Introduction
De plasmamembranen, evenals talrijke intracellulaire membranen dienen als barrières tussen twee waterige compartimenten. Bij de plasmamembraan is de scheiding tussen de buitenkant en de binnenkant van de cel; voor intracellulaire organellen is tussen het cytoplasma en de organel lumen. Bijvoorbeeld, het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan scheidt een oxiderende omgeving binnen het lumen van het ER een cytosolische reducerende omgeving 1. Membraan eiwitten worden gesynthetiseerd op-ER geassocieerd ribosomen, en het bereiken van hun uiteindelijke topologie binnen de ER membraan 2. De overname van de juiste membraan oriëntatie en topologie voor eiwitten is essentieel voor hun normale functie. Correct topologie maakt relevante domeinen van membraaneiwitten te communiceren met hun bindingspartners, het mogelijk kritische post-translationele modificaties optreden, en in het geval van plasma membraaneiwitten, kan de cel te interageren met en te reageren to zijn omgeving. Om de functie van een membraaneiwit volledig waarderen, is het duidelijk noodzakelijk om te weten hoe dit eiwit is georiënteerd ten opzichte van het membraan waarin deze zich bevindt, dat wil zeggen, de membraan topologie. Naast het verwerven van wetenschappelijke basiskennis begrijpen van de topologie van een membraaneiwit en die aspecten van een eiwit oppervlak blootgesteld aan verschillende milieu zijn klinische implicaties gemarkeerd aangezien membraaneiwitten omvatten de meeste farmacologische doelen 3. Tot voor kort, benaderingen te bepalen membraaneiwit topologie aanzienlijke investering in tijd en geld hebben geëist of reagentia die moeilijk te verkrijgen zijn vereist.
Zowel experimentele als in silico benaderingen zijn gebruikt om de membraan topologie van eiwitten die binnen het plasmamembraan bepaalt. Aangezien de eerste voorspellingen van membraanomspannende domeinen basis van de geëvalueerde hydrofobiciteit van inddual aminozuren 3, talrijke algoritmes zijn nu beschikbaar op het internet, en eenvoudig vereisen kennis van het eiwit aminozuursequentie. Echter, aannames zijn vaak de kern van deze modellering programma's, aannames die kunnen leiden tot onjuiste opgaven van de topologie 4,5. Voorts terwijl deze computergebaseerde voorspellingen voorlopig membraanoverspannende gebieden kunnen toewijzen, zij niet altijd bepalen of de amino- of carboxy-termini van eiwitten in het cytoplasma, organel lumen of cel exterieur. Zelfs met meer rekenkracht en het gebruik van automatische leeralgoritmen 6, zoals gegevens nog een model, en worden gevalideerd middels experimenteel verkregen gegevens. Directe experimentele bepaling van membraantopologie is uitgevoerd met panelen van monoklonale antilichamen met bekende epitopen verdeeld over het eiwit, waarbij de beoordeling van hun immunoreactiviteit werd vóór en na cel permeabilisatie. Ditbenadering vereist een reeks antilichamen die niet beschikbaar zijn voor het eiwit van interesse.
Een andere mogelijkheid is epitooplabels zoals myc of hemagglutinine (HA) in verschillende plaatsen in het eiwit, wederom gevolgd door bepaling van immunoreactiviteit voor en na membraan permeabilisatie ingenieur. Naast immunogene labels, enzymatische labels (zoals alkalisch fosfatase, β-galactosidase, of β-lactamase) en chemische modificaties zoals cysteine scanning zijn allemaal gebruikt om membraaneiwit topologie 7,8 bepalen. Een extra methode toegepast voor topologische kaart brengen van plasmamembraaneiwitten berust op een iets andere benadering van epitoop-merkers. In deze werkwijze de tag sequentie de N-gekoppelde glycosylering consensussequentie NXS / T. Omdat glycosylering optreedt wanneer een dergelijke sequentie aanwezig in het lumen van de biosynthetische route, de aanwezigheid van het label in een luminale versus iseen cytosolisch compartiment wordt gemakkelijk waargenomen als een massaverschuiving op SDS-PAGE gels. Een dergelijke aanpak is toegepast op de multispanning ionkanaal CFTR 9. Hoewel al deze benaderingen zijn gebruikt, is het duidelijk dat ze allemaal aanzienlijke investeringen in de moleculaire biologie te genereren en de sequentie verdeelstuk constructen vereisen.
