte sensible de l'intensité du signal sur une période de 10-20 min.
- Alternativement, traiter les cellules à un calendrier établi points dans digitonine suivie par une protéase, et fixer les cellules avant de monter sur des lamelles pour l'imagerie. Déterminer les points de temps empiriquement procédures dans les étapes 4 et 5. Pour l'enquête initiale après, commencent à 0, 30, 60, 120 et 300 secondes après addition de digitonine ou protéase.
- Fixer les cellules (20 min à température ambiante) en utilisant une quantité suffisante de fixateur (3,7% de paraformaldehyde dans du PBS) pour submerger complètement èmecellules de e.
- Quench paraformaldehyde résiduel par rinçage des cellules avec du PBS contenant de la glycine 20 mM (3 x 5 min).
- Monter lamelles en éliminant l'excès de liquide de la lamelle et l'inversion de la lamelle sur support de montage 50 pi sur un microscope de lames de verre pour l'imagerie. Laisser les lames sécher toute la nuit avant d'imagerie.
- Recueillir des images de microscopie par fluorescence (sous les filtres appropriés fixe compatible avec le fluorophore utilisé) en utilisant la fonction de capture d'image vidéo sur un ordinateur contrôlé microscope à fluorescence.
- Quantifier les intensités de signal fluorescent en fonction de la condition d'incubation. Obtenir l'intensité moyenne de pixels dans une région d'intérêt (ROI) qui entoure une cellule individuelle.
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Representative Results
Plasma Membrane perméabilisation
Efficient perméabilisation de la membrane plasmique est déterminée par l'utilisation de protéines fluorescentes solubles (par exemple, GFP, DsRed) (étape 4). Ces protéines, lorsqu'elle est exprimée dans des cellules, sont libres de diffuser dans le cytosol, et sont perdus lors de la membrane plasmique est perméabilisées à l'aide de la digitonine (figure 2). Une disparition complète du signal fluorescent doit avoir lieu dans 10 à 60 sec d'application digitonine. La confirmation que la protéine d'intérêt est associé à des organites intracellulaires est réalisée en notant le maintien de signal fluorescent suivant la perméabilisation de la digitonine.
Traitement protéase
Après le succès de la production de chimères fluorescentes entre la protéine d'intérêt et la protéine fluorescente (GFP, YFP, etc.) (étape 1) et l'expression de la protéine fluorescente dans les cellules (étape 2), le traitement les cellules perméabilisées avec de la protease fourniront des informations indiquant si le fluorophore (et son domaine de protéine adjacent) sont dans le cytosol et accessible à la digestion de protéase, ou sont situés dans une lumière d'organelles et donc protégés de la digestion protéasique (étape 4). LMTK2 est une membrane ancrée 15 kinase, et des essais de protection par fluorescence de la protéase ont été utilisées pour déterminer la topologie de membrane 16. La queue carboxyle de LMTK2 a été fusionnée à la GFP et a exprimé de manière transitoire. Fluorescent signaux LMTK2-GFP a été perdu rapidement après l'addition de la protéinase K, ce qui indique l'emplacement de l'extrémité carboxy-terminale de LMTK2 étant situé dans le cytosol (figure 3). La cavéoline-GFP (GFP-Cav1) 17 est une protéine de membrane de plasma avec un fragment GFP-jointe au domaine cytosolique. Comme LMTK2, le signal de la cavéoline-YFP est insensible digitonine, mais sensible à l'addition subséquente de protease (figure 3).
