Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

Les membranes de plasma, ainsi que les nombreuses membranes intracellulaires, servent de barrières séparant deux compartiments aqueux. Dans le cas de la membrane plasmique, la séparation entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule; pour organites intracellulaires elle est comprise entre le cytoplasme et la lumière des organites. Par exemple, la membrane du réticulum endoplasmique (RE) sépare un environnement oxydant dans la lumière du RE à partir d'un environnement en réduisant ^une cytosolique. Les protéines membranaires sont synthétisées sur les ribosomes ER-associé, et d'atteindre leur topologie finale dans la membrane du RE ^2. L'acquisition de l'orientation de la membrane appropriée et la topologie des protéines est critique pour leur fonction normale. Corriger la topologie permet les domaines pertinents de protéines membranaires d'interagir avec leurs partenaires de liaison, elle permet des modifications post-traductionnelles importantes se produisent, et dans le cas de protéines de la membrane plasmique, permet à la cellule d'interagir avec et de répondre to son environnement. Pour apprécier pleinement la fonction d'une protéine de membrane, il est impératif de connaître clairement comment cette protéine est orienté par rapport à la membrane à l'intérieur duquel il se trouve, ce est à dire, sa topologie de membrane. En plus de l'acquisition de connaissances scientifiques de base, la compréhension de la topologie d'une protéine de membrane et les aspects d'une surface de la protéine sont exposées à des environnements différents marqué a des implications cliniques depuis protéines membranaires constituent la majorité des ^trois cibles pharmacologiques. Jusqu'à récemment, les approches de la détermination de protéine membranaire topologie ont nécessité un investissement considérable en temps et de l'argent ou ont exigé des réactifs qui sont difficiles à trouver.

Les deux approches expérimentales et in silico ont été employées pour déterminer la topologie de membrane de protéines résidant dans la membrane plasmique. Depuis les premières prédictions de domaines membranaires se étendant sur la base de l'évaluation de l'hydrophobicité indiviacides aminés double ^3, de nombreux algorithmes prédictifs sont maintenant disponibles sur l'Internet, et nécessitent tout simplement connaissance de la séquence d'acides aminés de la protéine. Cependant, les hypothèses sont souvent au cœur de ces programmes de modélisation, des hypothèses qui peuvent conduire à des affectations incorrectes de topologie ^4,5. En outre, si ces prédictions informatiques peuvent affecter provisoirement régions couvrant la membrane, ils ne déterminent pas toujours si l'extrémité amino ou carboxy terminales de protéines sont dans le cytoplasme, des organites ou lumen extérieur de la cellule. Même avec une augmentation de puissance de calcul, et l'utilisation de l'apprentissage machine algorithmes ^6, ces données est toujours un modèle, et doit être validée en utilisant des données expérimentales acquises. Détermination expérimentale directe de topologie de membrane a été réalisée en utilisant des panneaux d'anticorps monoclonaux avec des epitopes connus répartis dans la protéine, où l'évaluation de leur immunoréactivité a été effectuée avant et après perméabilisation de la cellule. Cetteapproche nécessite un ensemble d'anticorps, qui peuvent ne pas être disponibles pour la protéine d'intérêt.

Une autre stratégie consiste à concevoir des étiquettes d'épitopes tels que myc ou l'hémagglutinine (HA) dans divers endroits de la protéine, à nouveau suivi par la détermination de l'immunoréactivité avant et après perméabilisation de la membrane. En plus de balises immunogènes, étiquettes enzymatiques (y compris la phosphatase alcaline, β-galactosidase, β-lactamase ou) et des modifications chimiques telles que la numérisation de la cystéine ont tous été utilisée pour déterminer protéine membranaire topologie ^7,8. Une autre méthode employée pour la cartographie topologique des protéines de la membrane plasmique se appuie sur une approche légèrement différente de marqueurs d'épitopes. Dans ce procédé, la séquence de marqueur est la séquence consensus de glycosylation N-lié NXS / T. Etant donné que la glycosylation ne se produit que lorsqu'une telle séquence est présente dans le lumen de la voie de biosynthèse, la présence de l'étiquette par rapport à un luminaleun compartiment cytosolique est facilement observable comme un changement de masse sur des gels de SDS-PAGE. Une telle approche a été appliquée sur le canal ionique CFTR multispanning ^9. Bien que toutes ces approches ont été utilisées, il est clair que tous exigent des investissements considérables de la biologie moléculaire et la séquence pour générer les constructions multiples.

