Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Cytosoliskt Ca2 + joner reglerar många aspekter av cellulär aktivitet i nästan alla celltyper, styrning av processer som omfattande som gentranskription, elektriska retbarhet och celltillväxt. Mångfalden och specificitet av Ca2 + signalering härrör från mekanismer genom vilka Ca2 + signaler genereras verka på olika tids och rumsliga skalor, från cellomfattande svängningar och vågor som inträffar under perioder av några minuter till lokala gående Ca2 + mikro (Ca2 + puffar) varaktiga millisekunder. Senaste framstegen inom elektron multiplicerat CCD (EMCCD) kameror tillåter nu för avbildning av lokala Ca2 + signaler med 128 x 128 pixel rumslig upplösning vid hastigheter av> 500 bildrutor sek -1 (fps). Detta tillvägagångssätt är mycket parallellt och möjliggör samtidig övervakning av hundratals kanaler eller puff platser i ett enda experiment. Emellertid de enorma mängder data som genereras (ca 1 GB per min) gör visuell identifiering och analys av den lokala Ca 2 + evenemang ogenomförbart. Här beskriver vi och demonstrera förfarandena för förvärvet, detektion och analys av lokala IP 3 medierad Ca 2 + signaler i intakta däggdjursceller laddade med Ca2 + indikatorer som använder både brett fält epi-fluorescens (WF) och total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Dessutom beskriver vi en algoritm som utvecklats inom öppen källkod miljö Python som automatiserar identifiering och analys av dessa lokala Ca 2 + signaler. Algoritmen lokaliserar platser i Ca2 + release med sub-pixel upplösning; tillåter användaren översyn av data; och matar tidssekvenser av fluorescens förhållandesignaler tillsammans med amplitud och kinetiska data i en Excel-kompatibla bord.
Kalciumjoner (Ca2 +) ubiquitously reglerar ett varierat utbud av biologiska processer, inklusive genuttryck, sekretion och varaktiga förändringar i synaptisk plasticitet 1. Ett sätt genom vilket Ca2 + kan agera på ett sådant mångsidigt sätt är genom de olika rumsliga och tidsmässiga mönster av Ca2 + signalerar en cell kan generera. Till exempel globala förhöjningar av cytosoliskt [Ca2 +] trigger kontraktion i glatt muskelvävnad 2 medan mindre, lokala gående förhöjningar (lokala Ca2 + mikro) stimulera genuttryck viktigt för inlärning och minne 3.
Fri cytosolisk [Ca2 +] hålles vid ~ 100 nm vid vila, men kan snabbt stiga till flera mikro-molar efter inflödet av Ca2 + i cytosolen genom Ca2 + -permeable jonkanaler lokaliserade i plasmamembranet och genom befrielsen av Ca2 + från intracellulära sTores. Vårt laboratorium fokuserar på inositol 1,4,5-trifosfat-receptorn (IP 3 R), som bildar en Ca 2+ frisättning kanal som finns i det endoplasmatiska retiklet (ER) membranet. Vid bindning av både IP 3 och Ca2 + till cytosoliska aktiverande ställen av receptorn, öppnar IP 3 R-kanal för att befria Ca2 + binds inom ER lumen. Frisläppandet av Ca2 + kan förbli spatialt begränsad till ett litet kluster av IP 3 Rs att generera en lokal cytosoliskt mikrodomän av Ca2 + (Ca2 + puff 4) eller, beroende på närheten till grann kluster av IP 3 skivor, kan propagerar hela en cell genom att rekrytera flera puff platser genom en process av Ca2 + inducerad Ca2 + -release (CICR) 5,6.
Införandet av fluorescerande liten molekyl Ca2 + indikator färgämnen som utvecklats av Roger Tsien 7, i kombination med avancerad mikroskopi fantasinng tekniker, har i hög grad underlättat vår förståelse av Ca2 + signalering. Senaste framstegen inom kameror som används för mikroskopi tillåter nu för avbildning gående lokala Ca2 + händelser som puffar med oöverträffad rumslig och temporal upplösning. För närvarande tillgängliga EMCCD kameror möjliggör avbildning med 128 x 128 bildpunkter vid> 500 bildrutor sek -1 (fps) och den nya generationen av Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) kameror ger högre pixelupplösning, och ännu snabbare hastighet på bekostnad av något högre bullernivåer. I samband med total inre reflektion (TIRF) mikroskopi är det nu möjligt att bilden singel Ca2 + kanalhändelser 8,9. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att avbilda hundratals kanaler / evenemang samtidigt, samtidigt som de skapar stora datamängder (ca 1Gb per minut) som gör manuell behandling, visuell identifiering och analys ogenomförbart och placera en skyldighet att utveckla automatiserade algoritmer.
<p class = "jove_content"> Här presenterar vi rutiner och protokoll för avbildning lokala Ca2 + signaler i intakta däggdjursceller med hjälp av fluorescerande Ca2 + indikatorer. Vi visar vidare en algoritm som utvecklats i öppen källkod miljö Python som automatiserar identifiering och analys av lokala Ca2 + evenemang avbildas av både TIRF och konventionell brett fält epi-fluorescens (WF) mikroskopi. Även om vi beskriver dessa tillvägagångssätt i samband med IP 3 -generated Ca2 + signaler, de är lätt mottaglig för att studera lokala förändringar i cytosolisk [Ca2 +] som härrör från en mängd Ca2 + -permeable jonkanaler lokaliserade i endera ytan membran eller intracellulära organ 8-10.Vi beskriver här protokoll för avbildning lokala Ca2 + händelser i odlade däggdjursceller med hjälp av fluorescerande Ca2 + indikatorer. Dessutom beskriver vi en algoritm med ett intuitivt användargränssnitt som automatiserar identifiering och analys av insamlade data. Det förfarande som beskrivs här utnyttjar den fluorescerande Ca2 + indikator Cal-520, men många andra Ca2 + känsliga färgämnen såsom Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 och Oregon Grön BAPTA-1 utför tillräck…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Name | Company | Catalogue No. |
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |