प्रतिदीप्ति Protease सुरक्षा का उपयोग झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी निर्धारण (FPP)
Summary
Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.
Abstract
The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.
Introduction
प्लाज्मा झिल्ली, साथ ही कई intracellular झिल्ली, दो जलीय डिब्बों को अलग बाधाओं के रूप में सेवा करते हैं। प्लाज्मा झिल्ली के मामले में, जुदाई के बाहर के बीच और सेल के अंदर है; intracellular organelles के लिए यह कोशिका द्रव्य और organelle लुमेन के बीच है। उदाहरण के लिए, endoplasmic जालिका (ईआर) झिल्ली पर्यावरण एक कम करने के लिए एक साइटोसोलिक से ईआर के लुमेन के भीतर एक ऑक्सीकरण वातावरण अलग करती है। झिल्ली प्रोटीन ईआर जुड़े राइबोसोम पर संश्लेषित, और ईआर झिल्ली 2 के भीतर अपने अंतिम टोपोलॉजी को प्राप्त कर रहे हैं। प्रोटीन के लिए उपयुक्त झिल्ली अभिविन्यास और टोपोलॉजी के अधिग्रहण के अपने सामान्य कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। सही टोपोलॉजी उनके बाध्यकारी भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए झिल्ली प्रोटीन के प्रासंगिक डोमेन के लिए अनुमति देता है, यह महत्वपूर्ण बाद translational संशोधनों घटित करने की अनुमति देता है, और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के मामले में सेल के साथ बातचीत और टी प्रतिक्रिया करने की अनुमति देता हैअपने पर्यावरण ओ। पूरी तरह से एक झिल्ली प्रोटीन के समारोह की सराहना करने के लिए, यह है कि प्रोटीन यह रहता है जो भीतर की झिल्ली, यानी, अपनी झिल्ली टोपोलॉजी के लिए सम्मान के साथ उन्मुख है कैसे पता करने के लिए स्पष्ट रूप से आवश्यक है। झिल्ली प्रोटीन औषधीय लक्ष्य 3 के बहुमत शामिल के बाद से एक प्रोटीन की सतह के पहलुओं को अलग वातावरण के संपर्क में रहे एक झिल्ली प्रोटीन और जो टोपोलॉजी को समझने के बुनियादी वैज्ञानिक ज्ञान के अधिग्रहण के अलावा, नैदानिक निहितार्थ के रूप में चिह्नित किया गया है। अभी हाल तक, समय और पैसे में काफी निवेश की आवश्यकता है या से आने के लिए मुश्किल हो जाता है कि अभिकर्मकों की आवश्यकता है झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण।
दोनों प्रयोगात्मक और सिलिको में दृष्टिकोण प्लाज्मा झिल्ली के भीतर रहने वाले प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया है। व्यक्तिगत का मूल्यांकन किया है hydrophobicity पर आधारित झिल्ली फैले डोमेन की पहली भविष्यवाणियों के बाददोहरी अमीनो एसिड 3, कई भविष्य कहनेवाला एल्गोरिदम अब इंटरनेट पर उपलब्ध हैं, और बस प्रोटीन अमीनो एसिड अनुक्रम के ज्ञान की आवश्यकता होती है। हालांकि, मान्यताओं अक्सर टोपोलॉजी 4,5 की गलत कार्य करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि इस तरह की मॉडलिंग कार्यक्रम, मान्यताओं के लिए केंद्रीय हैं। इन कंप्यूटर आधारित भविष्यवाणियों अंतरिम रूप से झिल्ली फैले क्षेत्रों प्रदान कर सकते हैं, जबकि इसके अलावा, वे हमेशा अमीनो या प्रोटीन की carboxy टर्मिनी organelle लुमेन या सेल बाहरी, कोशिका द्रव्य में हैं कि क्या यह निर्धारित नहीं है। कम्प्यूटेशनल शक्ति में वृद्धि हुई है, और यहां तक कि साथ मशीन सीखने एल्गोरिदम 6, इस तरह के डेटा का उपयोग अभी भी एक मॉडल है, और प्रयोगात्मक अधिग्रहीत डेटा