Introduction
质膜，以及众多的细胞内膜，作为分离两个隔室的含水的障碍。在质膜的情况下，该分离是外部之间和小区内;对于细胞内细胞器是细胞质和细胞器内腔之间。例如，内质网（ER）膜分离的ER从胞质还原环境1管腔内氧化环境。膜蛋白合成的雌激素受体 相关的核糖体，并实现其内质网膜2内做出最终的拓扑结构。收购合适的膜方向和拓扑的蛋白质是其正常功能的关键。正确拓扑允许膜蛋白有关的结构域与其结合配偶相互作用，它允许发生临界翻译后修饰，并在质膜蛋白质的情况下，允许细胞进行交互和响应吨o它的环境。充分理解的膜蛋白的功能，它显然是必须知道这样的蛋白质被定向相对于在其中驻留的膜， 也就是说 ，它的膜拓扑结构。除了 获得的基础科学知识，理解的膜蛋白和其中蛋白质表面的各方面暴露于不同环境的拓扑已标记的临床意义，因为膜蛋白包含多数药理靶3。直到最近，接近已确定需要时间和金钱的大量投资或已经所需的试剂，是很难得的膜蛋白的拓扑结构。
既，在硅片的实验和方法已被用于确定驻留在质膜内蛋白的膜拓扑结构。因为基于INDIVI的评价疏水性跨膜结构域的第一个预测双氨基酸3，众多的预测算法，现已在互联网上，而只要求蛋白质的氨基酸序列的知识。然而，假设常常是中央到这样的建模程序，假设，可导致拓扑4,5的不正确的分配。此外，虽然这些基于计算机的预测可以试探性地指派跨膜区域，它们不总是确定的氨基或蛋白质的羧基末端是否在细胞质中，细胞器腔或细胞外。即使具有增加的计算能力，以及利用机器学习算法6中，这样的数据仍然是一个模型，并且必须用实验获得的数据进行验证。直接的实验测定膜拓扑结构采用了与整个蛋白质，其中已经取得了他们的免疫反应的评估之前和细胞通透性后散发称为抗原决定簇的单克隆抗体的面板已经开展。此方法要求一组抗体，其可能不提供对感兴趣的蛋白质。
另一种策略是工程表位的标记，如myc基因或血凝素（HA）到各个位置的蛋白质，再其次是确定免疫前和膜通透性后。除了 免疫标记，酶促标记（包括碱性磷酸酶，β半乳糖苷酶，或β内酰胺酶）和化学修饰，如半胱氨酸扫描都被用来确定膜蛋白拓扑7,8。用于质膜蛋白的拓扑映射的附加方法依赖于一个稍微不同的方式来表位标签。在该方法的标签序列是N联糖基化的共有序列NXS / T。由于糖基化作用，只有当这样的序列是存在于所述生物合成途径中，标签在一管腔相对于存在的内腔发生一个胞质区室是很容易观察到在SDS-PAGE凝胶质量偏移。这样的方法已被应用到multispanning离子通道CFTR 9。虽然所有这些方法都在使用，但很明显，它们都需要在分子生物学相当大的投资，以产生和测序所述歧管结构。
以确定关于位于细胞内细胞器内的跨膜蛋白拓扑信息已被证明是更具挑战性。基于荧光技术的应用然而，已经取得了膜拓扑简单了很多的决心。的双分子荧光互补（附设）的技术依赖于一种荧光蛋白的两个非荧光片段之间的相互作用，恢复该蛋白10的荧光性质。虽然用于确定在体内 10的蛋白质-蛋白质相互作用的最初描述，这种方法也被用于以确定膜蛋白拓扑在植物细胞11。然而，该方法也耗费时间，因为它需要的产生不仅融合蛋白与感兴趣的蛋白质，但也有多种靶向胞质溶胶或细胞器管腔融合蛋白的，并且需要知道哪些细胞内膜蛋白的兴趣在于。
另一种更简单的方法来判断膜蛋白的拓扑结构已被描述12。在测定中，荧光蛋白酶保护（FPP）要求GFP和目的基因之间的融合蛋白的产生。该方法是基于非特异性蛋白酶的GFP部分的相对无障碍;根据是否GFP是由驻留在细胞内的细胞器的管腔免受蛋白水解或通过存在于胞质溶胶暴露于蛋白水解。因此，如果在感兴趣的蛋白质的GFP部分朝向细胞质中，它会被暴露于蛋白酶活性和荧光信号丢失。相反，如果在感兴趣的蛋白质的GFP部分面临来自蛋白酶的环境“保护的”（如高尔基管腔），则荧光信号将持续存在。
