La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

Las membranas de plasma, así como las numerosas membranas intracelulares, sirven como barreras que separan dos compartimentos acuosos. En el caso de la membrana plasmática, la separación es entre el exterior y el interior de la célula; para orgánulos intracelulares es entre el citoplasma y el lumen de orgánulos. Por ejemplo, la membrana del retículo endoplasmático (ER) separa un ambiente oxidante dentro del lumen del ER a partir de un ambiente reductor ¹ citosólica. Las proteínas de membrana son sintetizadas en los ribosomas ER-asociados, y lograr su topología final dentro de la membrana del RE ^2. La adquisición de la orientación de la membrana apropiado y la topología de proteínas es crítica para su función normal. Topología correcta permite dominios correspondientes de proteínas de membrana para interactuar con sus parejas de unión, permite modificaciones post-traduccionales críticos que se produzcan, y en el caso de proteínas de membrana de plasma, permite a la célula para interactuar con y responder to su entorno. Para apreciar completamente la función de una proteína de la membrana, es claramente imprescindible saber que la proteína está orientado con respecto a la membrana dentro de la cual reside, es decir, su topología de la membrana. Además de la adquisición de conocimiento científico básico, la comprensión de la topología de una proteína de la membrana y qué aspectos de una proteína de superficie están expuestos a diferentes ambientes ha marcado implicaciones clínicas ya que las proteínas de membrana constituyen la mayoría de dianas farmacológicas ^3. Hasta hace poco, los enfoques para la determinación de la topología de la proteína de membrana han requerido una inversión considerable en tiempo y dinero o han requerido reactivos que son difíciles de conseguir.

Ambos enfoques experimentales y en silico se han empleado para determinar la topología de la membrana de las proteínas que residen dentro de la membrana plasmática. Desde las primeras predicciones de dominios de membrana que abarca basadas en la hidrofobicidad evaluado de indiviaminoácidos dobles ^3, numerosos algoritmos predictivos ya están disponibles en el Internet, y simplemente requieren el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, los supuestos son a menudo el centro de este tipo de programas de modelado, los supuestos que pueden conducir a las asignaciones incorrectas de topología ^4,5. Además, aunque estas predicciones basadas en la informática pueden asignar provisionalmente regiones que abarcan la membrana, que no siempre determinan si el amino o carboxi de las proteínas están en el citoplasma, orgánulos o lumen exterior de la célula. Incluso con el aumento de potencia de cálculo, y el uso de algoritmos de aprendizaje ^6, esos datos sigue siendo un modelo, y debe ser validado a partir de datos experimentales adquiridos. Determinación experimental directa de topología de la membrana se ha realizado usando paneles de anticuerpos monoclonales con epítopos conocidos distribuidas a lo largo de la proteína, donde se ha hecho la evaluación de su inmunorreactividad antes y después de la permeabilización celular. Esteenfoque requiere un conjunto de anticuerpos, que pueden no estar disponibles para la proteína de interés.

Una estrategia alternativa es diseñar epítopo etiquetas tales como myc o hemaglutinina (HA) en distintos lugares de la proteína, de nuevo seguido por la determinación de la inmunorreactividad antes y después de permeabilización de la membrana. Además de las etiquetas inmunogénicas, etiquetas enzimáticas (incluyendo la fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, o β-lactamasa) y modificaciones químicas como el escaneo cisteína han sido empleados para determinar la proteína de membrana topología ^7,8. Un método adicional empleado para el mapeo topológica de proteínas de membrana de plasma se basa en un enfoque ligeramente diferente a etiquetas de epítopo. En este método, la secuencia de etiqueta es la secuencia consenso de glicosilación ligada a N NXS / T. Puesto que la glicosilación sólo se produce cuando tal secuencia está presente en el lumen de la vía de biosíntesis, la presencia de la etiqueta en un luminal frenteun compartimento citosólico se observa fácilmente como un cambio masivo en geles de SDS-PAGE. Este enfoque ha sido aplicado al canal CFTR ⁹ ion multispanning. Aunque se han utilizado todos estos enfoques, es claro que todos ellos requieren inversiones considerables en la biología molecular y la secuencia para generar los constructos múltiples.