Om topologische informatie over transmembraaneiwitten zich binnen intracellulaire organellen te bepalen heeft bewezen een grotere uitdaging te zijn. De toepassing van fluorescentie gebaseerde technologie heeft echter de bepaling van membraantopologie veel eenvoudiger. De techniek van bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) berust op de wisselwerking tussen twee niet-fluorescerend fragmenten van een fluorescerend eiwit, herstel van de fluorescente eigenschappen van dat eiwit 10. Hoewel aanvankelijk beschreven voor de bepaling van eiwit-eiwit interacties in vivo 10, heeft deze benadering ook gebruiktaan membraaneiwit topologie in plantencellen 11 bepalen. Deze benadering is echter ook tijdsintensief omdat het onderzoek generatie niet alleen fusie-eiwitten met het eiwit van belang maar ook diverse fusieproteïnen gericht naar het cytosol of organel lumen en vereist kennis die intracellulaire membranen het eiwit van interesse bevindt in .
Een alternatieve eenvoudiger benadering bepalen membraaneiwit topologie is beschreven 12. De test Fluorescentie Protease bescherming (FPP) vereist het genereren van een fusie-eiwit tussen GFP en het gen van belang. De benadering is gebaseerd op de relatieve toegankelijkheid van niet-specifieke proteasen de GFP rest; naargelang GFP wordt beschermd tegen proteolyse door die in het lumen van intracellulaire organellen of wordt blootgesteld aan proteolyse door aanwezig in het cytosol. Dus als de GFP groep op het eiwit van interesse staat voor het cytoplasma, het wordt blootgesteld aanproteaseactiviteit en het fluorescentiesignaal verloren. Omgekeerd, indien het GFP groep op het eiwit van interesse staat voor een omgeving 'beschermd' van de protease (zoals de Golgi lumen) dan zal het fluorescentiesignaal blijven.
Om ervoor te zorgen proteasen om de cel in te voeren, maar intracellulaire membraan compartimenten het cholesterol bindend drug digitonine wordt gebruikt, niet in te voeren. Cholesterol is de dominante sterol in vertebraten, en specifiek in het plasmamembraan opzichte van intracellulaire compartimenten verrijkt. De glycoside toxine, digitonine, geëxtraheerd uit de plant Digitalis purpurea. Digitonine een affiniteit voor cholesterol rijke membranen, waar het leidt tot selectieve membraan permeabiliztion 14,16 (Figuur 1). Naast het feit uitgang van kleine cytosolische componenten, digitonine permeabilisatie maakt ook de toegang van exogene moleculen, zoals proteinase K of trypsine. De FPP-protocol maakt gebruik van de fact de plasmamembraan bevat tot 80% van cellulaire cholesterol 17, terwijl andere organellen, zoals ER, Golgi, endosomen, mitochondria, die zeer laag cholesterolgehalte hebben, intact 14 blijft. De selectieve opname van cholesterol in de plasmamembraan waargenomen in vele eukaryotische cellen, die het gebruik van digitonine-afhankelijke plasma membraan permeabilisatie in uiteenlopende eukaryotische soorten S. cerevisiae menselijke 14,18. Het FPP assay een eenvoudige, snelle en vrij robuust middel van het bepalen (a) of een eiwit membraangebonden / associated of vrij diffundeerbaar in het cytosol en (b) die domein van een membraaneiwit kijkt het cytosol of organel lumen. Moet een membraaneiwit hebben meerdere oriëntaties, zal het signaal ontstaan uit de dominante vorm en kleine vormen zal niet worden gedetecteerd. Hoewel er enige bezorgdheid dat de toevoeging van een GFP groep aan het eiwit van interesse functionaliteit kan beïnvloeden kan worden en/ Of subcellulaire lokalisatie, dit is eigenlijk meer theoretisch dan de werkelijke. Inderdaad veel studies hebben duidelijk aangetoond dat het GFP-tag niet de eigenschappen van het eiwit 19,20 veranderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie en Validatie van Fluorescent Protein Chimeras
- Voeg groen fluorescerend eiwit (GFP) aan de amino of carboxyl termini van het eiwit van belang onder toepassing van standaard recombinant DNA strategieën 13.