以允许蛋白酶进入细胞，但不进入细胞内的膜隔室的胆固醇结合药毛地黄皂苷被使用。胆固醇是在脊椎动物中主要的甾醇，并在质膜相对于细胞内区室是特别丰富。糖苷毒素，毛地黄皂苷，是从植物洋地黄萃取。毛地黄皂苷具有丰富胆固醇的膜具有亲和性，在那里它会导致选择性隔膜permeabiliztion 14,16（ 图1）。除了允许小胞质成分出口，毛地黄皂苷透化还允许外源性分子，例如蛋白酶K或胰蛋白酶的条目。在FPP协议取FAC优势吨的质膜含有高达80％的细胞内胆固醇17的，而其它的细胞器，如ER，高尔基体，内体，线粒体，它们具有非常低的胆固醇含量，保持完整14。胆甾醇的选择性掺入质膜在许多真核细胞中被观察到，允许使用毛地黄皂苷依赖性质膜透化等不同的真核物种如S.酵母对人体14,18。对FPP分析提供了确定（a）一种蛋白质是否是膜结合的/关联的或在胞质溶胶和（b），该膜蛋白的结构域自由扩散朝向胞质溶胶或细胞器内腔的一个简单，快速，相当坚固的装置。应的膜蛋白有多个方向，信号将产生于主要形式和次要形式将不会被检测到。而可以有一些担心，另外一个GFP的部分与上感兴趣的蛋白的可能影响其功能和/或亚细胞定位，这实际上比实际更多的理论。实际上，许多研究已经清楚地表明，将GFP标记不改变蛋白质19,20的属性。
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Protocol
1.代荧光蛋白嵌合体和验证
- 附加绿色荧光蛋白（GFP）与感兴趣使用标准的重组DNA策略13中的蛋白质的氨基或羧基末端。
注意：虽然我们已经使用GFP的广泛应用，其他变型如青色荧光蛋白（CFP），黄色荧光蛋白（YFP），红色荧光蛋白和mCherry可以使用。正在不断取得荧光折叠效率，亮度和光稳定性的改进，和调查应利用最新一代的结构本身。- 确认正确的DNA序列，并确保将GFP部分是在框架与感兴趣的蛋白质。使用标准的重组DNA策略21进行测序。
注：很多机构都核心DNA设施，研究者鼓励联系以获取更多信息。 - 对于单程或双程膜蛋白，产生两个氨基和羧基末端的版本融合蛋白19的。
- 对于多生成树蛋白插入推定膜外循环内的GFP，以及末端。产生跨膜嵌合体与附着于靶蛋白的氨基末端的荧光融合蛋白时作为信号序列被蛋白水解裂解通常一旦该蛋白已经通过对ER位子传递特别小心。
- 在现存的信号序列的情况下，插入荧光融合蛋白远端切割位点，以便产生含有完整的氨基末端标记的荧光蛋白的成熟蛋白质。使用用于嵌合体21的生成标准的重组DNA的策略。
- 确认正确的DNA序列，并确保将GFP部分是在框架与感兴趣的蛋白质。使用标准的重组DNA策略21进行测序。
- 确定足以适当地本地化的荧光信号在感兴趣的细胞系的存在。
- 使用下appropri GFP的固有荧光观察下荧光显微镜的细胞吃了过滤器设置的条件。对于包括510-560纳米的GFP过滤器设置，确认正确的过滤器用于采用的荧光。
注：足够的信号达到评估时，用肉眼提供了足够强的信号，该信号驻留在其中的细胞结构很容易上述背景下解决。此外，绿色荧光蛋白的染色模式应该是与该标记相应的细胞器的一致，并优选相同的，天然的未标记的蛋白质。
- 使用下appropri GFP的固有荧光观察下荧光显微镜的细胞吃了过滤器设置的条件。对于包括510-560纳米的GFP过滤器设置，确认正确的过滤器用于采用的荧光。
- 确定是否基于所述蛋白被评估稳定或瞬时转染的方法将被使用。
注：稳定转染通常得到的表达水平低于瞬时系统。虽然瞬时表达产生的蛋白和增加信号强度（〜5-24小时转染后视蛋白）的高水平表达，这也可导致过度的工件，如蛋白质AGGRegation或蛋白靶向通路的饱和，从而导致错误的亚细胞定位。
2.转染细胞和细胞培养的
注：多种细胞是适合于FPP分析，包括HEK293，HeLa细胞，COS-7和CHO细胞14。下面的描述是基于表达膜蛋白在HEK293细胞。
