Abstract
זרימה מופחתת חוט השדרה דם (SCBF) (כלומר, איסכמיה) ממלאת תפקיד מרכזי בהפתופיזיולוגיה טראומטית פגיעה בחוט השדרה (SCI), והוא בהתאם יעד חשוב לטיפולי נוירו. למרות כמה טכניקות תוארו להעריך SCBF, לכולם יש מגבלות משמעותיות. כדי להתגבר על זה האחרון, אנו מציעים שימוש בהדמיה בזמן אמת אולטרסאונד ניגוד משופר (CEU). כאן אנו מתארים את היישום של טכניקה זו במודל חולדה חבלה של SCI. קטטר הצוואר מושתל ראשון להזרקה החוזרת ונשנית של חומר ניגוד, פתרון נתרן כלורי של microbubbles מארז hexafluoride הגופרית. עמוד השדרה מכן התייצב עם 3D מסגרת מותאמת אישית ומאטר הדורה חוט השדרה הוא נחשף על ידי laminectomy בThIX-ThXII. הבדיקה אולטרסאונד אז הוא מוצב בחלק האחורי של מאטר הדורה (מצופה בג'ל אולטרסאונד). כדי להעריך SCBF בסיס, הזרקה תוך ורידית אחת (400 μl) של קונטרהסוכן רח מוחל להקליט המעבר שלו דרך נימי הדם הזעיר בעמוד השדרה בשלמותה. מכשיר ירידה במשקל משמש לאחר מכן כדי ליצור מודל חבלה ניסיוני לשחזור של SCI. חומר ניגוד מוזרק מחדש 15 דקות הבאות הפציעה להעריך שינויים פוסט-SCI SCBF. CEU מאפשר בזמן אמת וב- vivo הערכה של שינויי SCBF הבאים SCI. בבעלי החיים ללא כל הפגע, הדמיה אולטרסאונד הראתה זרימת דם לא אחידה לאורך חוט השדרה בשלמותה. יתר על כן, 15 דקות לאחר SCI, הייתה איסכמיה קריטית ברמה של המוקד בעוד SCBF נשאר השתמר באזורים המרוחקים יותר ללא פגע. באזורים הסמוכים למוקד הרעש (שני מקורי ואת הזנב), SCBF הופחת באופן משמעותי. זה מתאים לתואר קודם לכן "אזור פנומברה איסכמית". כלי זה הוא עניין גדול להערכת ההשפעות של טיפולים שמטרתן להגביל איסכמיה והנימק של רקמות וכתוצאה מכך לאחר SCI.
Introduction
פגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) היא מצב הרסני שהוביל לירידת ערך המשמעותית במנוע, חושית ופונקציות אוטונומיות. נכון להיום, אין טיפול הוכיח את יעילותה בחולים. מסיבה כזו, חשוב לזהות טכניקות חדשות שתשפר את ההערכה של טיפולים פוטנציאליים ועוד יכול להבהיר pathiophysiology פציעת 1.
SCI מחולק לשני שלבים רציפים, התייחס לפציעות ראשוניות ומשניים כ. הפגיעה העיקרית תואמת את העלבון המכני הראשוני. בעוד הקבוצות המשניות פציעת מפל של אירועים ביולוגיים שונים (כגון דלקת, סטרס חמצונים והיפוקסיה) שתורמים עוד יותר להרחבה ההדרגתית של הנגע הראשוני, נזק לרקמות וגירעון 2,3 לכן נוירולוגיות.
בשלב האקוטי של SCI, טיפולי נוירו אלה נועדו לצמצם את הפתולוגיה פגיעה המשנית וציודולד בהתאם לשפר את תוצאות נוירולוגיות. בין אירועי הפגיעה המשניים הרבים, איסכמיה משחקת תפקיד מכריע 4,5. ברמה של מוקד SCI, microvessels parenchymal הפגומה לעכב זרימה יעילה השדרה דם טבורי (SCBF). יתר על כן, SCBF גם הקטינה באופן משמעותי באזור המקיף את מוקד פגיעה, אזור ספציפי המכונה "אזור פנומברה איסכמית". אם SCBF לא ניתן לשחזר במהירות באזורים אלה, איסכמיה יכולה להוביל לנימק parenchymal נוסף ונזק לרקמות עצבים נוסף. כאפילו שימור הרקמות הקל יכול להיות השפעות משמעותיות של פונקציה, זה עניין גדול לפיתוח תרופות וטיפולים שיכולים להפחית איסכמיה לאחר SCI. כדי להדגיש את התופעה הזאת, עבודה קודמת הראתה כי שימור של 10% בלבד של אקסונים myelinated היה מספיק כדי לאפשר הליכה בחתולי פוסט-SCI 6.
