Introduction
形質膜、ならびに多数の細胞内膜二水性区画を分離する障壁として機能する。原形質膜の場合には、分離は、外部との間で、セルの内部にある。細胞内小器官のためには、細胞質および細胞小器官の内腔の間である。例えば、小胞体（ER）膜は、環境1を減少させる、サイトゾルからERのルーメン内酸化環境を分離する。膜タンパク質は、ER関連リボソーム上で合成され、ER膜2内の最終的なトポロジを達成している。タンパク質のための適切な膜配向とトポロジの買収は、彼らの正常な機能のために重要である。正しいトポロジーは、膜タンパク質の関連ドメインは、その結合パートナーと相互作用することができ、それは重要な翻訳後修飾が起こることができ、そして原形質膜タンパク質の場合、細胞と相互作用し、tは対応することができその環境をoを完全膜タンパク質の機能を理解するために、そのタンパク質は、それが含まれている膜、 すなわち 、その膜トポロジーに対して配向されているかを知ることが明らかに必須である。基本的な科学的知識の獲得に加えて、膜タンパク質のトポロジーを理解し、そのタンパク質表面の態様は異なる環境にさらされている膜タンパク質の薬理学的標的3の大部分を構成するので、臨床的意味をマークした。最近まで、時間とお金にかなりの投資を必要としていたか、手に入れるのが困難な試薬を必要とした膜タンパク質のトポロジーを決定することに近づく。
両方の実験とin silicoでのアプローチは、原形質膜内に存在するタンパク質の膜トポロジーを決定するために使用されてきた。 INDIVIの評価を疎水性に基づく膜貫通ドメインの最初の予測ので、デュアルアミノ酸3、多数の予測アルゴリズムは、インターネット上で現在利用可能であり、単に、タンパク質のアミノ酸配列の知識を必要とする。しかし、仮定は、多くの場合、そのようなモデリングプログラム、トポロジー4,5の不正確な割り当てにつながる可能性の仮定の中心である。これらのコンピュータベースの予測が暫定的に膜貫通領域を割り当てることができますしながら、また、彼らは常に、アミノまたはタンパク質のカルボキシ末端は細胞小器官内腔または細胞外装、細胞質内にあるかどうかを判断しないでください。計算能力を増加させ、さらにはと機械学習アルゴリズム6、そのようなデータの使用は、まだモデルであり、実験的に取得したデータを使用して検証する必要があります。膜トポロジーの直接の実験的決定は、その免疫反応性の評価は、細胞透過処理の前と後に行われているタンパク質、全体に分散既知のエピトープを有するモノクローナル抗体のパネルを使用して行われている。このアプローチは、目的のタンパク質のために利用できない場合があり、抗体のセットを必要とする。
別の戦略は、再び膜透過化の前と後の免疫反応性の決定に続いて、タンパク質の様々な場所にかかるのmycまたは赤血球凝集素（HA）などのエピトープタグを操作することである。免疫原性タグ、酵素タグ（アルカリホスファターゼを含む、βガラクトシダーゼ、またはβラクタマーゼ）に加えて、そのようなシステインスキャニングのような化学修飾は、すべての膜タンパク質トポロジー7,8を決定するために使用されてきた。原形質膜タンパク質のトポロジーマッピングのために使用するさらなる方法は、エピトープタグにわずかに異なるアプローチに依存している。この方法において、タグ配列は、N結合型グリコシル化コンセンサス配列NXS / Tである。そのような配列は、生合成経路のルーメン内に存在する場合、グリコシル化は、対管腔におけるタグの存在、発生するので細胞質ゾル区画に容易SDS-PAGEゲル上の質量シフトとして観察される。このようなアプローチは、multispanningイオンチャネルCFTR 9に適用されている。これらのすべてのアプローチが利用されてきたが、それらはすべてマニホールド構築物を作製し、配列決定するために分子生物学においてかなりの投資を必要とすることは明らかである。