Opmerking Hoewel we intensief gebruikt GFP andere varianten zoals cyaan fluorescerend eiwit (CFP), geel fluorescerend eiwit (YFP), DsRed en mCherry kunnen worden toegepast. Verbeteringen in fluorofoor vouwen efficiëntie, helderheid en fotostabiliteit worden voortdurend gemaakt, en onderzoekers moeten gebruik maken van de nieuwste generatie constructies.- Bevestig juiste DNA-sequentie en zorgen dat de GFP-groep in frame met het eiwit van interesse. Voer sequentiebepaling met gebruikmaking van standaard recombinant DNA strategieën 21.
OPMERKING: Veel instellingen hebben kern DNA-faciliteiten, die de onderzoeker wordt aangemoedigd om contact op voor meer informatie. - Voor enkele of dubbele doorgang membraaneiwitten, genererenzowel amino- en carboxyterminale versies van de fusie-eiwitten 19.
- Voor multi-spanning eiwitten plaatst GFP binnen vermeende extramembrane lussen, evenals de eindpunten. Pas goed bij het genereren transmembraan chimaera fluorescentielicht fusie-eiwit gebonden aan de aminoterminus van het doeleiwit signaalsequenties vaak gesplitst door proteolyse wanneer het eiwit doorgegeven via de ER translocon.
- Bij bestaande signaalsequenties, plaatst het fluorescerende fusieproteïne distaal van de splitsingsplaats om een rijp eiwit dat een intacte amino-eindstandig gemerkte fluorescerende eiwit produceren. Werken met standaard recombinant DNA strategieën voor het genereren van chimeren 21.
- Bevestig juiste DNA-sequentie en zorgen dat de GFP-groep in frame met het eiwit van interesse. Voer sequentiebepaling met gebruikmaking van standaard recombinant DNA strategieën 21.
- Bepaal de aanwezigheid van voldoende adequaat gelokaliseerde fluorescerende signaal in de cellijn van belang.
- Let op de cellen onder epifluorescentiemicroscopie behulp van de intrinsieke fluorescentie van GFP onder appropriaten filter voorwaarden. Voor GFP filtersets die 510-560 nm omvatten, bevestigen dat de juiste filters worden gebruikt voor de fluorofoor gebruikt.
OPMERKING: Een voldoende signaal wordt bereikt wanneer beoordeling door oog verschaft een sterk signaal dat de celstructuur waarin het signaal zich bevindt gemakkelijk opgelost boven de achtergrond. Ook het kleurpatroon van het GFP-eiwit moet in overeenstemming met die van merkers voor de juiste organel, en bij voorkeur identiek aan die van het natieve niet-gecodeerde eiwit.
- Let op de cellen onder epifluorescentiemicroscopie behulp van de intrinsieke fluorescentie van GFP onder appropriaten filter voorwaarden. Voor GFP filtersets die 510-560 nm omvatten, bevestigen dat de juiste filters worden gebruikt voor de fluorofoor gebruikt.
- Bepalen of een stabiele of kortstondige transfectie aanpak worden toegepast gebaseerd op het eiwit geëvalueerd.
OPMERKING: Stabiele transfectanten algemeen veroorloven lagere niveaus van expressie dan voorbijgaande systemen. Alhoewel transiënte expressie levert hoge expressie van (afhankelijk van het eiwit ~ 5-24 uur na transfectie) eiwitten en verhoging signaalintensiteit kan ook leiden tot overexpressie artefacten zoals eiwitten aggrdelegatieovereenkomsten of verzadiging van eiwit aangrijpingspunten, wat leidt tot foutieve subcellulaire lokalisatie.
2. Transfectie van cellen en Cell Culture
OPMERKING: Een verscheidenheid van cellen vatbaar zijn voor FPP analyse, waaronder Hek293, HeLa, COS-7 en CHO cellen 14. De volgende beschrijving is gebaseerd op expressie membraaneiwitten in HEK293-cellen.
- Groei humane embryonale niercellen (Hek293) als hechtende monolagen in 6 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM), aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 1% natriumpyruvaat en 250 pg / ml penicilline / streptomycine bij 37 ° C met 5% CO2. Voer alle werkzaamheden met cellen in een laminaire stroming weefselkweek kap. Groeien cellen in kweekmedium tot ~ 80% confluent in een T-75 kolf.