t "> protéines solubles dans l'Luminal peuvent également être identifiés en utilisant le protocole FPP. Dans cet exemple, l'ER signal de rétention KDEL est ajouté à la DsRed. A la différence des signaux provenant LMTK2 et la cavéoline, le signal provenant du KDEL-DsRed est insensible à la fois la digitonine et la protease, comme la digitonine est pas en mesure de perméabiliser la membrane du RE, et le signal fluorescent est protégé de la dégradation de la protéase. Un exemple d'un domaine membranaire située à l'intérieur du lumen d'un organite est donnée par la protéine mitochondriale est la sous-unité VIII de la cytochrome humain c-oxydase 18,19. pDsRed-Mit, code pour la protéine fluorescente rouge de Discosoma sp. fusionnée à la séquence d'adressage mitochondrial de la cytochrome c oxydase. Dans les cellules exprimant pDsRed-Mito, le signal fluorescent est vu dans la cellule. Suite à la perméabilisation de la digitonine, le signal fluorescent associé à pDSRed-Mito reste stable. En outre, après l'addition de la protéinase K, la fluorescence associée à pDsRed-Mito persiste, conpersistantes avec le fluorophore dans les mitochondries et non exposée au cytosol et donc protégé de l'activité de protease (figure 3).Extracellulaire Domaines
traitement à la protease des cellules non perméabilisées devrait rapidement éteindre le signal de fluorescence lorsque la fraction fluorescente attachée à une protéine de la membrane fait face à l'extérieur de la cellule. Le glycosylphosphatidylinositol (GPI) protéines PrP ancré 20 sert comme un excellent exemple. Une construction contenant la protéine fluorescente jaune (YFP) attaché à l'extrémité amino-terminale de la PrP (YFP-PrP) 21,22, un don généreux du Dr Ehud Cohen, de l'Université hébraïque de Jérusalem. Avant la protéase traitement, le signal fluorescent de la YFP extracellulaire était lumineuse (Figure 4). Après le traitement de la protéase, le signal de fluorescence extracellulaire a disparu rapidement.
Temps Considérations
Figure 1: perméabilisation sélective de la membrane plasmique (a) modèle de Dessin du dosage FPP montrant une seule cellule en passant par le protocole expérimental.. Le symbole rouge représente la protéine fluorescente rouge (RFP) dans le cytosol, les symboles verts et bleus représentent des protéines transmembranaires avec le marqueur fluorescent soit face à la lumière des organites (bleu) ou cytosol (vert). (B) Après perméabilisation digitonine, libre cytosoliqueprotéines diffuser à distance, réduisant le signal de demande de propositions. (C) Après l'application de la proteinase K, le signal vert cytosolique est dégradé, tandis que le signal bleu est protégé de la dégradation par sa présence dans la lumière des organites.
Figure 2: traitement Digitonine perméabilise la membrane plasmique et libère GFP cytosolique (a) Cartoon d'une seule cellule exprimant la GFP soluble, avant et après traitement digitonine.. (B) le traitement Digitonine perméabilise la membrane plasmique et libère GFP cytosolique. Une région d'intérêt (ROI) est tracé autour des cellules CHO exprimant la GFP soluble. Après traitement avec de la digitonine (50 uM), les images ont été prises avant et après l'addition de la digitonine, et aux points de temps indiqués. La barre d'échelle, 10 um. (C) La quantification de l'Fluoreintensités de Scence de la série chronologique complète (af) se affiche.
Figure 3: FPP révèle la topologie du LMTK2 protéine endosomale (a) Caricature du FPP montrant la perte de DsRed (des boules rouges), mais la rétention des LMTK2-GFP (Les boules vertes) après perméabilisation digitonine, suivie par la perte de signal sur l'application de la protéinase K. . (b) FPP dosage de cellules CHO exprimant DsRed et LMTK2-GFP. Les images ont été prises avant et après traitement la digitonine, et suite à la proteinase K, comme indiqué. Barre d'échelle: 10 um.
Figure 4: (a) modèle de bande dessinée montrant la topologie et l'emplacement de la YFP-PrP (vert) avant et après le traitement protéinase K. Cellules CHO exprimantYFP-PrP ont été soumis à la proteinase K pendant 100 secondes. (B) Les photos prises avant et après le traitement de la protéase sont présentés aux temps indiqués. Le signal PrP-YFP a été complètement perdue suivant la protease en l'absence de la digitonine. Jaune région des spectacles d'intérêt (ROI) utilisé pour la quantification représenté en (c).