למרות כמה טכניקות תוארו להעריך SCBF,יש כל y מגבלות משמעותיות. לדוגמא, השימוש בmicrospheres רדיואקטיבי 7,8 וC14-iodopyrine autoradiography 9 דורש הקרבת בעלי חיים שלאחר מכן ולא ניתן לחזור בזמן מאוחר יותר נקודות. טכניקת שחרור מימן 10 תלויה בהכנסה של אלקטרודות intraspinal, אשר עשוי לפגוע עוד יותר בעמוד השדרה. בעוד ההדמיה דופלר הלייזר, photoplethysmography 14,15 וב- vivo מיקרוסקופ אור 16 יש עומק / שטח מצומצם מאוד של המדידה 11-13.
צוות שלנו הראה בעבר כי אולטרסאונד הניגוד משופר הדמיה (CEU) ניתן להשתמש כדי להעריך בזמן אמת וב- vivo שינויי SCBF בparenchyma חוט השדרה עכברוש 17. חשוב לציין כי טכניקה דומה מיושמת על ידי אל הואנג ואח. במודל חזירי של SCI 18. CEU חל במצב ספציפי של ההדמיה אולטרסאונד המאפשר לשייך im מורפולוגיים בגווני אפורגילים (מתקבלים על ידי B-המצב הקונבנציונלי) עם פריסה המרחבית של זרימת דם 19. ההדמיה SCBF והכימות מסתמכים על הזרקה תוך-של סוכני הד ניגודיות. חומר הניגוד מורכב מmicrobubbles hexafluoride הגופרית (כלומר קוטר של כ 2.5 מיקרומטר ו -90% בעל קוטר של פחות מ -6 מיקרומטר) התייצב בפוספוליפידים. Microbubbles משקפת את קורה אולטרסאונד הנפלט על ידי הבדיקה ובכך לשפר echogenicity דם וניגוד הולך וגדל של הרקמות על פי זרימת הדם שלהם. לכן ניתן להעריך את זרימת הדם באזור נתון של ריבית בהתאם לעוצמת האות לידי ביטוי. Microbubbles גם בטוחה והם יושמו קליניים בבני אדם. Hexafluoride הגופרית מנוקה במהירות (כלומר מחצית חיים מסוף הוא 12 דקות) ויותר מ -80% מhexafluoride הגופרית מנוהל הוא התאושש באוויר ננשף בתוך 2 דקות לאחר הזרקה. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לשימוש im CEUהזדקנות להעריך שינויי SCBF בחולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: השיטות שתוארו בכתב היד הזה אושרו על ידי הוועדה לביו-האתיקה בבית הספר לרפואה של Lariboisière, פריז, צרפת (CEEALV / 2011/08/01).
1. כלי הכנה
- להכין ולנקות את המכשירים הבאים להכנסה קטטר: מיקרו-מלקחיים, מיקרו מספריים, מהדק מיקרו-וסקולרית, מספריים גדולים, חוט כירורגי (משי קלוע השחור 4-0) וקטטר 14 G. Heparinize הצנתר עם פתרון הפרין (5000 U / ml).
- להכין ולנקות את המכשירים לlaminectomy הבאים: מספריים גדולים, אזמל וחותך עצם. בצע laminectomy עם חותך עצם מחוייט שנועד להפחית את הסיכון של פגיעה בחוט השדרה במהלך laminectomy (איור 1).
- הגדרת מסגרת 3D בשימוש על מיקום וייצוב של החיה. המסגרת המותאמת אישית בנויה עם האלמנטים של הקיבוע חיצוני הופמן 3 בשיתוף עם מלקחיים, which כבר מעוקל כדי להתאים את עמוד השדרה המותני של בעלי החיים.
