イメージングローカルCA²⁺培養哺乳動物細胞内シグナル

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

細胞質ゾルのCa ²⁺イオンは、広範囲の遺伝子転写、電気的興奮性細胞増殖のようなプロセスを制御する、ほ ​​ぼすべての細胞型における細胞活性の多くの側面を調節する。のCa ²⁺シグナル伝達の多様性と特異性は、地元の過渡のCa ²⁺マイクロドメイン分の期間にわたって発生する細胞全体の振動と波に至るまでのCa ²⁺シグナルは、異なる時間と空間スケールの上に行動するために生成されるメカニズムから派生（Ca ²⁺のパフ）持続的なミリ秒。電子の最近の進歩は、CCD（EMCCD）カメラは今> 500フレーム秒^-1（FPS）のレートで128×128ピクセル空間分解能で地元のCa ²⁺シグナルの画像化を可能に掛けた。このアプローチは、高度に並列であり、単一の実験でチャンネルやパフサイトの何百もの同時モニタリングを可能にします。しかし、膨大な量のデータが生成された（ 約 ​​1 GBのPER分）実行不可能なローカルのCa ²⁺のイベントの視覚的な識別と分析をレンダリングします。ここでは説明し、取得、検出のための方法が示され、かつ広視野落射蛍光（WF）と全反射の両方を使用したCa ²⁺指標を搭載し、無傷の哺乳動物細胞内でのCa ²⁺シグナルを媒介₃ローカルIPの分析蛍光（TIRF）顕微鏡。さらに、我々は、これらのローカルのCa ²⁺シグナルの同定および分析を自動化するオープンソースのソフトウェア環境のPythonの中で開発したアルゴリズムを記述します。アルゴリズムは、サブピクセル解像度でのCa ²⁺放出の部位を局在化する。データのユーザーレビューを可能にする。エクセル互換テーブルの振幅および動力学的データと共に蛍光比信号の時間系列を出力する。

Introduction

カルシウムイオン（Ca ^2+が ）普遍的に遺伝子発現、分泌およびシナプス可塑性¹における長期的な変化を含む、生物学的プロセスの多様な範囲を調節。 Ca ²⁺の^ような多様な方法で行動できるような一つの方法は、Ca ²⁺の異なる空間的·時間的パターンを介して行われ、細胞が生成することができます通知します。細胞質ゾルの例グローバル標高平滑筋組織²のに対し、小さい内の[Ca ^2+]トリガー収縮、ローカライズされた一過性の上昇（ローカルのCa ²⁺のミクロドメイン）の場合は学習と記憶³に不可欠な遺伝子発現を刺激する。

無料のサイトゾルは、の[Ca ^2+]静止時〜100 nmで維持されるが、急速に細胞膜内とすることにより位置のCa ²⁺透過性イオンチャネルを通じて細胞質ゾルへのCa ²⁺の流入、以下のいくつかのマイクロモル濃度に上昇することができます細胞内sからのCa ²⁺の遊離tores。私たちの研究室では、小胞体（ER）膜に存在するのCa ²⁺放出チャネルを形成する、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP ₃ R）に焦点を当てています。受容体のサイトを活性化、細胞質ゾルに両方のIP ₃およびCa ²⁺が結合すると、IP ₃ Rチャンネルは、Ca ^2+が ER内腔内に隔離遊離するために開きます。 Ca ²⁺の放出が空間的に（Ca ²⁺のパフ^4）のCa ²⁺のローカルサイトゾルのミクロドメインを生成するために、IP ₃ Rの小さなクラスタに制限されたままであってもよいか、IP ₃ Rの隣のクラスタの近接度に応じて、かもしれないのCa ²⁺誘導性のCa ²⁺ -放出^{（CICR）5,6}のプロセスを介して複数のパフサイトを補充することによって、細胞全体に伝播。

高度な顕微鏡imagiと相まってツィン⁷ロジャーによって開発された蛍光小分子のCa ²⁺指示色素の導入、技術ngを、大幅のCa ²⁺シグナル伝達の我々の理解を促進してきた。顕微鏡検査のために使用されるカメラの最近の進歩は今そのような前例のない空間および時間分解能でパフなどの一時ローカルのCa ²⁺イベントを撮像することができます。現在利用可能なEMCCDカメラは、> 500フレーム秒^-1数（fps）と相補型金属酸化物半導体の新世代で128×128画素の画像化を可能にする（CMOS）カメラは、わずかに高い犠牲にしてより高い画素解像度、さらに速い速度を提供ノイズレベル。全反射（TIRF）顕微鏡法と併せて、画像を参照する単一のCa ²⁺チャネルイベント^8,9可能である。実行不可能な手動処理、視覚的識別および分析をレンダリングし、自動化されたアルゴリズムの開発に責任を置く大規模なデータセット（毎分約 1Gビット）を発生しながら、このアプローチは、同時にチャネル/イベント数百の画像化を可能にする。

<p clasS = "jove_content">ここでは、蛍光灯のCa ²⁺指標を用いて、無傷の哺乳動物細胞でのローカルのCa ²⁺シグナルを画像化するための手順およびプロトコルを提示する。今後は、TIRF、従来の広視野落射蛍光（WF）顕微鏡の両方によって画像化ローカルのCa ²⁺イベントの識別と分析を自動化し、オープンソース環境Pythonで開発したアルゴリズムを実証する。我々はIPのCa ²⁺シグナルをと生成さ₃のコンテキストでこれらのアプローチを説明したが、彼 ​​らはの[Ca ^2+]のCa様々ないずれかの表面に位置²⁺透過性イオンチャネルを発散する細胞質ゾルの局所的な変化を研究するために容易に適している膜または細胞内小器官^8-10。

Protocol

私たちは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるローカルのCa 2+イベントを画像化するための詳細な手順を提示する。これらの手順は、多くの細胞型8-10画像内Ca 2+シグナルに適合させることができる。 細胞の調製培養細胞は、その供給者のウェブサイトに掲載されている指示に従って撮像される。 画像化の前の数日間は、収穫細胞を…

Representative Results

図1Aはまた、ciは、IP 3を装填したヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるカル-520蛍光休止のWF画像を示す。フォト·リリースに100ミリ秒のUVフラッシュへのこれらの細胞の曝露は、I-IP 3は、（ 図1Aに白丸で示される）別個の部位での一過性のCa 2+パフを誘発した。これらの部 ​​位で測定された蛍光トレースはゆっくりとリリースサ?…

Discussion

私たちはここに記述し、蛍光Ca ²⁺の指標を用いて培養された哺乳動物細胞中で地元のCa ²⁺イベントを画像化するためのプロトコル。さらに、我々は、取得したデータの識別および分析を自動化する直感的なユーザーインターフェースでアルゴリズムを記述する。ここで説明する手順は、蛍光Ca ²⁺のインジケーターカル-520が、例えば、Fluo-3、Fluo-4のような他の多くのCa <su…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C