蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）
Summary
Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.
Abstract
The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.
Introduction
形質膜、ならびに多数の細胞内膜二水性区画を分離する障壁として機能する。原形質膜の場合には、分離は、外部との間で、セルの内部にある。細胞内小器官のためには、細胞質および細胞小器官の内腔の間である。例えば、小胞体（ER）膜は、環境1を減少させる、サイトゾルからERのルーメン内酸化環境を分離する。膜タンパク質は、ER関連リボソーム上で合成され、ER膜2内の最終的なトポロジを達成している。タンパク質のための適切な膜配向とトポロジの買収は、彼らの正常な機能のために重要である。正しいトポロジーは、膜タンパク質の関連ドメインは、その結合パートナーと相互作用することができ、それは重要な翻訳後修飾が起こることができ、そして原形質膜タンパク質の場合、細胞と相互作用し、tは対応することができその環境をoを完全膜タンパク質の機能を理解するために、そのタンパク質は、それが含まれている膜、 すなわち 、その膜トポロジーに対して配向されているかを知ることが明らかに必須である。基本的な科学的知識の獲得に加えて、膜タンパク質のトポロジーを理解し、そのタンパク質表面の態様は異なる環境にさらされている膜タンパク質の薬理学的標的3の大部分を構成するので、臨床的意味をマークした。最近まで、時間とお金にかなりの投資を必要としていたか、手に入れるのが困難な試薬を必要とした膜タンパク質のトポロジーを決定することに近づく。
両方の実験とin silicoでのアプローチは、原形質膜内に存在するタンパク質の膜トポロジーを決定するために使用されてきた。 INDIVIの評価を疎水性に基づく膜貫通ドメインの最初の予測ので、デュアルアミノ酸3、多数の予測アルゴリズムは、インターネット上で現在利用可能であり、単に、タンパク質のアミノ酸配列の知識を必要とする。しかし、仮定は、多くの場合、そのようなモデリングプログラム、トポロジー4,5の不正確な割り当てにつながる可能性の仮定の中心である。これらのコンピュータベースの予測が暫定的に膜貫通領域を割り当てることができますしながら、また、彼らは常に、アミノまたはタンパク質のカルボキシ末端は細胞小器官内腔または細胞外装、細胞質内にあるかどうかを判断しないでください。計算能力を増加させ、さらにはと機械学習アルゴリズム6、そのようなデータの使用は、まだモデルであり、実験的に取得したデータを使用して検証する必要があります。膜トポロジーの直接の実験的決定は、その免疫反応性の評価は、細胞透過処理の前と後に行われているタンパク質、全体に分散既知のエピトープを有するモノクローナル抗体のパネルを使用して行われている。このアプローチは、目的のタンパク質のために利用できない場合があり、抗体のセットを必要とする。
別の戦略は、再び膜透過化の前と後の免疫反応性の決定に続いて、タンパク質の様々な場所にかかるのmycまたは赤血球凝集素（HA）などのエピトープタグを操作することである。免疫原性タグ、酵素タグ（アルカリホスファターゼを含む、βガラクトシダーゼ、またはβラクタマーゼ）に加えて、そのようなシステインスキャニングのような化学修飾は、すべての膜タンパク質トポロジー7,8を決定するために使用されてきた。原形質膜タンパク質のトポロジーマッピングのために使用するさらなる方法は、エピトープタグにわずかに異なるアプローチに依存している。この方法において、タグ配列は、N結合型グリコシル化コンセンサス配列NXS / Tである。そのような配列は、生合成経路のルーメン内に存在する場合、グリコシル化は、対管腔におけるタグの存在、発生するので細胞質ゾル区画に容易SDS-PAGEゲル上の質量シフトとして観察される。このようなアプローチは、multispanningイオンチャネルCFTR 9に適用されている。これらのすべてのアプローチが利用されてきたが、それらはすべてマニホールド構築物を作製し、配列決定するために分子生物学においてかなりの投資を必要とすることは明らかである。