- Transfecteren cellen met behulp van een standaard high-efficiency, lage toxiciteit transfectiemethode, waaronder lipiden, viral- of-elektroporatie gebaseerde technologieën te transien genererent of stabiele expressie. Normaal 2 ug plasmide DNA per 1 x 10 6 cellen geeft goede reproduceerbare eiwitexpressie. Handhaaf cellen voor 5-48 uur in geschikte weefselkweekmedium bij 37 ° C in een CO 2 kan weefselkweek incubator.
- Monitor cellen voor expressie van het GFP-fusie-eiwit met epifluorescentie microscopie, met de intrinsieke fluorescentie signaal van GFP, met geschikte filtersets volgens het protocol van de fabrikant. Fluorescentie-signaal bereikt meestal een maximum binnen 24-72 uur na transfectie. Gebruik cellen, indien het fluorescentiesignaal een maximum niveau bereikt. Monitor proteïne expressieniveaus door immunoblot analyse met antilichamen gericht tegen hetzij het eiwit van belang of het GFP deel.
- Voor experimentele analyse plaat cellen op gecoate dekglaasjes. Bekijk ofwel onder een live-cell configuratie of na fixatie en monteren op microscopie glijbanen. Plaat cellen tot 60% -80% samenvloeiing bereiken binnen 24-48 uur.
- Coat dekglaasjes met poly-lysine-oplossing (0,1 mg / ml), zodat het gehele oppervlak is bedekt. Incubeer gedurende 30 min onder een ultraviolet licht bij kamertemperatuur, gevolgd door 60 min in een cel incubator bij 37 ° C. Verwijder overtollige poly-lysine en spoel de dekglaasjes in PBS 3 keer.
- Als alternatief, het bord van de cellen op een chambered dekglas bestaande uit celkweek platen met een optische glazen bodem om directe beeldvorming met olie-immersie doelstellingen mogelijk te maken. De werkelijke microscopie setup afhankelijk van de capaciteiten van de onderzoeker apparatuur, maar die snel oplossing veranderingen worden. Afhankelijk van het celtype en de celvorm, moeten de cellen ongeveer 60-90% samenvloeiing op het moment van het FPP assay.
3. fluorescentiemicroscopie Setup
- Gebruik een hoge numerieke apertuur (NA) olie-immersie objectief voor een maximale signaal verzamelen en ruimtelijke resolutie, zoals een 60x, 1,42 NA olie-immersie objectief. Gebruik the volgende lasers om de fluoroforen stimuleren: Argon gas 488 nm (GFP en YFP) en 561 diode (RFP, mCherry).
- Bepaal de optimale belichting, gain en opnamesnelheid van beelden voor elk construct. Pas laser intensiteit en de belichtingstijd te photobleaching te minimaliseren (zie stap 7.1.2).
- Voor studies met behulp van meerdere fluoroforen (bijvoorbeeld een oplosbare marker voor membraan permeabilisatie in concert met een membraaneiwit marker), kiest u de juiste filter sets te signaal overspraak te minimaliseren en maximaliseren van signal-to-noise ratio's.
4. Vaststelling van optimale voorwaarden voor plasmamembraan Permeabilisatie
- Verwijder het celkweekmedium van cellen die alleen oplosbare fluorescerende eiwitten (bv EGFP, DsRed). Was de cellen 3x (1 min elk) in KHM buffer (110 mM kaliumacetaat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Voer experimenten met cellen en alle reagentia bij kamertemperatuur.
- Plaats cellen on dekglaasjes (zie stap 2.4) in KHM buffer op een fluorescentie microscoop podium en het verzamelen van de eerste afbeelding, die de controle fase 'niet-gepermeabiliseerde' vertegenwoordigt.
- Om het plasmamembraan selectief doorlaatbaar, voeg digitonine (30 uM) in KHM buffer aan de cellen. Perfuseren cellen met buffer (buffer + digitonine) met een snelheid van 5 ml / min gedurende 10-60 sec.
- Bepaal de optimale digitonine concentratie geleidelijk verhogen van de concentratie van digitonine. De optimale digitonine concentratie wordt bereikt wanneer er volledig verlies van fluorescentie signaal van oplosbare EGFP binnen 10-60 sec van digitonine toepassing. Voor veel cellen toepassing van 10-50 pM digitonine volstaat om de celmembraan permeabel.
- Voor alle toepassingen gebruiken de laagst mogelijke concentratie van digitonine. Verzamel beelden na digitonine permeabilization voor gepermeabiliseerde achtergrond signaal.