細胞内小器官内に配置された膜貫通タンパク質に関するトポロジ情報を調べるには、より挑戦的であることが判明した。蛍光ベースの技術の適用は、しかしながら、多くの単純な膜トポロジーの決定をした。二分子蛍光相補性（BIFC）の技術がそのタンパク質10の蛍光特性を復元する、蛍光タンパク質の二つの非蛍光フラグメントとの相互作用に依存しています。最初に、生体内 10 でのタンパク質-タンパク質相互作用を決定するために説明したが、このアプローチは、利用されている植物細胞11内の膜タンパク質のトポロジーを決定する。しかし、このアプローチは、目的のタンパク質だけでなく、細胞質ゾルまたは細胞小器官の管腔を標的とする種々の融合タンパク質との融合タンパク質だけでなく生成を必要とする時間集約的でもあり、関心が常駐の細胞内タンパク質をメンブレンそれらの知識を必要とする。
膜タンパク質のトポロジーを決定する代わりに単純なアプローチは、12に記載されている。アッセイ、蛍光プロテアーゼ保護（FPP）は、GFPと目的の遺伝子との間の融合タンパク質の生成を必要とします。アプローチは、GFP部分への非特異的プロテアーゼの相対的なアクセス可能性に基づいている。 GFPは、細胞内小器官の内腔に存在することにより、タンパク質分解から保護されているか、細胞質ゾル中に存在することにより、タンパク質分解にさらされているかどうかに応じ。目的のタンパク質にGFP部分は細胞質に面している場合このように、それはにさらされるプロテアーゼ活性および蛍光シグナルが失わ。目的のタンパク質にGFP部分は（そのようなゴルジ内腔など）プロテアーゼから「保護された「環境に直面している場合には逆に、その後蛍光シグナルが持続します。
プロテアーゼが細胞に侵入することができますが、コレステロール結合薬物ジギトニンが使用されている細胞内膜コンパートメントを入力しないでください。コレステロールは、脊椎動物における支配的なステロールであり、具体的には細胞内区画に対する原形質膜に富んでいる。グリコシド毒素は、ジギトニンは、植物ジギタリスプレアから抽出される。ジギトニンは、選択膜permeabiliztion 14,16（ 図1）に導くコレステロールリッチな膜に対する親和性を有する。小さな細胞質ゾル成分の排出を可能にすることに加えて、ジギトニン透過化はまた、プロテイナーゼKまたはトリプシンなどの外因性分子の侵入を可能にする。 FPPプロトコルは、FACを利用しています原形質膜は、細胞コレステロール17の80％まで含んでtは、そのような非常に低いコレステロール含有量を有し、ER、ゴルジ体、エンドソーム、ミトコンドリアなどの他の細胞小器官、一方、無傷のままである14。原形質膜へのコレステロールの選択的な取り込みは、Sのような多様な真核生物種においてジギトニン依存性血漿膜透過の使用を可能にする、多くの真核細胞において観察されている人間14,18に出芽酵母 。 FPPアッセイは、（a）は、タンパク質が膜結合/または関連する細胞質ゾルおよび膜タンパク質の（b）の領域で自由に拡散可能であるかどうか、サイトゾルまたは細胞小器官の内腔に面する決定する、簡単、迅速、かなり強固な手段を提供する。膜タンパク質は、複数の方向を持っている必要があり、信号が支配的なフォームから生じることになるとマイナー形式は検出されません。関心上のタンパク質にGFP部分の付加は、その機能に影響を与え得るという懸念があり得るしながら/または細胞内局在、これは実際よりも実際はより理論的です。実際、多くの研究は、GFPタグがタンパク質19,20の特性を変更しないことを示している。
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Protocol
蛍光タンパク質キメラの1の生成と検証
- 標準的な組換えDNA戦略13を用いて目的のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に緑色蛍光タンパク質（GFP）を追加。