Para determinar la información topológica con respecto a las proteínas transmembrana localizados dentro de los orgánulos intracelulares ha demostrado ser más difícil. La aplicación de tecnologías basadas en fluorescencia sin embargo, ha hecho que la determinación de la topología de la membrana mucho más simple. La técnica de la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) se basa en la interacción entre dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente, la restauración de las propiedades fluorescentes de que la proteína de ^10. Aunque se ha descrito inicialmente para la determinación de las interacciones proteína-proteína in vivo ^10, este enfoque también se ha utilizadopara determinar la topología de la proteína de membrana en células de plantas ^11. Sin embargo, este enfoque también es intensiva en tiempo, ya que requiere la generación no sólo de proteínas de fusión con la proteína de interés, sino también una variedad de proteínas de fusión dirigidas al citosol u orgánulo lumen, y requiere el conocimiento de que intracelular membranas de la proteína de interés reside en .

Un enfoque alternativo más sencillo para determinar la topología de proteínas de membrana se ha descrito ^12. El ensayo, la fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP) requiere la generación de una proteína de fusión entre GFP y el gen de interés. El enfoque se basa en la accesibilidad relativa de las proteasas no específicas a la fracción GFP; dependiendo de si GFP está protegido de proteólisis por residente en el lumen de los orgánulos intracelulares o se expone a la proteolisis por estar presente en el citosol. Por lo tanto, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta el citoplasma, que estará expuesto aactividad de la proteasa y la señal de fluorescencia pierden. Por el contrario, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta a un entorno "protegido" de la proteasa (como el lumen de Golgi), entonces persistirá la señal de fluorescencia.

Para permitir proteasas para entrar en la célula, pero no entrar en compartimentos intracelulares de membrana se utiliza el digitonina drogas unión colesterol. El colesterol es el esterol dominante en los vertebrados, y se enriqueció específicamente en la membrana plasmática con respecto a los compartimentos intracelulares. La toxina glicósido, digitonina, se extrae de la Digitalis purpurea planta. Digitonina tiene una afinidad por las membranas ricas de colesterol, donde se lleva a membrana selectiva permeabiliztion ^14,16 (Figura 1). Además de permitir la salida de pequeños componentes citosólicos, digitonina permeabilización también permite la entrada de moléculas exógenas, tales como proteinasa K o tripsina. El protocolo FPP se aprovecha de la fact que la membrana plasmática contiene hasta 80% de colesterol celular ^17, mientras que otros orgánulos, tales como ER, Golgi, endosomas, las mitocondrias, que tienen muy bajo contenido de colesterol, ¹⁴ permanecen intactos. La incorporación selectiva de colesterol en la membrana plasmática se ha observado en muchas células eucariotas, permitiendo el uso de la membrana plasmática de permeabilización digitonina-dependiente en diversas especies eucariotas tales como S. cerevisiae a humano ^14,18. El ensayo FPP proporciona un medio simple, rápido y bastante robustas de determinar (a) si una proteína es unida a la membrana / asociado o libremente difusible en el citosol y (b) qué dominio de una proteína de membrana se enfrenta el citosol o de orgánulos lumen. En caso de una proteína de membrana tienen múltiples orientaciones, la señal será surgir de la forma dominante y formas menores no será detectado. Si bien puede haber cierta preocupación de que la adición de un resto de GFP a la proteína de interés puede afectar a su función y/ O localización subcelular, esto es en realidad más teórico que real. De hecho, muchos estudios han demostrado claramente que la etiqueta de las buenas prácticas agrarias no altera las propiedades de la proteína ^19,20.

Protocol

1. Generación y Validación de quimeras de proteína fluorescente Anexar la proteína verde fluorescente (GFP) al extremo amino o carboxilo de la proteína de interés el uso de estrategias de DNA recombinante estándar 13. NOTA: Aunque hemos utilizado ampliamente GFP, otras variantes tales como la proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), DsRed y mCherry se pueden emplear. Las mejoras en la eficiencia fluoróforo plegable, brillo y fotoestabilidad constantem…

Representative Results

Membrana plasmática Permeabilización Efficient permeabilización de la membrana de plasma se determina por el uso de proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, GFP, DsRed) (paso 4). Estas proteínas, cuando se expresa en las células, son libres para difundir en el citosol, y se pierden cuando la membrana plasmática se permeabilizan utilizando digitonina (Figura 2). Una desaparición completa de la señal fluorescente debe ocurrir dentro de 10 a 60 …

Discussion

La orientación correcta y la topología de proteínas de membrana es esencial para su correcto funcionamiento. A pesar de la importancia de comprender la topología de proteínas de membrana, hay muchas proteínas para los que dichos datos se carece por completo. FPP proporciona una manera fácil y eficiente de la determinación de la topología de proteínas de membrana, y uno que puede ser realizado por la mayoría de los laboratorios. El enfoque FPP ofrece ventajas significativas sobre los métodos anteriores para l…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704