- Bevestigen dat het GFP-eiwitchimeer van belang is membraan ingreerde door bevestiging cellulaire retentie van het fluorescentiesignaal volgende digitonine permeabilisatie van het plasmamembraan 16.
- Versneld een organel specifieke fluorescent eiwit 23. Mitochondriale eiwitten werken goed in dit verband 16, bijvoorbeeld, pDsRed2-Mito vector. Bepaal optimale expressie zoals beschreven in stap 2.1.
- Bevestigen dat de digitonine concentratie is geschikt voor het soort cel in dienst door ervoor te zorgen dat de morfologie van intracellulaire organellen constant blijft gedurende langere (tot 60 min) blootstelling aan digitonine.
OPMERKING: Gebruik standaard immunofluorescentie microscopie protocollen met behulp van antilichamen tegen verschillende cellulaire compartimenten, zoals lysosomen (bijvoorbeeld LAMP1), Golgi (bijvoorbeeld TGN38), endoplasmatisch reticulum (bijv calnexin), endosomen (bijvoorbeeld Rab5), mitochondria (bijvoorbeeld cytochroom c). Als intracellulaire organel morfologie / integriteit verandert dramatisch over 60 min, is het waarschijnlijk dat de digitonine concentratie te hoog was, en vereist een vermindering digitonine concentratie en / of blootstellingstijd.
OPMERKING: Digitonine is giftig bij inademing en contact met de huid. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
5. protease Behandeling van fluorescerende eiwitten
- Was de cellen in KHM buffer en voeg protease (proteïnase K, 50 ug / ml in buffer KHM) direct op de cellen. Perfuseren cellen bij een stroomsnelheid van 5 ml / min met behulp van een zwaartekracht perfusie systeem continu bad de bereiding.
- Store oplossingen in 50 ml spuiten en polyethyleen buis verbonden onafhankelijke reservoirs naar een spruitstuk met een enkele uitlaat aan het bad (5 ml / min debiet). Plaats een zuigpipet een constante (0,5 ml) badvolume behouden of verwezenlijken oplossing uitwisseling handmatig schakelen tussen perfusie reservoirs.
- Verzamel afbeeldingen te bepalen of de fluorescent signaal aanhoudt of degradeert. Een verlies van> 90% van de oorspronkelijke signaalintensiteit gedurende 30-60 sec is met proteolytische afbraak van het GFP-eiwit chimeer (zie Representatieve resultaten).
- Als er geen signaal wordt waargenomen met proteinase K, wanneer een dergelijk verlies wordt verwacht, vervang de proteinase K oplossing met trypsine (4-8 mM) in KHM buffer. Indien nodig, gebruik van een mengsel van proteïnase K en trypsine. Het is niet nodig om de proteaseactiviteit blussen.
6. Alternatieve Aanpak voor plasmamembraaneiwitten met externe Domeinen
- Voor plasma membraaneiwitten, voert u de test voor externe fluorescerende eiwitten hersenschimmen voorafgaand aan permeabilisatie digitonine. Was de cellen op dekglaasjes in KHM buffer (5 ml / min x 3 min), en neem een afbeelding voor pre-protease behandeling en kwantificeren pre-protease fluorescentie signaal als in stap 7.
- Expose cellen protease (proteinase K, 50 ug / ml trypsine of 4-8 mM in buffer KHM) in thij geen digitonine te doorstromen de cellen met KHM media die protease (stroomsnelheid 5 ml / min). Verzamel beelden van de fluorescent eiwit, te bepalen hoe snel het signaal verdwijnt of hoe lang het signaal aanhoudt.
- Voor digitonine permeabilisatie, doven alle proteaseactiviteit, door wassen van de cellen driemaal (1 min elk) in celkweekmedium bevattende 10% serum (FBS).
- Was de cellen te doorstromen met KHM buffer (stroomsnelheid van 5 ml / min) gedurende 2 min. Verwerven afbeelding van een pre-doorlaatbaar maken. Permeabilize het celmembraan zoals beschreven in stap 4.
- Verzamel afbeeldingen volgende protease toevoeging als beschreven in stap 5.
7. beeldanalyse
- Gebruik een omgekeerde microscoop die "live cell" opname, waarbij verlies van fluorescentie signaal kan worden in real-time. Voor continue monitoring, in dienst identieke parameters (exposure tijd, winnen, laser intensiteit, enz.).