- 生长的人胚胎肾细胞（的Hek293）以贴壁单层在6ml的Dulbecco氏改良的Eagles培养基（DMEM）中，在37℃补充有5％胎牛血清（FBS），1％丙酮酸钠，和250微克/毫升青霉素/链霉素下用5％的CO 2。执行在层流组织培养罩的所有工作用的细胞。生长的细胞在培养基中直到〜的T-75烧瓶中80％汇合。
- 使用任何标准的高效率，低毒性的转染方法，包括脂质，viral-或电为基础的技术，以产生transien转染细胞吨或稳定表达。通常为2微克每1×10 6个细胞的质粒DNA给出了良好的重现性蛋白表达。保持在CO 2能够组织培养箱细胞为5-48小时在适当的组织培养基中，在37℃。
- 监测细胞使用荧光显微镜的GFP融合蛋白的表达，采用的GFP的固有荧光信号，根据制造商的协议使用适当的过滤器集。荧光信号通常达到内24-72小时转染后一最大值。使用的细胞时，荧光信号达到最大电平。监测蛋白表达的免疫印迹分析使用针对感兴趣的任一蛋白或GFP的部分的抗体的水平。
- 实验分析板细胞上涂盖玻片。查看或者下一个活细胞配置或以下的固定和安装在显微镜幻灯片。板的细胞来实现在24-48小时的60％-80％汇合。
- 外套盖玻片用聚赖氨酸溶液（0.1毫克/毫升），这样整个表面被覆盖。孵育下紫外光在室温搅拌30分钟，随后在细胞培养孵化器60分钟，在37℃。去除多余的多聚赖氨酸和冲洗的PBS 3倍的盖玻片。
- 替代地，盘上的腔盖玻璃组成的细胞培养板用光学玻璃底的细胞，以允许直接成像油浸目标。在实际的显微镜设置取决于可用的研究者在设备上，但应能迅速解决的变化。根据细胞类型和细胞形状，细胞应为约60-90％汇合的FPP分析的时间。
3.荧光显微镜安装
- 使用的最大信号采集和空间分辨率，如60X，1.42 NA油浸物镜高数值孔径（NA）油浸物镜。使用日Ë以下激光器激发荧光团：氩气488纳米（GFP和YFP）和561二极管（RFP，mCherry）。
- 确定图像的每个结构的最佳曝光，增益和捕获率。调节激光的强度和照射时间，以减少光漂白（见步骤7.1.2）。
- 用于使用多个荧光团（ 例如 ，可溶性标记在音乐会的膜蛋白标志物膜通透性），选择适当的过滤器的研究设置以最小化信号的串扰和提高信号噪声比。
4.建立最佳条件等离子膜通透性
- 除去从细胞中只表达可溶性的荧光蛋白质的细胞培养基（ 例如绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白）。在KHM缓冲洗细胞3次（每次1分钟）（110毫醋酸钾，3mM的MgCl 2的，20毫米的HEPES-氢氧化钠，pH为7.2）。在室温下执行与细胞的实验和所有试剂。
- 地方细胞ØÑ盖玻片（参见步骤2.4）上的荧光显微镜阶段KHM缓冲器，并收集第一图像，其表示该控制“非透化”阶段。
- 以选择性地透质膜，在KHM缓冲器添加毛地黄皂苷（30μM）细胞中。灌注细胞用缓冲液（缓冲液+毛地黄皂苷）中/速率为5毫升分钟为10-60秒。
- 通过逐渐增加毛地黄皂苷的浓度确定最佳的毛地黄皂苷浓度。当有荧光信号的内10-60秒毛地黄皂苷申请完全丧失从可溶性EGFP最优毛地黄皂苷浓度达到。对于许多细胞应用的10-50微米毛地黄皂苷是足够通透的细胞膜。
- 对于所有的应用程序都使用毛地黄皂苷的尽可能低的浓度。毛地黄皂苷透了透化背景信号后，采集图像。
- 确认感兴趣的GFP蛋白嵌合体是膜在通过确认蜂窝荧光信号的保留以下质膜16的毛地黄皂苷透化tegrated。
- 表达一个特定的细胞器荧光蛋白23。线粒体蛋白质在这方面16， 例如 ，pDsRed2-三刀载体很好地工作。决定按照步骤2.1中所述的最佳表达条件。