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Discussion
L'orientation correcte et la topologie des protéines de la membrane sont essentielles pour leur bon fonctionnement. Malgré l'importance de comprendre protéine membranaire topologie, il ya beaucoup de protéines pour lesquelles ces données sont complètement défaut. FPP fournit un moyen facile et efficace de détermination de protéine membranaire topologie, et qui peut être effectuée par la plupart des laboratoires. L'approche FPP offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes précédentes pour déterminer la protéine topologie. Par exemple, il ne est pas nécessaire d'avoir un groupe de plusieurs anticorps dirigés encore divers domaines de la protéine 31 d'intérêt. Dans de nombreux cas, un tel panel d'anticorps ne est pas disponible; cela est particulièrement vrai pour les protéines nouvellement clonés. Comme le dosage peut être effectué au niveau d'une cellule unique, de grandes quantités de protéines biochimiques ne sont pas requis pour les analyses biochimiques en aval telles que la protéolyse ou SDS-PAGE. En effet, relativement peu de cellules transfectées sont nécessaires pour attribuer sans ambiguïtéune topologie de la protéine d'intérêt. Ceci est important si l'enquêteur évalue topologie dans des cellules difficiles à transfecter telles que des cellules épithéliales ou des neurones. La simple addition d'un fragment GFP soit le groupe carboxyle ou amino terminale de la protéine peut être facilement réalisé en utilisant de nombreux GFP disponible dans le commerce contenant des plasmides, et dans la plupart des cas, l'addition de la fraction de GFP ne gêne pas le pliage correct de la protéine ou de la localisation subcellulaire. Toutefois, l'enquêteur doit confirmer que cela est vrai pour leur protéine, car il ya le potentiel pour la GFP d'affecter la protéine d'intérêt 23,24. De nombreuses protéines sont déjà disponibles sous forme de protéines de fusion GFP, ce qui nécessite un effort supplémentaire minime à entreprendre des études topologiques. Bien que la surveillance continue de la fluorescence fournit un moyen rapide et efficace de déterminer la protéine topologie, pour les enquêteurs qui ne ont pas accès à des cellules vivantes équipement d'imagerie, l'analyse est facilement adapté à une application de formaldéhyde de fixationRoach utilisant épifluorescence niveau de la microscopie confocale.
Il ya cependant quelques limitations à l'applicabilité de l'essai FPP. Si le traitement protéolytique, ou d'autres modifications post-traductionnelles résultent légèrement différentes topologies de membrane pour la protéine d'intérêt, le dosage FPP ne évaluera que la forme de la protéine dominante. En outre, l'ajout d'un fragment de la GFP à des extrémités de certaines protéines peut affecter leur fonction, par exemple interférant avec carboxyle terminaux domaines PDZ. Néanmoins, le dosage FPP offre une approche simple pour établir l'orientation et de la topologie de nombreuses protéines membranaires.
Il est essentiel que les premières expériences être effectuées pour déterminer la concentration correcte de digitonine pour libérer GFP intracellulaire soluble. Si la GFP ne diffuse pas hors de la cellule après l'application de la digitonine, la concentration de la digitonine doit être augmentée progressivement, pour déterminer la concentration minimale rerequis pour faciliter la libération. Cependant, trop de digitonine affectera la morphologie des vésicules intracellulaires, dont l'intégrité doit être confirmée après l'application digitonine. Organites dans certaines cellules sont très sensibles et peuvent nécessiter une composition tampon plus de stabilisation 25. Si le signal de fluorescence à partir de la chimère en cours d'évaluation est faible, la sélection d'un clone unique avec un niveau d'expression plus élevé, ou d'effectuer une expression transitoire, va souvent augmenter la puissance du signal à un niveau acceptable. La recherche de plus récent, plasmides vives devraient également être considérés à faible intensité du signal. Enfin, il faut prendre soin de se assurer que la perte de signal connu est dû à la dégradation de la protéase et pas de photoblanchiment des fluorophores. Réduction de l'intensité de la lumière et / ou la vitesse d'acquisition aidera à réduire photoblanchiment.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
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