- Bepaal experimental parameters door het observeren van de fluorescentie-signaal van de GFP-eiwit van belang onder controle omstandigheden (dat wil zeggen, KBH alleen buffer). Stel de gain, laser intensiteit en belichtingstijd instellingen op de computer-gestuurde microscoop om ervoor te zorgen dat er geen noemenswaardig verlies van de intensiteit van het signaal over een 10-20 min periode.
OPMERKING: Signaalsterkte is geen absolute waarde, maar is gebaseerd op de microscoop systeem instellingen beschikbaar voor elke PI. Monitor veranderingen in relatieve fluorescentie-intensiteit.
- Bepaal experimental parameters door het observeren van de fluorescentie-signaal van de GFP-eiwit van belang onder controle omstandigheden (dat wil zeggen, KBH alleen buffer). Stel de gain, laser intensiteit en belichtingstijd instellingen op de computer-gestuurde microscoop om ervoor te zorgen dat er geen noemenswaardig verlies van de intensiteit van het signaal over een 10-20 min periode.
- Als alternatief behandelen cellen op vaste tijdstippen in digitonine gevolgd door protease en repareren cellen voorafgaand aan de montage op dekglaasjes voor beeldvorming. Bepalen tijdstippen empirisch volgende procedures in de stappen 4 en 5. Voor het eerste onderzoek, beginnen bij 0, 30, 60, 120 en 300 seconden na de toevoeging van digitonine of protease.
- Fix cellen (20 min bij kamertemperatuur) met een voldoende hoeveelheid fixatief (3,7% paraformaldehyde in PBS) volledig onderdompelen the cellen.
- Quench resterende paraformaldehyde door spoelen cellen met PBS die 20 mM glycine (3 x 5 min).
- Mount dekglaasjes door het verwijderen van overtollige vloeistof uit het dekglaasje en het omkeren van de dekglaasje op 50 ul montage media op een glazen microscoopglaasjes voor de beeldvorming. Laat dia's om 's nachts drogen voordat beeldvorming.
- Verzamel fluorescentie microscopie beelden (onder de juiste filters toestellen die compatibel zijn met de fluorofoor wordt gebruikt) met behulp van de afbeelding video-opname functie op een computergestuurde fluorescentie microscoop.
- Kwantificeren fluorescent signaal-intensiteiten als functie van incubatie conditie. Haal de gemiddelde pixelintensiteit binnen een gebied van belang (ROI) die een individuele cel omsluit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasmamembraan Permeabilisatie
Efficiënte plasmamembraan permeabilisatie wordt bepaald door het gebruik van oplosbare fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP, DsRed) (stap 4). Deze eiwitten, bij expressie in cellen vrij te diffunderen in het cytosol, en gaan verloren wanneer de plasma membraan doorlaatbaar gemaakt met digitonine (figuur 2). Een volledig verdwijnen van fluorescent signaal dient binnen 10-60 sec van digitonine toepassing. Bevestiging dat het eiwit van belang geassocieerd met intracellulaire organellen wordt bereikt door het opmerken van het behoud van fluorescentiesignaal na digitonine permeabilisatie.
Proteasebehandeling
Na succesvolle productie van fluorescerende chimaera tussen het eiwit van belang en het fluorescerende eiwit (GFP, YFP, enz.) (Stap 1) en expressie van het fluorescerende eiwit in cellen (stap 2), behandeling van gepermeabiliseerde cellen met protease informatie of de fluorofoor (en de aangrenzende eiwit domein) zijn in het cytosol en toegankelijk voor protease digestie of bevinden zich in een organel lumen en zo tegen protease digestie (stap 4). LMTK2 is een membraan verankerd kinase 15 en bescherming fluorescentie protease assays werden gebruikt om de membraan topologie 16 bepalen. De carboxyl staart van LMTK2 werd gefuseerd met GFP en tijdelijk tot expressie. Fluorescent LMTK2-GFP signaal werd verloren snel na toevoeging van proteinase K, dat de ligging van het carboxyluiteinde van LMTK2 zijn gelegen in het cytosol (figuur 3). Caveoline-GFP (Cav1-GFP) 17 is een plasma membraaneiwit met een GFP-groep gehecht aan de cytosolische domein. Zoals LMTK2, wordt het signaal van caveolin-YFP digitonine ongevoelig, maar gevoelig voor de daaropvolgende toevoeging van protease (figuur 3).