- 确认毛地黄皂苷浓度是适合于通过确保所使用的细胞类型的细胞内细胞器的形态保持不变通过长时间（最多60分钟）暴露于毛地黄皂苷。
注意：使用抗体对各种细胞区室用标准免疫荧光显微镜的协议，如溶酶体（ 例如 ，LAMP1），高尔基（ 例如 ，TGN38），内质网（ 例如 ，钙联接蛋白），内体（ 例如 ，Rab5的），线粒体（ 例如 ，细胞色素C）。如果细胞内的细胞器形态/完整性急剧变化奥雅纳R 60分钟，它是可能的毛地黄皂苷浓度过高，并且需要在毛地黄皂苷浓度和/或曝光时间的减少。
注：毛地黄皂苷是吸入和皮肤接触有毒。穿戴合适的个人防护装备（PPE）。
荧光蛋白5.蛋白酶处理
- 洗细胞中KHM缓冲，然后添加蛋白酶（蛋白酶K;在KHM缓冲器50微克/毫升）直接到细胞上。灌注细胞以5ml使用重力给料的灌注系统连续浴中的制剂/分钟的流速。
- 在50毫升的注射器商店的解决方案和聚乙烯管连接独立储到歧管与在浴（5毫升/分钟流速）的单一出口。定位的吸入吸管以保持恒定的（0.5毫升）浴体积和通过灌注容器之间手动切换实现溶液交换。
- 收集图像，以确定是否所述氟escent信号持续或降级。 > 90％，比30-60秒的初始信号强度的损失是与GFP蛋白嵌合体的蛋白水解降解相一致（见代表结果）。
- 如果没有信号衰减是用蛋白酶K观察到的，当预计这种损失，取代蛋白酶K溶液用胰蛋白酶（4-8毫米）中KHM缓冲器。如果需要的话，利用蛋白酶K和胰蛋白酶的混合物。没有必要以淬灭蛋白酶活性。
对于质膜蛋白质与外部域6.替代方法
- 对于等离子的膜蛋白，进行检测的，以洋地黄通透前外部荧光蛋白嵌合体。洗在KHM缓冲器盖玻片的细胞（5毫升/分钟×3分钟），并采取预蛋白酶处理的图像和量化的预蛋白酶荧光信号，如步骤7。
- 细胞暴露于蛋白酶（蛋白酶K; 50微克/毫升胰蛋白酶或4-8毫米KHM缓冲液中）在叔他通过灌注细胞KHM含蛋白酶的媒体（流速5毫升/分钟）没有毛地黄皂苷的。收集荧光蛋白的图像，以确定如何快速的信号消失要不了多久，信号仍然存在。
- 毛地黄皂苷透化前，淬火所有蛋白酶活性通过在含有10％血清（FBS）的细胞培养基洗涤细胞三次（每次1分钟）。
- 通过用KHM缓冲液（5毫升/分钟流速）进行2分钟灌注洗细胞。获得的预通透图像。透化细胞膜如步骤4中所述。
- 如在步骤5中所述收集下列蛋白酶加成图像。
7.图像分析
- 使用倒置显微镜能够“活细胞”的记录，其中，荧光信号的损耗可以实时监测。连续监测，采用相同的参数（曝光时间，增益，激光强度等 ）。
- 确定EXPERimental参数，通过观察从控制条件（ 即 KBH单独的缓冲液）下感兴趣的GFP蛋白的荧光信号。调整在计算机驱动的显微镜的增益，激光强度和曝光时间设置，以确保有信号强度没有明显的损失超过10-20分钟的时间。
注意：信号强度不是一个绝对值，而是基于显微镜系统和设置可用于每个PI上。监测变化在相对荧光强度。
- 确定EXPERimental参数，通过观察从控制条件（ 即 KBH单独的缓冲液）下感兴趣的GFP蛋白的荧光信号。调整在计算机驱动的显微镜的增益，激光强度和曝光时间设置，以确保有信号强度没有明显的损失超过10-20分钟的时间。
- 此外，治疗的细胞在设定的时间点洋地黄其次是蛋白酶，并修复细胞安装在盖玻片成像之前。确定时间点凭经验按照步骤4和5。初步调查程序，从0开始，30，60，120和300秒后添加洋地黄或蛋白酶。
- 固定用的固定剂的足量（在PBS中3.7％的多聚甲醛），以充分淹没的Th细胞（20分钟室温）E细胞。
- 通过用含有20mM甘氨酸（3×5分钟）的PBS漂洗细胞淬灭残余的多聚甲醛。
- 摩盖玻片通过从盖玻片除去多余的液体和反相盖玻片上50微升安装媒体上的玻璃显微镜载玻片进行成像。允许幻灯片前成像隔夜干燥。