का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए। झिल्ली टोपोलॉजी के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक दृढ़ संकल्प उनके immunoreactivity के मूल्यांकन से पहले और सेल permeabilization के बाद किया गया है, जहां प्रोटीन, भर में वितरित जाना जाता epitopes साथ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पैनल का उपयोग किया गया है। यहदृष्टिकोण ब्याज की प्रोटीन के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता जो एंटीबॉडी का एक सेट की आवश्यकता है।
एक वैकल्पिक रणनीति फिर से पहले और झिल्ली permeabilization के बाद immunoreactivity के निर्धारण के द्वारा पीछा प्रोटीन भर में विभिन्न स्थानों में MYC या hemagglutinin (हा) के रूप में इस तरह के मिलान टैग करने के लिए इंजीनियर है। Immunogenic टैग के अलावा, और इस तरह के सिस्टीन स्कैनिंग के रूप में रासायनिक संशोधनों (क्षारीय β -galactosidase फॉस्फेट, या β lactamase-सहित) एंजाइमी टैग सभी झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी 7,8 निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया है। प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के topological मानचित्रण के लिए कार्यरत एक अतिरिक्त विधि मिलान टैग करने के लिए एक अलग दृष्टिकोण पर निर्भर करता है। इस विधि में टैग अनुक्रम एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन आम सहमति अनुक्रम NXS / टी है। इस तरह के दृश्य biosynthetic मार्ग, एक luminal बनाम में टैग की उपस्थिति के लुमेन में मौजूद है जब ग्लाइकोसिलेशन ही होता हैएक साइटोसोलिक डिब्बे आसानी से एसडीएस पृष्ठ जैल पर एक जन बदलाव के रूप में मनाया जाता है। इस तरह के एक दृष्टिकोण multispanning आयन चैनल CFTR 9 करने के लिए लागू किया गया है। इन सभी दृष्टिकोणों उपयोग किया गया है, वहीं यह है कि वे सभी पैदा करते हैं और कई गुना निर्माणों दृश्य के लिए आणविक जीव विज्ञान में काफी निवेश की आवश्यकता है कि स्पष्ट है।
Intracellular organelles के भीतर स्थित transmembrane प्रोटीन के बारे में topological जानकारी निर्धारित करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है। प्रतिदीप्ति आधारित प्रौद्योगिकियों के अनुप्रयोग हालांकि, झिल्ली टोपोलॉजी एक बहुत सरल का दृढ़ संकल्प किया है। bimolecular प्रतिदीप्ति complementation की तकनीक (BiFC) प्रोटीन है कि 10 के फ्लोरोसेंट गुणों को बहाल करने, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़ों के बीच बातचीत पर निर्भर करता है। शुरू में विवो 10 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का निर्धारण करने के लिए वर्णित हालांकि, इस दृष्टिकोण भी उपयोग किया गया हैसंयंत्र कोशिकाओं 11 में झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी निर्धारित करने के लिए। हालांकि इस दृष्टिकोण यह ब्याज की प्रोटीन, लेकिन यह भी साइटोसॉल या organelle लुमेन के लिए लक्षित संलयन प्रोटीन की एक किस्म के साथ संलयन प्रोटीन की न केवल पीढ़ी की आवश्यकता के रूप में गहन समय भी है, और ब्याज में रहता है के intracellular प्रोटीन झिल्ली जिनमें से ज्ञान की आवश्यकता है ।
झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक सरल दृष्टिकोण 12 में वर्णित किया गया है। परख, प्रतिदीप्ति Protease संरक्षण (FPP) GFP और ब्याज की जीन के बीच एक संलयन प्रोटीन की पीढ़ी की आवश्यकता है। दृष्टिकोण GFP के आधा भाग को गैर विशिष्ट प्रोटिएजों के रिश्तेदार पहुंच पर आधारित है; चाहे GFP के आधार पर intracellular organelles के लुमेन में रहने से प्रोटियोलिसिस से सुरक्षित है या cytosol में उपस्थित होने से प्रोटियोलिसिस से अवगत कराया है। ब्याज की प्रोटीन पर GFP के आधा भाग कोशिका द्रव्य के चेहरे इस प्रकार, यदि यह उजागर किया जाएगाप्रोटीज गतिविधि और प्रतिदीप्ति संकेत खो दिया है। ब्याज की प्रोटीन पर GFP के आधा भाग (जैसे गोल्गी लुमेन के रूप में) प्रोटीज से एक वातावरण 'संरक्षित' चेहरे विपरीत, यदि फिर प्रतिदीप्ति संकेत रहेंगे।
प्रोटिएजों सेल में प्रवेश करने की अनुमति है, लेकिन कोलेस्ट्रॉल बाध्यकारी दवा digitonin प्रयोग किया जाता है intracellular झिल्ली डिब्बों में प्रवेश नहीं करने के लिए। कोलेस्ट्रॉल रीढ़ में प्रमुख स्टेरोल है, और विशेष रूप से intracellular डिब्बों के सापेक्ष प्लाज्मा झिल्ली में समृद्ध है। ग्लाइकोसाइड विष, digitonin, संयंत्र डिजिटालिस Purpurea से निकाला जाता है। Digitonin यह 14,16 (चित्रा 1) permeabiliztion चयनात्मक झिल्ली की ओर जाता है, जहां कोलेस्ट्रॉल अमीर झिल्ली के लिए एक आकर्षण है। छोटे साइटोसोलिक घटकों के बाहर निकलने की इजाजत देने के अलावा, digitonin permeabilization के भी ऐसे proteinase कश्मीर या trypsin रूप बहिर्जात अणुओं का प्रवेश परमिट। FPP प्रोटोकॉल कारकों का लाभ लेता हैप्लाज्मा झिल्ली ऐसे ईआर के रूप में अन्य अंगों, जबकि, गोल्गी, endosomes, बहुत कम कोलेस्ट्रॉल सामग्री है जो माइटोकॉन्ड्रिया, 14 बरकरार रहेगा, सेलुलर कोलेस्ट्रॉल 17 से 80% तक होता है कि टी। प्लाज्मा झिल्ली में कोलेस्ट्रॉल के चुनिंदा समावेश एस जैसे विविध यूकेरियोटिक प्रजातियों में digitonin निर्भर प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के उपयोग की अनुमति है, कई कोशिकाओं में देखा गया है मानव 14,18 को cerevisiae। FPP परख (क) एक प्रोटीन झिल्ली बाध्य / एसोसिएटेड या साइटोसॉल और एक झिल्ली प्रोटीन (ख) जो डोमेन में स्वतंत्र रूप से प्रसारण है कि क्या साइटोसॉल या organelle लुमेन के चेहरे का निर्धारण करने का एक सरल, तेजी से और काफी मजबूत साधन प्रदान करता है। एक झिल्ली प्रोटीन कई झुकाव होना चाहिए, संकेत प्रमुख रूप से पैदा होगा और छोटे रूपों पता नहीं होगा। ब्याज पर प्रोटीन के लिए एक GFP आधा भाग के अलावा अपने कार्य को प्रभावित कर सकता है कि कुछ चिंता का विषय हो सकता है और/ या subcellular स्थानीयकरण, इस वास्तविक तुलना में वास्तव में अधिक सैद्धांतिक है। वास्तव में कई अध्ययनों से स्पष्ट रूप से GFP टैग प्रोटीन 19,20 के गुणों को बदल नहीं है कि पता चला है।
Protocol
Representative Results
Discussion
झिल्ली प्रोटीन की सही ओरिएंटेशन और टोपोलॉजी उनकी समुचित कार्य के लिए आवश्यक है। झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी समझने के महत्व के बावजूद, इस तरह के डेटा को पूरी तरह से कमी है, जिसके लिए कई प्रोटीन होते हैं। FPP ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.
Materials
| Name | Company | Catalgue Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
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