- הכן את מכשיר ירידה במשקל (impactor) המשמש לפגיעה ביו-מכאנית בעמוד השדרה.
הערה: מכשיר impaction מחוייט נועד עם תוכנת 3D ומודפס ב3D. - הפעל את המכונה אולטרסאונד.
- הכן את הערכה לכינון מחדש של חומר הניגוד.
הערה: הערכה כוללת בקבוקון המכיל 1 25 מ"ג של אבקת Lyophilised, מזרק מלא מראש 1 המכיל 5 מיליליטר מערכת אחת המיני-ספייק העברה (איור 2) כלוריד ונתרן. הצעדים לכינון מחדש של חומר הניגוד מפורטים להלן (בסעיף 5).
2. הצוואר וריד צנתור (איור 3)
- להרדים את החיה עם isoflurane 4%. מניחים את החיה במצב שכיבה. לאשר הרדמה תקינה על ידי הבטחה כי בעל החיים אינם מגיבים כאשר כפות הם צבטו עם מלקחיים. החל משחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש ואילו undהרדמה אה.
- לגלח את הצוואר ולנקות את העור. עושה חתך בקו האמצע של הצוואר. לחזור שריר sternocleidomastoidian כדי למצוא וריד הצוואר הפנימי. להדק מייתר בחלק מקורי של הווריד.
- החל מהדק כלי דם בווריד, 1 סנטימטר מתחת למייתר. עובר חוט אחר מסביב לווריד, ממש מתחת למהדק עם הקשר מוכן להיות להדק כאשר המהדק הוא שוחרר.
- פתח את הקיר של הווריד (venotomy) בין המהדק והמייתר מקורי. להציג את צנתר G 14 בלומן של הווריד ולדחוף אותו לכיוון הלב.
- כשמדובר נגד המהדק, לשחרר את האחרון ולדחוף את הצנתר נוסף. אבטח את הצנתר בווריד, על ידי תוקף הידוק הקשר על הווריד עם קטטר בפנים.
- להעריך פתיחות של הצנתר על ידי משיכת כמות קטנה של דם ורידים בקטטר ולאחר מכן ולאחר מכן שטיפה זה עם מלוחים heparinized. זה מונע חסימה של גatheter על ידי קריש דם פוטנציאלי.
- חבר צינור גמיש לקטטר להזרקה נוספת של חומר ניגוד (microbubbles). שמור את זה סגור (סגור) עד מוכן לשימוש.
3. גישה לשדרה, Laminectomy ועכברוש מיקום (ב3D המסגרת)
- מניחים את החיה במצב אופקי נוטה שטוח. להתגלח ולנקות את הגב (אזור בית חזה) של בעלי החיים.
- זהה את הצלע האחרונה (XIIIth בחולדה) על ידי מישוש (איור 4). זה מאפשר להעריך את המיקום של החוליה XIIIth החזה (ThXIII).
- לעשות חתך 4 סנטימטר עור על קו האמצע, במרכז בThXIII. פתח את החתך בעור, כמו גם את הבורסה הבסיסית. שים לב לאלל של שרירי גב, כמו גם הטיפים של תהליכי עמוד השדרה בחוליות.
- למקם בזהירות את תהליך עמוד השדרה של ThXIII ע"י מישוש צלעות XIIIth.
הערה: צלעות XIIIth מחוברת לThXIII ולכן מייצגת קלה locaציון דרך אנטומיים te לזיהוי ThXIII. צעד זה מאפשר הלוקליזציה של ThXII לThIX תהליך spinous כמו גם (חוליות ראשונה ושנייה באזור המותניים) L1 ו- L2. - חותך את אָלָל השרירים ולנתק את השרירים משני צדי לחשוף את תהליכי spinous, laminas ומפרקי הפן מThIX לL2. לחשוף את ההיבטים הרוחביים של L1 ו- L2 ידי ניתוק שרירים מהתהליכים הרוחביים.