注：我々は広範囲にGFPを用いているが、このようなシアン蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）などの他の変異体は、DsRedのとmCherryを用いることができる。フォアフォールディング効率、明るさと光安定性の改善は、絶えず行われている、と研究者らは、最新世代の構築物の彼ら自身を利用すべき。- 正しいDNA配列を確認し、GFP部分は、目的のタンパク質とインフレームであることを確認してください。標準的な組換えDNA戦略21を使用してシークエンシングを行います。
注：多くの機関は、調査員が、追加情報のために連絡することが奨励されているコアDNA施設を、持っている。 - シングルまたはダブルパス膜タンパク質生成融合タンパク質19のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方のバージョン。
- マルチ貫通タンパク質の推定膜外ループ内のGFPのほか、末端を挿入します。タンパク質は、ERトランスロコンを通過した後の信号系列は、しばしば、タンパク質分解によって切断されるように、標的タンパク質のアミノ末端に結合した蛍光融合タンパク質を有する膜貫通キメラを生成する際に特別な注意を払う。
- インタクトなアミノ末端タグ付き蛍光タンパク質を含む成熟タンパク質を生成するために、現存のシグナル配列の場合には、切断部位の蛍光融合タンパク質先端を挿入。キメラ21を生成するための標準的な組換えDNA戦略を採用する。
- 正しいDNA配列を確認し、GFP部分は、目的のタンパク質とインフレームであることを確認してください。標準的な組換えDNA戦略21を使用してシークエンシングを行います。
- 関心の細胞株で十分適切にローカライズされた蛍光シグナルの存在を決定する。
- appropriの下でGFPの固有の蛍光を用いて、エピ蛍光顕微鏡で細胞を観察するフィルタ設定された条件を食べました。 510から560 nmのを包含するGFPフィルターセットの場合、正しいフィルターを採用フォアのために使用されていることを確認。
注：目で評価は信号が存在する中で細胞構造を簡単に背景の上に解決されていることを十分に強い信号を提供する際に十分な信号が達成される。さらに、GFPタンパク質の染色パターンは、適切な細胞小器官のマーカーのそれと一致し、ネイティブのタグなしタンパク質のものと好ましくは同一である必要があります。
- appropriの下でGFPの固有の蛍光を用いて、エピ蛍光顕微鏡で細胞を観察するフィルタ設定された条件を食べました。 510から560 nmのを包含するGFPフィルターセットの場合、正しいフィルターを採用フォアのために使用されていることを確認。
- 安定または一過性トランスフェクションアプローチが評価されているタンパク質に基づいて利用されるかどうかを決定します。
注：安定なトランスは、一般的に一過性のシステムよりも低レベルの発現を与える。一過性発現は、タンパク質の高レベルの発現を生じ、信号強度（タンパク質依存〜5-24時間後にトランスフェクション）を増加させるが、それはまた、タンパク質AGGRとして過剰発現アーチファクトにつながる可能性誤った細胞内局在につながる経路を標的にタンパク質のegationや彩度。
細胞および細胞培養の2トランスフェクション
注：種々の細胞が14 HEK293、HeLa細胞、COS-7およびCHO細胞を含む、FPP分析に適している。以下の説明は、Hek293細胞での膜タンパク質の発現に基づいている。
- 5％ウシ胎児血清（FBS）、1％ピルビン酸ナトリウム、および37℃で250 / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、6mlの中の付着単層として、ヒト胚性腎細胞（HEK293）を成長さ5％CO 2 C。層流の組織培養フード内のセルのすべての作業を行う。 T-75フラスコ中〜80％コンフルエントになるまで培養液中で細胞を増殖させる。
- transienを生成するために、脂質を含む、任意の標準的な高効率、低毒性のトランスフェクション法、ウイルス - またはエレクトロポレーションベースの技術を使用して、トランスフェクト細胞Tまたは安定発現。通常、1×10 6細胞あたりのプラスミドDNA2μgの良い再現性のあるタンパク質の発現を提供します。 CO 2が可能な組織培養インキュベーターにおいて37℃で適切な組織培養培地で5-48時間、細胞を維持する。
- 製造業者のプロトコルに従って、適切なフィルターセットを用いて、GFPの固有の蛍光シグナルを使用して、落射蛍光顕微鏡を用いてGFP融合タンパク質の発現のために細胞をモニターする。蛍光シグナルは通常、トランスフェクション後24〜72時間以内に最大値に達する。蛍光信号が最大レベルに達したときに細胞を使用する。目的のタンパク質またはGFP部分のいずれかに対する抗体を用いたイムノブロット分析によってタンパク質発現レベルをモニターする。
- コーティングされたカバースリップ上の実験解析プレート細胞について。どちら生細胞構成または以下の固定の下に表示し、顕微鏡スライド上にマウントします。プレートの細胞が24-48時間以内に60％-80％のコンフルエンスを達成するために。
- 全面を覆うようにポリリジン溶液（0.1 mg / ml）で、でコーティングしたカバー。 37℃で細胞培養インキュベーター中で60分間、続いて室温で紫外光下で30分間、インキュベートする。過剰ポリリジンを削除し、PBS中でカバーグラスを3回すすいでください。
- あるいは、油浸対物レンズとの直接撮像を可能にする光学ガラス底細胞培養プレートからなるチャンバーカバーグラス上に細胞をプレー。実際の顕微鏡のセットアップは研究者に利用可能な機器に依存しますが、迅速なソリューションの変更が可能であるべきである。細胞型および細胞の形状に応じて、細胞は、FPPアッセイの時点で約60〜90％コンフルエントであるべきである。
3.蛍光顕微鏡のセットアップ
- そのような60X、1.42 NA油浸対物レンズとして最大のシグナル収集および空間分解能、用の高開口数（NA）油浸対物レンズを使用してください。目を使用してください蛍光団を刺激するE以下のレーザー：アルゴンガスを488nm（GFP及びYFP）と561ダイオード（RFP、mCherryを）。
- 各構築物のための画像の最適な露出、ゲイン、キャプチャレートを決定する。 （ステップ7.1.2を参照）を光退色最小限にするためにレーザー強度と露光時間を調整します。
- 複数のフルオロフォア（ 例えば 、膜タンパク質マーカーと協調膜透過のための可溶性マーカー）を用いた研究のために、信号のクロストークを最小限にし、信号対雑音比を最大にするために適切なフィルターセットを選択する。
4.細胞膜透過化のための最適条件を確立する
- （ 例えば EGFP、DsRedの）唯一の可溶性の蛍光タンパク質を発現する細胞からの細胞培養培地を除去します。 KHM緩衝液（110 mMの酢酸カリウム、3mMのMgCl 2を 、20mMのHEPES-NaOHでpH7.2）中で細胞を3回（各1分）で洗浄する。室温で細胞およびすべての試薬を用いた実験を行います。
- 場所細胞Onはカバーガラスは、蛍光顕微鏡ステージ上KHMバッファー（ステップ2.4参照）、コントロールの非透過化」段階を表す第一の画像を収集する。
- 選択的に、原形質膜を透過性にするために、細胞にKHMバッファにジギトニン（30μM）を加える。 10-60秒間5ml /分の速度で、バッファ（バッファ+ジギトニン）で細胞を灌流。
- 徐々にジギトニンの濃度を高めることにより、最適なジギトニン濃度を決定します。ジギトニンアプリケーションの10~60秒以内可溶性EGFPからの蛍光シグナルの完全な損失がある場合に最適なジギトニン濃度が達成される。多くの細胞については10〜50μMのジギトニンの適用は、細胞膜を透過するのに十分である。
- すべてのアプリケーションがジギトニンの可能な限り低い濃度を使用してください。透過化バックグラウンド信号のための透過処理をジギトニン後の画像を収集します。
- 関心のGFP-タンパク質キメラが内膜であることを確認してください原形質膜16のジギトニン透過化以下の蛍光シグナルの細胞の保持を確認することによりtegrated。
- オルガネラ特異的蛍光タンパク質23を発現する。ミトコンドリアタンパク質は、 例えばこの点16、、pDsRed2-水戸ベクターにうまく機能します。ステップ2.1で説明したように最適な発現条件を決定する。
- ジギトニン濃度が長期化にわたって細胞内小器官の形態は（60分まで）ジギトニンへの暴露一定のままであることを保証することによって、使用される細胞タイプに適切であることを確認します。
注：そのようなリソソームなどの様々な細胞コンパートメント、に対する抗体を用いて使用する標準免疫蛍光顕微鏡プロトコル（ 例えば 、LAMP1）、ゴルジ（ 例えば 、TGN38）、小胞体（ 例えば 、カルネキシン）、エンドソーム（ 例えば 、Rab5の）、ミトコンドリア（ 例えば 、チトクロームc）の細胞内小器官の形態/整合性は飛躍的にオベ変更された場合rは60分には、ジギトニン濃度が高すぎる可能性があり、及びジギトニンの濃度および/または露光時間の減少を必要とする。
注：ジギトニンは吸入および皮膚接触による有毒である。適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。
蛍光タンパク質の5プロテアーゼトリートメント
- KHMバッファに細胞を洗浄した後、プロテアーゼ（プロテイナーゼK、KHMバッファ中に50μg/ mlの）を追加し、直接細胞に。連続的に製造が風呂重力供給灌流システムを用いて5ml /分の流量で細胞を灌流する。
- 50ミリリットル注射器に保管してソリューションとポリエチレン管を浴（5ミリリットル/分の流量）で、単一の出口でマニホールドに独立したリザーバを接続。定数（0.5 ml）を、浴容量を維持し、手動で灌流リザーバとを切り替えて溶液交換を達成するために、位置吸引ピペット。
- フッ素かどうかを判断するために画像を収集escent信号が持続するか、低下します。 30〜60秒を超える初期信号強度の> 90％の損失がGFPタンパク質キメラのタンパク質分解と一致している（代表的な結果を参照）。
- 無信号劣化がプロテイナーゼKで観察されていない場合、そのような損失が予想される場合、KHM緩衝液中のトリプシン（4-8 mM）を有するプロテイナーゼK溶液を置き換える。必要に応じて、プロテイナーゼK、トリプシンの混合物を利用する。プロテアーゼ活性をクエンチする必要はない。
外部ドメインとプラズマ膜タンパク質6.別のアプローチ
- 細胞膜のタンパク質について、透過処理をジギトニン前に外部の蛍光タンパク質キメラのためのアッセイを行う。 KHM緩衝液中のカバースリップ上の細胞（5 ml /分×3分間）洗浄し、そしてプレプロテアーゼ治療のための画像を取得し、ステップ7のようにプレプロテアーゼ蛍光シグナルを定量化する。
- トンで、（KHMバッファ中に50μg/ mlまたはトリプシン4-8 mMのプロテイナーゼK）をプロテアーゼ細胞を公開KHM培地を含むプロテアーゼ（流速5ml /分）で細胞を灌流することによりジギトニン彼が不在。信号が消えるどのように迅速または信号が持続する時間を決定するために、蛍光タンパク質の画像を収集。
- ジギトニン透過化の前に、10％血清（FBS）を含有する細胞培養培地中で細胞を3回（各1分）で洗浄することにより、すべてのプロテアーゼ活性をクエンチする。
- 2分間KHM緩衝液（5ml /分の流量）で灌流して細胞を洗浄する。前の透過化画像を取得。ステップ4で説明したように細胞膜を透過。
- 手順5で説明したようにプロテアーゼを添加した後の画像を収集します。
7.画像解析
- 蛍光シグナルの損失がリアルタイムでモニターすることができる「生細胞」記録が可能な倒立顕微鏡を使用する。継続的なモニタリングのために、同一のパラメータ（露光時間、ゲイン、レーザ強度など ） を採用する。
- EXPERを決定対照条件下で、目的のGFPタンパク質からの蛍光シグナルを観察することによりimentalパラメータ（ すなわち 、KBHは緩衝液単独）。 10〜20分間かけて信号強度の感知できる損失がないことを保証するためにコンピュータ駆動顕微鏡ゲイン、レーザ強度及び露光時間の設定を調整する。