細胞内小器官内に配置された膜貫通タンパク質に関するトポロジ情報を調べるには、より挑戦的であることが判明した。蛍光ベースの技術の適用は、しかしながら、多くの単純な膜トポロジーの決定をした。二分子蛍光相補性（BIFC）の技術がそのタンパク質10の蛍光特性を復元する、蛍光タンパク質の二つの非蛍光フラグメントとの相互作用に依存しています。最初に、生体内 10 でのタンパク質-タンパク質相互作用を決定するために説明したが、このアプローチは、利用されている植物細胞11内の膜タンパク質のトポロジーを決定する。しかし、このアプローチは、目的のタンパク質だけでなく、細胞質ゾルまたは細胞小器官の管腔を標的とする種々の融合タンパク質との融合タンパク質だけでなく生成を必要とする時間集約的でもあり、関心が常駐の細胞内タンパク質をメンブレンそれらの知識を必要とする。
膜タンパク質のトポロジーを決定する代わりに単純なアプローチは、12に記載されている。アッセイ、蛍光プロテアーゼ保護（FPP）は、GFPと目的の遺伝子との間の融合タンパク質の生成を必要とします。アプローチは、GFP部分への非特異的プロテアーゼの相対的なアクセス可能性に基づいている。 GFPは、細胞内小器官の内腔に存在することにより、タンパク質分解から保護されているか、細胞質ゾル中に存在することにより、タンパク質分解にさらされているかどうかに応じ。目的のタンパク質にGFP部分は細胞質に面している場合このように、それはにさらされるプロテアーゼ活性および蛍光シグナルが失わ。目的のタンパク質にGFP部分は（そのようなゴルジ内腔など）プロテアーゼから「保護された「環境に直面している場合には逆に、その後蛍光シグナルが持続します。
プロテアーゼが細胞に侵入することができますが、コレステロール結合薬物ジギトニンが使用されている細胞内膜コンパートメントを入力しないでください。コレステロールは、脊椎動物における支配的なステロールであり、具体的には細胞内区画に対する原形質膜に富んでいる。グリコシド毒素は、ジギトニンは、植物ジギタリスプレアから抽出される。ジギトニンは、選択膜permeabiliztion 14,16（ 図1）に導くコレステロールリッチな膜に対する親和性を有する。小さな細胞質ゾル成分の排出を可能にすることに加えて、ジギトニン透過化はまた、プロテイナーゼKまたはトリプシンなどの外因性分子の侵入を可能にする。 FPPプロトコルは、FACを利用しています原形質膜は、細胞コレステロール17の80％まで含んでtは、そのような非常に低いコレステロール含有量を有し、ER、ゴルジ体、エンドソーム、ミトコンドリアなどの他の細胞小器官、一方、無傷のままである14。原形質膜へのコレステロールの選択的な取り込みは、Sのような多様な真核生物種においてジギトニン依存性血漿膜透過の使用を可能にする、多くの真核細胞において観察されている人間14,18に出芽酵母 。 FPPアッセイは、（a）は、タンパク質が膜結合/または関連する細胞質ゾルおよび膜タンパク質の（b）の領域で自由に拡散可能であるかどうか、サイトゾルまたは細胞小器官の内腔に面する決定する、簡単、迅速、かなり強固な手段を提供する。膜タンパク質は、複数の方向を持っている必要があり、信号が支配的なフォームから生じることになるとマイナー形式は検出されません。関心上のタンパク質にGFP部分の付加は、その機能に影響を与え得るという懸念があり得るしながら/または細胞内局在、これは実際よりも実際はより理論的です。実際、多くの研究は、GFPタグがタンパク質19,20の特性を変更しないことを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
膜タンパク質の正しい配向及びトポロジーは、その適切な機能のために不可欠である。膜タンパク質トポロジーを理解することの重要性にもかかわらず、そのようなデータが完全に欠けている多くのタンパク質が存在する。 FPPは、簡単かつ効率的な膜タンパク質のトポロジを決定する方法であり、最も研究室で行うことができるものを提供する。 FPPのアプローチは、タンパク質のトポロジ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.
Materials
| Name | Company | Catalgue Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
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