- הוק שיניים החותכות של בעלי החיים ב3D המסגרת כדי לאבטח את העמדה (איור 5). הצמד את חוליות L1 ו- L2 עם המלקחיים שונה. חבר את המלקחיים שונה ל3D המסגרת כדי לייצב את בעלי החיים.
- משכו בעדינות caudally המלקחיים מחזיקים עמוד השדרה המותני כדי להדק את כל עמוד השדרה ולרומם את בית החזה מהספסל.
הערה: עם ההסדר המתואר בעלי החיים צריכים להיות מסוגלים לנשום. יתר על כן, למרות תנועות נשימה של כלוב הצלעות, עמוד השדרה ועמוד השדרהכבל צריך גם להישאר ללא תנועה. - הסר את processess spinous מThIX לThXII. הכנס בעדינות את הלהב הנחותים של להב העצם מתחת לlamina השמאל של ThXII ולאחר מכן לסגור את חתך העצם כדי לחתוך את lamina (איור 6).
- חזור על אותו התרגיל לlamina תקין וברציפות להסיר את הקשת האחורית. חזור על השלבים הקודמים לThXI החוליות לThIX על מנת להשיג laminectomy ארבע ברמה. הסר את שני מפרקי הפן לכל חוליה.
הערה: לאורך כל ההליך, לנקות את שדה הניתוח מדימום מקומי. לשם כך, השתמש בצמר גפן והשקיה עם מי מלח פושר. עצירת דימום באופן שיטתי מתרחשת בתוך דקות.
4. CEU בדיקה מיקום
- מכסה את מאטר הדורה עם ג'ל אולטרסאונד. זה מאפשר העברת יעילה של גלי אולטרסאונד בין החללית ואת חוט השדרה (איור 7).
- לייצב את שנינות הבדיקה אולטרסאונדמהדק חה שיכול להיות מחובר להמשך 3D המסגרת על ידי זרוע מפרקים. באופן ידני למקם את החללית. ודא שהבדיקה מכוונת להשגת פרוסת sagittal אורך אלכסונית. במיקום נכון, חוט השדרה הוא אופקי אך ורק על התמונה והתעלה של חוט השדרה המרכזית גלויה לאורך הקטע המלא של חוט השדרה.
הערה: מיקום צריך להיות מונחה על ידי תמונת B-המצב בזמן אמת המוצגת על המסך של מכשיר אולטרסאונד. מרחק המוקד של הבדיקה אולטרסאונד צריך להיות מתואם עם התעלה של חוט השדרה המרכזית. בשלב זה, ההיבט האחורי של חוט השדרה הוא נגיש שסופו של דבר יאפשר למיצוב של impactor. - כאשר אופטימלי, לנעול את זרוע מפרקים כדי לייצב את המצב.
5. הכנת חומר הניגוד - Microbubble הכינון מחדש
- שימוש בתוכן של ערכת הכינון מחדש מסחרית ולחבר את מוט הבוכנה על ידי חיזוקו tightly לתוך המזרק (עם כיוון השעון). פתח את שלפוחית מערכת ההעברה ולהסיר את כובע קצה מזרק. פתח את מכסה מערכת ההעברה ולחבר את המזרק למערכת ההעברה (להדק בחוזקה).
- הסר את דיסק מגן מהבקבוקון. חלק את הבקבוקון לתוך השרוול השקוף של
- מערכת העברה ולחץ בחוזקה כדי לנעול את הבקבוקון במקום.
- רוקן את התוכן של המזרק לתוך הבקבוקון על ידי לחיצה על מוט הבוכנה. לנער במרץ במשך 20 שניות כדי לערבב את כל התוכן בבקבוקון להשיג נוזל הומוגני חלבי לבן.
- הפוך את המערכת ולסגת בזהירות את חומר הניגוד לתוך המזרק. להתיר את המזרק ממערכת ההעברה. לאחר הכינון מחדש (עפ"י הוראות), 1 מיליליטר של הפיזור וכתוצאה מכיל hexafluoride גופרית 8 μl בmicrobubbles. צייר את ההשעיה של microbubbles לתוך מזרק 100 מיליליטר. הכנס את מזרק 100 מיליליטר למשאבה החשמלית. סגור את המכסה.