- 收集荧光显微镜图像（根据适当的过滤器设置与所使用的荧光团兼容）通过使用计算机控制的荧光显微镜视频图像捕捉功能。
- 定量荧光信号强度，作为孵化条件的功能。获得的感兴趣区域（ROI）的区域内包围单个小区中的平均像素强度。
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Representative Results
等离子膜通透性
高效质膜透化是通过使用可溶的荧光蛋白质（ 例如 ，绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白）（步骤4）的测定。这些蛋白质，当在细胞中表达，可自由在细胞质中扩散，并且当质膜用毛地黄皂苷（ 图2）被透化都将丢失。荧光信号的完全消失，应该发生在10〜60秒毛地黄皂苷应用。所感兴趣的蛋白与细胞内细胞器相关联的确认是通过注意荧光信号下列毛地黄皂苷透化的保留来实现的。
蛋白酶处理
以下的细胞中成功地生成感兴趣的荧光蛋白的蛋白和荧光蛋白（GFP，YFP， 等 ）（步骤1），并表达与荧光嵌合体（第2步），处理的渗透细胞用蛋白酶将提供对荧光团（以及与其相邻的蛋白结构域）是否是在细胞质和访问蛋白酶消化，或者位于细胞器管腔内，从而保护免于蛋白酶消化（步骤4）的信息。 LMTK2是膜锚定激酶15，和荧光蛋白酶保护测定法已被用于确定其膜拓扑结构16。 LMTK2的羧基尾融合到GFP和瞬时表达。荧光LMTK2-GFP信号丢失迅速以下加入蛋白酶K，指示LMTK2位于胞质溶胶中（ 图3）内的羧基末端的位置。小窝蛋白GFP（CAV1-GFP）17是质膜蛋白质与GFP的部分附着到胞质域。正如LMTK2，从小窝蛋白YFP信号毛地黄皂苷不敏感，但对随后加入蛋白酶敏感（ 图3）。
吨“>管腔可溶性蛋白也可通过FPP协议确定的。在这个例子中，内质网滞留信号KDEL追加到DsRed的。与此相反，从LMTK2和小窝的信号，从KDEL-DsRed的信号不敏感，这两个毛地黄皂苷和蛋白酶，如毛地黄皂苷无法透ER膜，并且荧光信号被保护免受蛋白酶的降解。位于由线粒体蛋白定细胞器的内腔内的膜结构域的一个例子是人细胞色素C氧化酶的亚基VIII族18,19。pDsRed-MIT，编码红色荧光蛋白从香菇属融合到靶向从细胞色素C氧化酶的序列的线粒体在细胞表达pDsRed-三刀，荧光信号是出现在细胞继毛地黄皂苷透化，所述荧光信号与pDSRed-美图相关保持稳定。此外，以下除蛋白酶K，与相关的荧光pDsRed-美图仍然存在，骗子sistent与在线粒体的荧光团和不暴露于胞质溶胶，从而从蛋白酶活性受保护的（ 图3）。外域
非透化的细胞的蛋白酶处理应迅速淬火时附着于膜蛋白的荧光部分所面对的细胞外荧光信号。在糖基（GPI）锚定蛋白朊蛋白20可作为一个很好的例子。一份载有黄色荧光蛋白结构（YFP）连接到朊蛋白（YFP-PRP）21,22，从埃胡德·科恩博士慷慨馈赠的氨基端，从耶路撒冷的希伯来大学。之前蛋白酶处理，从细胞外的YFP的荧光信号是亮（ 图4）。下列蛋白酶处理，细胞外荧光信号消失较快。
时的注意事项
图1：质膜的选择性透 （ 一 ）卡通对FPP分析示出单个细胞经过实验方案的模型。红色符号表示在细胞质的红色荧光蛋白（RFP），绿色和蓝色的符号代表跨膜蛋白与荧光标记或者面向细胞器管腔（蓝色）或胞质溶胶（绿色）。 （b）根据毛地黄皂苷通透，无胞浆蛋白质弥漫开去，减少RFP信号。 （c）在应用的蛋白酶K，胞质绿色信号被降级，而蓝色信号是由它在细胞器管腔存在保护免受降解。
图2：毛地黄皂苷处理permeabilizes质膜并释放胞质GFP单细胞（ 一 ）卡通表达可溶性GFP，前和毛地黄皂苷处理后。 （二）毛地黄皂苷处理permeabilizes质膜并释放胞质的GFP。感兴趣区域（ROI）的区域周围绘制CHO细胞表达的可溶性GFP。以下用毛地黄皂苷（50μM）处理，图像之前和加入毛地黄皂苷的后，并在指定的时间点取。比例尺，10微米。 （c）该荧光的量化显示完整的时间序列（AF）的强度李宗。