t "> Luminal oplosbare eiwitten kunnen ook worden geïdentificeerd met de FPP protocol. In dit voorbeeld wordt de ER retentiesignaal KDEL gevoegd DsRed. In tegenstelling tot de signalen van LMTK2 en caveolin, het signaal van de KDEL-DsRed is ongevoelig voor zowel digitonine en protease, zoals digitonine is niet de ER membraan doorlaatbaar en het fluorescentiesignaal is beschermd tegen protease aantasting. Een voorbeeld van een membraan domein binnen de lumen van een organel wordt gegeven door de mitochondriale eiwit subeenheid VIII van humane cytochroom c oxidase 18,19. pDsRed-Mit, codeert het rode fluorescente eiwit van Discosoma sp. gefuseerd aan het mitochondriaal van cytochroom c oxidase. In cellen die pDsRed-Mito, wordt fluorescerend signaal gezien in de cel. Na digitonine permeabilisatie, het fluorescentiesignaal geassocieerd met pDSRed-Mito blijft stabiel. Bovendien, na toevoeging van proteinase K, de fluorescentie geassocieerd met pDsRed-Mito aanhoudt, coneenstemming met het fluorofoor in de mitochondriën en niet blootgesteld aan het cytosol en zo tegen protease-activiteit (Figuur 3).Extracellulaire domeinen
Protease behandeling van niet-gepermeabiliseerde cellen moet snel het fluorescentiesignaal bij de fluorescente groep aan een membraaneiwit wordt geconfronteerd met het cel exterieur blussen. De glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankerd eiwit PrP 20 dient als een uitstekend voorbeeld. Een construct dat de geel fluorescerend eiwit (YFP) gekoppeld aan de aminoterminus van PrP (YFP-PrP) 21,22, een royale gift van Dr. Ehud Cohen, van de Hebrew University of Jerusalem. Vóór behandeling protease, het fluorescentiesignaal van de extracellulaire YFP was licht (figuur 4). Na behandeling met protease, extracellulaire fluorescentiesignaal verdween snel.
Tijd Overwegingen
Figuur 1: Selectieve permeabilisatie van de plasmamembraan (a) model van het beeldverhaal van de FPP-test toont een enkele cel gaan door het experimentele protocol.. De rood symbool staat voor rood fluorescerend eiwit (RFP) in het cytosol, de groene en blauwe symbolen vertegenwoordigen transmembraaneiwitten met de tl-tag of met uitzicht op organel lumen (blauw) of cytosol (groen). (B) Na digitonine permeabilisatie, gratis cytosoleeiwitten diffuse weg, het verminderen van de RFP signaal. (C) Na het aanbrengen van proteinase K, wordt de cytosole groene signaal gedegradeerd, terwijl de blauwe signaal wordt beschermd tegen afbraak door haar aanwezigheid in het organel lumen.
Figuur 2: Digitonine behandeling permeabilizes het plasmamembraan en geeft cytosolische GFP (a) cartoon van een enkele cel die oplosbaar GFP, voor en na behandeling digitonine.. (B) Digitonine behandeling permeabilizes het plasmamembraan en releases cytosole GFP. Een regio van belang (ROI) wordt getrokken rond CHO-cellen die oplosbaar GFP. Na behandeling met digitonine (50 uM) werden beelden die vóór en na de toevoeging van digitonine, en op de aangegeven tijdstippen. Schaal bar, 10 micrometer. (C) De kwantificering van de fluorescence intensiteiten van de full-time-serie (AF) wordt getoond.
Figuur 3: FPP onthult de topologie van het endosomal eiwit LMTK2 (a) van het beeldverhaal van FPP tonen verlies van DsRed (rode ballen), maar het behoud van LMTK2-GFP (groene ballen) volgende digitonine permeabilisatie, gevolgd door signaalverlies over de toepassing van proteinase K. . (b) FPP-assay van CHO Cellen die DsRed en LMTK2-GFP. Beelden werden genomen vóór en na digitonine behandeling en na proteinase K, zoals aangegeven. Schaalbalk: 10 micrometer.