注：信号強度は、絶対値ではなく、顕微鏡システムと各PIに対する利用可能な設定に基づいている。相対的な蛍光強度の変化を監視する。
- EXPERを決定対照条件下で、目的のGFPタンパク質からの蛍光シグナルを観察することによりimentalパラメータ（ すなわち 、KBHは緩衝液単独）。 10〜20分間かけて信号強度の感知できる損失がないことを保証するためにコンピュータ駆動顕微鏡ゲイン、レーザ強度及び露光時間の設定を調整する。
- また、プロテアーゼが続くジギトニンでの設定の時点で細胞を処理し、事前のイメージングのためのカバーガラスに取り付けるに細胞を固定。ジギトニンまたはプロテアーゼの0、30、60、120と300秒後添加で開始し、経験的に初期調査のためのステップ4と5の手順を以下の時点を決定します。
- 細胞（室温で20分）で完全に目を沈めるために十分な量の固定液（PBS中の3.7％パラホルムアルデヒド）を用いて固定する電子セル。
- PBSは、20 mMグリシン（3×5分）を含有する細胞をすすぐことによって、残留ホルムアルデヒドを急冷。
- カバーガラスから余分な液体を除去し、ガラス顕微鏡で50μlの取り付けメディアにカバースリップを反転させることによってマウントカバースリップは、撮影のためにスライドします。スライドを画像化する前に一晩乾燥することができます。
- コンピューター制御蛍光顕微鏡でビデオ画像キャプチャ機能を使用して（適切なフィルタの下で使用されるフルオロフォアと互換設定）の蛍光顕微鏡画像を収集する。
- インキュベーション条件の関数としての蛍光シグナル強度を定量化する。個々のセルを囲む関心領域内の平均ピクセル強度（ROI）を取得します。
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Representative Results
細胞膜透過処理
効率的な形質膜透過化は、可溶性の蛍光タンパク質（ 例えば 、GFP、DsRedを）する（ステップ4）を用いて決定される。これらのタンパク質は、細胞内で発現された場合、細胞質ゾル中で自由に拡散しており、原形質膜が（ 図2）を用いてジギトニン透過処理されたときに失われる。蛍光シグナルの完全な消失は、ジギトニンアプリケーションの10〜60秒以内に発生する必要があります。目的のタンパク質は、細胞内小器官に関連していることの確認は、ジギトニン透過化以下の蛍光信号の保持を記録することによって達成される。
プロテアーゼトリートメント
細胞中の蛍光タンパク質の関心対象のタンパク質と蛍光タンパク質（GFP、YFP など ）（工程1）及び発現との間の蛍光キメラ生成の成功に続いて（ステップ2）、治療プロテアーゼによる透過性化細胞の蛍光団（とそれに隣接するタンパク質ドメイン）は、プロテアーゼ消化するために、サイトゾルおよびアクセス可能であるか、または細胞小器官の内腔内に位置するため、プロテアーゼ消化（工程4）から保護されているか否かに関する情報を提供する。 LMTK2は膜結合キナーゼ15であり、かつ蛍光プロテアーゼ保護アッセイは、膜トポロジー16を決定するために使用されている。 LMTK2のカルボキシルテールは、GFPに融合し、一過性に発現させた。蛍光LMTK2-GFPシグナルは、細胞質ゾル（ 図3）内に配置さLMTK2のカルボキシル末端の位置を示す、プロテイナーゼKの添加後に急速に失われた。カベオリンGFP（CAV1-GFP）17は、細胞質ドメインに接続GFP-部分を有する原形質膜タンパク質である。 LMTK2と同様に、カベオリンYFPからの信号を区別しないジギトニンれるが、プロテアーゼのその後の添加（ 図3）に敏感。