Pour déterminer les informations topologiques concernant protéines transmembranaires situés dans des organites intracellulaires se est avéré être plus difficile. L'application des technologies à base de fluorescence cependant, a fait la détermination de la topologie de la membrane beaucoup plus simple. La technique de fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC) repose sur l'interaction entre deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente, la restauration des propriétés fluorescentes de ¹⁰ cette protéine. Bien qu'initialement décrit pour la détermination des interactions protéine-protéine in vivo ^10, cette approche a aussi été utiliséepour déterminer la topologie membranaire protéine dans les cellules végétales ^11. Toutefois, cette approche est également fastidieux car il nécessite la génération non seulement des protéines de fusion avec la protéine d'intérêt, mais également une variété de protéines de fusion ciblées vers le cytosol ou organites lumière, et nécessite des connaissances dont intracellulaire membranes de la protéine d'intérêt de réside dans .

Une approche alternative plus simple à déterminer protéine membranaire topologie a été décrite ^12. L'analyse, par fluorescence de la protection de la protéase (FPP) nécessite la génération d'une protéine de fusion entre la GFP et le gène d'intérêt. L'approche est basée sur l'accessibilité relative des proteases non spécifiques à la fraction de la GFP; selon que la GFP est protégé de la protéolyse par la lumière résidant dans des organites intracellulaires ou est exposé à la protéolyse en étant présente dans le cytosol. Ainsi, si le fragment GFP de la protéine d'intérêt est confronté le cytoplasme, il est exposé àactivité de la protease et le signal de fluorescence perdues. Inversement, si le fragment GFP de la protéine d'intérêt est confronté à un environnement «protégé» à partir de la protéase (tel que la lumière de l'appareil de Golgi), le signal de fluorescence persistera.

Pour permettre d'entrer les proteases de la cellule, mais pas entre les compartiments membranaires intracellulaires la liaison cholestérol digitonine médicament est utilisé. Le cholestérol est le sterol dominant chez les vertébrés, et est spécifiquement enrichi dans la membrane de plasma par rapport à compartiments intracellulaires. La toxine de glycoside, la digitonine, est extraite de la plante Digitalis purpurea. Digitonine a une affinité pour les membranes riches en cholestérol, où elle conduit à membrane sélective permeabiliztion ^14,16 (figure 1). En plus de permettre la sortie des petits composants cytosoliques, la digitonine perméabilisation permet également l'entrée de molécules exogènes, tels que la protéinase K ou de la trypsine. Le protocole FPP profite de la fact que la membrane de plasma contient jusqu'à 80% de cholestérol cellulaire ^17, tandis que d'autres organelles, comme ER, l'appareil de Golgi, endosomes, les mitochondries, qui ont une très faible teneur en cholestérol, ¹⁴ restent intacts. L'incorporation sélective de cholestérol dans la membrane plasmique a été observé dans de nombreuses cellules eucaryotes, ce qui permet l'utilisation de la digitonine dépendant membrane plasmique perméabilisation de ces espèces eucaryotes aussi divers que S. cerevisiae à ^14,18 humain. Le dosage FPP fournit un moyen simple, rapide et assez robustes de déterminer (a) si une protéine est liée à la membrane / associé ou librement diffusable dans le cytosol et (b) quel domaine d'une protéine de la membrane fait face le cytosol ou organites lumière. Si une protéine membranaire avoir plusieurs orientations, le signal se posera de la forme dominante et formes mineures ne sera pas détecté. Bien qu'il puisse y avoir une certaine inquiétude que l'addition d'un fragment de la protéine GFP à l'intérêt peut affecter sa fonction et/ Ou la localisation subcellulaire, ce est en fait plus théorique que réelle. En effet de nombreuses études ont clairement montré que la balise de la GFP ne modifie pas les propriétés de la protéine ^19,20.

Protocol

1. Génération et validation des chimères de protéine fluorescente Ajouter protéine fluorescente verte (GFP) à l'extrémité amino ou carboxy-terminales de la protéine d'intérêt en utilisant des stratégies d'ADN recombinant 13. REMARQUE: Bien que nous ayons utilisé GFP largement, d'autres variantes telles que la protéine fluorescente cyan (CFP), la protéine fluorescente jaune (YFP), DsRed et mCherry peuvent être utilisés. L'amélioration de l'efficacité…

Representative Results

Plasma Membrane perméabilisation Efficient perméabilisation de la membrane plasmique est déterminée par l'utilisation de protéines fluorescentes solubles (par exemple, GFP, DsRed) (étape 4). Ces protéines, lorsqu'elle est exprimée dans des cellules, sont libres de diffuser dans le cytosol, et sont perdus lors de la membrane plasmique est perméabilisées à l'aide de la digitonine (figure 2). Une disparition complète du signal fluoresce…

Discussion

L'orientation correcte et la topologie des protéines de la membrane sont essentielles pour leur bon fonctionnement. Malgré l'importance de comprendre protéine membranaire topologie, il ya beaucoup de protéines pour lesquelles ces données sont complètement défaut. FPP fournit un moyen facile et efficace de détermination de protéine membranaire topologie, et qui peut être effectuée par la plupart des laboratoires. L'approche FPP offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes précédent…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704