Figuur 4: (a) model cartoon toont de topologie en locatie van YFP-PrP (groen) voor en na proteinase K behandeling. CHO cellen dieYFP-PrP werden onderworpen aan proteinase K 100 sec. (B) beelden vóór en na de behandeling met protease getoond op de aangegeven tijdstippen. YFP-PrP signaal werd volledig verloren na protease in afwezigheid van digitonine. Gele toont interessegebied (ROI) voor kwantificering weergegeven in (c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De juiste oriëntatie en topologie van membraaneiwitten essentieel is voor hun functie. Ondanks het belang van het begrijpen membraaneiwit topologie, zijn er vele eiwitten waarvoor dergelijke gegevens volledig ontbreekt. FPP biedt een eenvoudige en efficiënte manier om te bepalen membraaneiwit topologie, en een die kan worden uitgevoerd door de meeste laboratoria. De FPP aanpak biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van eerdere methoden om eiwitten topologie. Zo hoeft een panel van meervoudige antilichamen weer verschillende domeinen van het eiwit van belang 31 zijn. In veel gevallen een panel van antilichamen beschikbaar is; Dit geldt vooral voor nieuw gekloonde proteïnen. Aangezien de test kan worden uitgevoerd op een enkele cel niveau worden grote biochemische hoeveelheden proteïne niet vereist voor downstream biochemische analyses zoals proteolyse of SDS-PAGE. Immers relatief weinig getransfecteerde cellen nodig ondubbelzinnig toewijzeneen topologie voor het eiwit van interesse. Dit is belangrijk als de onderzoeker evaluatie topologie moeilijk te transfecteren cellen zoals epitheelcellen of neuronen. Eenvoudige toevoeging van een GFP groep aan ofwel de carboxyl- of amino-uiteinde van het eiwit kan gemakkelijk worden bereikt met verschillende commercieel verkrijgbare GFP-bevattende plasmiden, en in de meeste gevallen heeft de toevoeging van het GFP deel niet goed eiwitvouwing of subcellulaire lokalisatie belemmeren. Wel moet de onderzoeker bevestigen dat dit geldt voor de eiwitten, omdat er de mogelijkheid van GFP aan het eiwit van belang 23,24 beïnvloeden. Veel eiwitten zijn reeds beschikbaar als GFP fusie-eiwitten, waardoor het nodig minimale extra inspanning om topologische studies te starten. Hoewel de continue monitoring van de fluorescentie biedt een snelle en efficiënte manier van het bepalen van eiwitten topologie, voor onderzoekers die geen toegang tot wonen-cell imaging apparatuur hebben, wordt de test gemakkelijk aangepast aan een formaldehyde fixatie appvoorn met behulp van standaard epifluorescente van confocale microscopie.
Er zijn echter enkele beperkingen in de toepasbaarheid van het FPP assay. Indien proteolytische verwerking of andere post-translationele modificaties resulteren in enigszins verschillende membraan topologieën voor het eiwit van belang, zal het FPP assay alleen de dominante proteïne vorm beoordelen. Bovendien voegen een GFP groep aan de uiteinden van sommige eiwitten hun functie beïnvloeden, bijvoorbeeld mengen carboxylterminale PDZ-domeinen. Toch is de FPP-test biedt een eenvoudige benadering van oprichting oriëntatie en topologie van vele membraaneiwitten.
Het is essentieel dat de eerste experimenten worden uitgevoerd om de juiste concentratie van digitonine intracellulaire oplosbare GFP vrij bepalen. Als het GFP niet diffundeert uit de cel na digitonine aanbrengen dient de concentratie van digitonine geleidelijk worden verhoogd tot de minimale concentratie re bepalenwenste de uitstroming te vergemakkelijken. Echter teveel digitonine de morfologie van intracellulaire vesicles, waarvan de integriteit moet worden bevestigd na digitonine toepassing beïnvloeden. Organellen in sommige cellen zijn zeer gevoelig en kunnen een stabiliserende buffer samenstelling 25 vereisen. Indien het fluorescentiesignaal van de chimera geëvalueerd laag, het selecteren van een enkele kloon met een hoger expressieniveau, of het uitvoeren van een transiënte expressie, vaak verhogen signaalsterkte tot een aanvaardbaar niveau. Zoeken naar nieuwere, moet helderder plasmiden ook worden overwogen met een lage intensiteit van het signaal. Tenslotte moet erop worden gelet dat het signaalverlies wordt gezien vanwege protease aantasting en niet fotobleken van fluoroforen. Het verminderen van de lichtintensiteit en / of overname tarief zal helpen om fotobleking verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