トン ">管腔可溶性タンパク質はまた、FPPプロトコルを使用して同定することができる。この例では、ER保持シグナルKDELをDsRedのに追加される。LMTK2及びカベオリンからの信号とは対照的には、KDEL-DsRedのからの信号は、両方の影響を受けないジギトニン及びプロテアーゼ、ジギトニンがER膜を透過することができず、蛍光シグナルをプロテアーゼ分解から保護されるように、細胞小器官の内腔内に位置する膜ドメインの例はミトコンドリアタンパク質によって与えられる、ヒトシトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIIIであり18,19。pDsRed-ミットは、 ディスコソマ（Discosoma）種由来の赤色蛍光タンパク質。シトクロムcオキシダーゼの配列を標的ミトコンドリアに融合をコードしている。pDsRed-水戸を発現する細胞では、蛍光シグナルが細胞内に見られる。ジギトニン透過処理した後、蛍光シグナルpDSRed-水戸が安定した状態に関連付けられている。また、プロテイナーゼKの添加後、pDsRed-水戸に関連した蛍光は、詐欺を解決しないミトコンドリア及び細胞質ゾルに露出しないため、プロテアーゼ活性（ 図3）から保護におけるフルオロフォアsistent。細胞外ドメイン
非透過性細胞のプロテアーゼ処理は、急速膜タンパク質に結合した蛍光部分は、細胞外側に面している蛍光シグナルを消光すべきである。グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型タンパク質PrPの20は、優れた一例となる。プリオン（YFP-PRP）21,22、エルサレムのヘブライ大学から博士エフード·コーエンからの寛大な贈り物、のアミノ末端に結合黄色蛍光タンパク質（YFP）を含む構築。プロテアーゼ処理の前に、細胞外のYFPからの蛍光シグナルは、（ 図4）明るかった。プロテアーゼ処理の後、細胞外の蛍光シグナルは急速に消失した。
時間の検討
図1：細胞膜の選択的透過化実験プロトコルを経由する単一のセルを示すFPPアッセイの（a）の漫画のモデル。。赤い記号は、サイトゾル中の赤色蛍光タンパク質（RFP）を表し、緑及び青の記号は、細胞小器官の内腔（青）またはサイトゾル（緑色）に面するいずれかの蛍光タグを有する膜貫通タンパク質を表す。 （b）はジギトニン透過処理に続いて、自由な細胞質ゾルタンパク質は、RFP信号を低減離れて拡散する。青の信号が細胞小器官内腔におけるその存在による分解から保護されているのに対し、（c）のプロテイナーゼKの適用に続いて、細胞質ゾル緑信号は、分解される。
図2：ジギトニン処理は、原形質膜および細胞質ゾルリリースGFPを透過性に単一細胞の（a）は、漫画の前およびジギトニン処理した後、水溶性のGFPを発現する。 （b）は、ジギトニン処理は、原形質膜および細胞質ゾルリリースGFPを透過性に。関心領域（ROI）は、可溶性GFPを発現するCHO細胞の周りに描かれている。ジギトニン（50μM）での処理後の画像の前およびジギトニンを添加した後、指示された時点で採取した。スケールバーは10μm。 （c）は fluoreの定量完全な時系列（f）をscenceの強度が示されている。
図3：FPPは、エンドソームタンパクLMTK2のトポロジーを明らかに（a）の FPPの漫画は、DsRedの損失（赤ボール）が、ジギトニン透過化以下LMTK2-GFP（緑色のボール）の保持を示す、プロテイナーゼKの適用に関する信号損失が続く。 （b）は、のDsRedとLMTK2-GFPを発現するCHO細胞のFPPアッセイ。画像は前と示されているように、治療をジギトニン、およびプロテイナーゼKを以下の後に採取した。スケールバー：10μmである。
図4（a）の前に、プロテイナーゼK処理後のYFP-のPrP（緑色）のトポロジーと位置を示す漫画のモデル。発現するCHO細胞YFP-PRPを100秒間Kプロテイナーゼを行った。 （b）は、プロテアーゼ処理の前及び後に撮影画像が指示された時間に示されている。 YFP-PrPの信号は完全にジギトニン非存在下でのプロテアーゼ以下の失われた。関心領域（ROI）の黄色を示す領域（c）に示す定量に使用する。
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Discussion
