Изображений Локальный ЦС<sup> 2+</sup> Сигналы в культуре клетках млекопитающих
Summary
Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Abstract
Цитозольного Ca 2+ регулировать многие аспекты клеточной активности практически во всех типах клеток, контролируя процессы, широкие, как транскрипции генов, электрической возбудимости и пролиферации клеток. Разнообразие и специфичность Ca 2+ сигналов происходит от механизмов, посредством которых Ca 2+ сигналы генерируются действовать в течение различных временных и пространственных масштабах, начиная от сотовых всей колебаний и волн, происходящих в течение периодов от нескольких минут до местных переходных Ca 2+ микродоменов (Ca 2+ клубы) длительностью миллисекунд. Последние достижения в области электронного умножается CCD (EMCCD) камеры в настоящее время позволяют для работы с изображениями местных Ca 2+ сигналов с 128 х 128 пикселей пространственным разрешением со скоростью> 500 кадров с -1 (FPS). Такой подход чрезвычайно параллельный и позволяет одновременный мониторинг сотен каналов или слоеного сайтов в одном эксперименте. Тем не менее, огромное количество данных, полученных (около 1 Гб PER мин) оказывать визуальную идентификацию и анализ местного Ca 2+ события невыполнимую. Здесь мы опишем и продемонстрируем процедуры для приобретения, обнаружения и анализа местного IP 3 опосредованной Са 2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих, нагруженных Са 2+ показателей в обеих широкого поля эпи-флюоресценции (WF) и полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия. Кроме того, мы опишем алгоритм, разработанный в рамках программной среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует выявление и анализ этих местных Ca 2+ сигналов. Алгоритм локализуется сайты Ca 2+ выпуска с разрешением суб-пикселей; позволяет отзыв пользователем данных; и выводит временные последовательности отношение флуоресцентных сигналов вместе с амплитудой и кинетических данных в Excel-совместимый таблице.
Introduction
Ионы кальция (Ca 2+) повсеместно регулировать широкий спектр биологических процессов, в том числе генной экспрессии, секреции и длительных изменений в синаптической пластичности 1. Один из способов, через которые Са 2+ может действовать таким разнообразным образом через различных пространственных и временных форм Ca 2+ сигналы клеток может генерировать. Например глобальных высот в цитозоле [Са 2+] триггера сокращения в гладкой мышечной ткани 2, тогда как более мелкие, локальные переходные высоте (местные Ca 2+ Микродомены) стимулировать экспрессию генов, необходимую для обучения и памяти 3.
Бесплатный цитозольный [Ca 2+] поддерживается на ~ 100 нм в покое, но может быстро подняться до нескольких микро-моляра после притока Ca 2+ в цитозоле через Са 2+ -permeable ионные каналы, расположенные в мембране и освобождение Са 2+ из внутриклеточных сTores. В нашей лаборатории фокусируется на инозитол 1,4,5-трифосфата рецептора (IP-3 R), который образует канал выпуска 2+ Ca, расположенной в эндоплазматический ретикулум (ER) мембраны. После связывания как IP 3 и Са 2+ в цитозоле активации сайты рецептора, R канал IP 3 открывает освободить Ca 2+ поглощенных в ER просвет. Релиз Ca 2+ может оставаться пространственно ограничена небольшим кластера IP 3 рупий для создания местного цитозольную микродоменной Ca 2+ (Ca 2+ слоеного 4) или, в зависимости от близости соседних кластеров IP 3 R, может распространяются по всей клетке, привлекая множество сайтов слоеные с помощью процесса, Са 2+, индуцированной Ca 2+ -release (CICR) 5,6.
Введение флуоресцентных маленькая молекула Са 2+ индикатор красителей разработана Роджером Tsien 7, в сочетании с передовой микроскопии томографовнг методы, значительно облегчило наше понимание Ca 2+ сигнализации. Последние достижения в области камер, используемых для микроскопии позволяют сейчас для визуализации переходных местных Ca 2+ события, такие как клубы с беспрецедентной пространственным и временным разрешением. Имеющиеся в настоящее время EMCCD камеры позволяют изображений с 128 х 128 пикселей при> 500 кадров с -1 (кадров в секунду) и новое поколение дополнительной полупроводника из оксида металла (CMOS) камеры обеспечивают более высокое разрешение в пикселях, и даже более высокую скорость за счет немного выше уровень шума. В сочетании с полного внутреннего отражения (TIRF) микроскопии стало возможным с изображением одного Ca 2+ события 8,9 каналов. Такой подход позволяет визуализации сотен каналов / событий одновременно, при создании больших наборов данных (около 1 Гб в минуту), которые делают ручную обработку, визуальную идентификацию и анализ непрактичным и разместить ответственность на разработке автоматизированных алгоритмов.
<p clasS = "jove_content"> Здесь мы представляем процедур и протоколов для работы с изображениями местных Ca 2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы продемонстрировать алгоритм, разработанный в среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует идентификацию и анализ локальных Ca 2+ событий, отображаемых как TIRF и обычные широкое поле эпи-флуоресценции (WF) микроскопии. Хотя мы опишем эти подходы в контексте ИС 3 -порожденная Ca 2+ сигналы, они легко поддаются изучению локальных изменений в цитозоле [Са 2+], исходящие из различных Са 2+ -permeable ионные каналы, расположенные в любом поверхности мембрану или внутриклеточные органеллы 8-10.Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протоколов для работы с изображениями местных Ca 2+ события в культивируемых клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы опишем алгоритм с интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, который позволяет автомат…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Materials
| Name | Company | Catalogue No. |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