图3：FPP揭示了胞内蛋白LMTK2的拓扑结构 （ 一 ）FPP显示丢失红色荧光蛋白的（红球），但保留LMTK2-GFP（绿球）的卡通以下毛地黄皂苷通透，其次是信号损失的应用蛋白酶K。 （二）CHO细胞表达红色荧光蛋白和LMTK2-GFP的FPP法。前和毛地黄皂苷处理，以下蛋白酶K，所指示的后拍摄图像。比例尺：10μm以下。
图4：（A）卡通模型表示前后蛋白酶K处理的YFP-朊病毒（绿色）的拓扑结构和位置。 CHO细胞表达YFP-的PrP经受蛋白酶K为100秒。 （二）前拍摄的图像和蛋白酶处理后显示在所指示的时间。下面蛋白酶在没有毛地黄皂苷的YFP-PrP的信号完全消失。感兴趣区域（ROI）用于（c）所示定量黄色显示的区域。
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Discussion
膜蛋白的正确方向和拓扑是为他们的正常功能是必不可少的。尽管认识膜蛋白拓扑的重要性，有许多蛋白质的量这样的数据被完全缺乏。 FPP的提供确定膜蛋白拓扑的一个简单而有效的方式，并且是可以由大多数实验室中进行。在FPP方法比以前的方法测定蛋白质拓扑能提供显著优势。例如，没有必要有定向感兴趣31的蛋白质的再次各种域上的多个抗体的面板。在许多情况下，抗体的这种面板不可用;这是新克隆的蛋白，尤其如此。作为该测定可以在单个细胞水平上进行，不需要用于下游生化大生化量的蛋白质的分析，如蛋白质水解或SDS-PAGE电泳。事实上，需要相对少的转染的细胞，以明确地分配拓扑与感兴趣的蛋白质。这是很重要的，如果研究者正在评估拓扑在硬转染细胞，例如上皮细胞或神经元。简单的加法GFP的部分的任羧基或氨基的蛋白质的末端可以使用含有质粒众多市售的GFP很容易地实现，并且在大多数情况下，除了将GFP部分的不妨碍恰当的蛋白质折叠或细胞定位。然而，研究者必须确认这是适用于他们的蛋白质，因为有潜在的GFP影响感兴趣23,24的蛋白质。许多蛋白质已经可以作为GFP融合蛋白，因此需要极少的额外努力来启动拓扑研究。虽然连续监测荧光提供了确定蛋白质拓扑结构，对于谁没有进入活细胞成像设备研究者的快速和有效的方法，该法很容易适应甲醛固定程序利用蟑螂共聚焦显微镜的标准落射荧光。
然而有在FPP分析的适用性一定的局限性。应蛋白水解加工，或其他的翻译后修饰导致稍有不同的膜拓扑感兴趣的蛋白质，对FPP分析将仅评估显性蛋白质形式。此外，追加的GFP部分与某些蛋白质的末端可能会影响其功能，例如具有羧基末端PDZ结构域的干扰。尽管如此，FPP分析提供了一个简单的方法来建立多方位的膜蛋白和拓扑。
该最初的实验中被执行，以确定毛地黄皂苷以释放细胞内的可溶性的GFP的正确浓度，这一点至关重要。如果GFP不扩散的小区的出以下毛地黄皂苷应用，毛地黄皂苷的浓度应逐渐增加，以确定最小浓度重引入来方便的释放。然而，过多的毛地黄皂苷会影响细胞内囊泡，其完整性以下毛地黄皂苷应用应该确认的形态。在一些细胞中的细胞器是非常敏感的，并且可能需要更稳定缓冲液组合物25。如果从嵌合体被评估的荧光信号为低，选择单一克隆具有更高的表达水平，或进行瞬时表达，往往会增加信号强度到可接受的水平。寻求新的，更明亮的质粒也应考虑具有低信号强度。最后，应注意，以确保信号的可见的损失是由于对蛋白酶降解，而不是光漂白的荧光团。减少光的强度和/或采集速率将有助于减少漂白。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
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