膜タンパク質の正しい配向及びトポロジーは、その適切な機能のために不可欠である。膜タンパク質トポロジーを理解することの重要性にもかかわらず、そのようなデータが完全に欠けている多くのタンパク質が存在する。 FPPは、簡単かつ効率的な膜タンパク質のトポロジを決定する方法であり、最も研究室で行うことができるものを提供する。 FPPのアプローチは、タンパク質のトポロジーを決定するための以前の方法よりも有意な利点を提供する。例えば、再び関心31のタンパク質の様々なドメインを指向複数の抗体のパネルを有する必要はない。多くの場合、抗体のようなパネルは使用できません。これは、新たにクローン化されたタンパク質では特に顕著です。アッセイは単一細胞レベルで行うことができるように、下流の生化学は、タンパク質分解またはSDS-PAGEのように分析するために、タンパク質の大規模な生化学量が必要とされない。確かに、比較的少数のトランスフェクトされた細胞を明確に割り当てるために必要とされている目的のタンパク質にトポロジー。研究者はそのような上皮細胞や神経細胞などの細胞をトランスフェクトするのは難しいでトポロジーを評価している場合に重要です。タンパク質のカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかへのGFP部分の単純な添加は、容易にプラスミドを含む多数の市販のGFPを使用して達成することができ、ほとんどの場合、GFP部分の付加は、適切なタンパク質の折り畳みまたは細胞内局在を阻害しない。しかし、研究者は関心23,24のタンパク質に影響を与えるGFPの可能性があるので、これは、それらのタンパク質のために真であることを確認する必要があります。多くのタンパク質は、このように位相的な研究を開始するための最小限の追加の労力を必要とする、GFP融合タンパク質としてすでに利用可能です。蛍光の連続監視が住ん細胞、撮像装置へのアクセスを持っていない研究者のために、タンパク質のトポロジーを決定する迅速かつ効率的な手段を提供するが、このアッセイは、容易にホルムアルデヒド固定アプリに適合されている共焦点顕微鏡の標準落射蛍光を用いて、ゴキブリ。
FPPアッセイの適用性におけるいくつかの制限がしかしあります。処理すべきタンパク質分解、または他の翻訳後修飾は、目的のタンパク質のためわずかに異なる膜トポロジーをもたらす、FPPアッセイは、支配的なタンパク質形態を評価する。さらに、いくつかのタンパク質の末端にGFP部分を付加するカルボキシル末端PDZドメインと干渉する例えば、それらの機能に影響を与えることができる。それにもかかわらず、FPPアッセイは、多くの膜タンパク質の配向およびトポロジーを確立する簡単な方法を与える。
これは、最初の実験では、細胞内の可溶性GFPを放出するジギトニンの正確な濃度を決定するために実行することが重要である。 GFPは、ジギトニン適用後、細胞外に拡散していない場合、ジギトニンの濃度が最小濃度の再を決定するために、徐々に増加されるべきである解放を容易にするためにquired。しかし、あまりにも多くのジギトニンは整合性ジギトニンアプリケーション以下を確認する必要がある細胞内小胞、の形態に影響を与えます。いくつかの細胞内小器官は非常に敏感であり、それ以上の安定化緩衝液組成25が必要な場合があります。評価されているキメラからの蛍光シグナルが低い場合、より高い発現レベルを有する単一クローンを選択する、または一過性発現を行う、多くの場合に許容可能なレベルに信号強度を増加させる。新しいを探している、明るいプラスミドはまた低信号強度で考慮されるべきである。最後に、注意が見信号の損失は、プロテアーゼ分解に対してではなく、フルオロフォアの光退色に起因することを確実にするように注意すべきである。光強度および/または取得レートを低減することは光退色を減少させるのに役立つであろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
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