- התחל תסיסה מתמדת של מחדשmicrobubbles הממוסדת. תסיסה מתמדת מתקבלת על ידי סיבוב איטי של המזרק, ששומר על ההשעיה microbubble. חבר את המשאבה לקטטר וריד הצוואר באמצעות הצינור גמיש. להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "מצב הרמוני".
הערה: האחרון התואם למצב שבו ניתן לאתר microbubbles במיוחד ודמיין. יש מצב זה מדד מכאני נמוך, אשר אינו להרוס microbubbles בניגוד לB-המצב. - לטהר את הצנתר על ידי יציקת מנה ראשונה (400 μl) של חומר ניגוד. במהלך העירוי ראשון זה, לבדוק שmicrobubbles מופיעה על מסך אולטרסאונד. זו מאשרת את המעגל השלם (מהמזרק למחזור הדם של החולדה) הוא שלם ופתוח.
- להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "B-מצב" כדי להמחיש את parenchyma חוט השדרה וההרס של כמה microbubbles שנותרה במחזור הדם. התדירות הגבוהה של "B-Mode" טראןאנרגיה גבוהה סמיטס לmicrobubbles, המאפשרת להם התמוטטות.
- בואו החיה שכבה עדיין על כ 30 דקות. תקופה זו מאפשרת לייצוב הפרמטרים haemodynamic.
6. הערכת SCBF בחוט השדרה השלמה
- להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "המצב ההרמוני". התחל בו זמנית (1) עירוי של חומר ניגוד (400 μl) ו- (2) כרונומטר.
הערה: במהלך העירוי, הריכוז של microbubbles בזרם הדם צריך להגדיל, המאפשר לדמיון הניגוד של חוט השדרה (איור 8). מאז microbubbles נהרסות במהירות, הריכוז של microbubbles הדם מתחיל לרדת פעם אחת ההזרקה הושלמה אשר מייצרת ירידה הדרגתית בהדמית ניגוד של חוט השדרה. - לאחר דקות 1, בחר (עיתונות) על כפתור "חנות קליפ" על המכונה אולטרסאונד. זה יאפשר אחד כדי להציל 1 דקות של Raw נתונים אולטרסאונד והווידאו ההדמיה הקלטה (שהוצג בעבר על מסך אולטרסאונד).
- להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "B-Mode". זה יבטל את microbubbles שנותרה.
7. ניסיוני SCI
- שימוש micromanipulator המחובר ל3D המסגרת, מקם את מכשיר impaction ירידה במשקל, כך שקצה impactor בא במגע עם הדורה מאטר (על קו האמצע חוט השדרה), בצומת בין THX וThXI (איור 9) .
הערה: רמה זו צריכה להתאים לאמצע הקטע של חוט השדרה נצפה עם מכשיר אולטרסאונד. החלוץ והגוף של impactor הם 8 מ"מ קוטר. קצה impactor, שיפיק את הפגיעה, הוא 3 מ"מ קוטר. - מניחים את החלוץ של מכשיר impaction בעמדה 10 סנטימטר גבוה. לגרום SCI הניסיוני על ידי שחרור החלוץ של מכשיר impaction. החלוץ נופל ומשחרר הimpactor דואר, ופצע את חוט השדרה. Impaction המותאם אישית מספק מקביל השפעה למשקל 10 גרם שצנח מגובה של 10 סנטימטרים.
8. הערכת SCBF 5 דקות לאחר SCI
- חזור על השלבים שתוארו בסעיף 6 (הערכה של SCBF). Microbubbles לא תוכל לעבור בנימי הדם הזעירה הפגומה ומוקד הפגיעה יישאר כהה (איור 10).
9. קורבן בעלי החיים
- להרדים את החיה עם הזרקה תוך הצפק קטלני של pentobarbital (100 מ"ג).
10. כימות SCBF על ידי ניתוח מנותק
- הפעל את תוכנת Ultra-להאריך משמשת לכימות (במכונה אולטרסאונד). בחר "קובץ" ולאחר מכן בחר את הנתונים גולמיים שנשמרו בעבר ולפתוח את הקבצים הקשורים. הפעל את "מצב הכימות" על ידי לחיצה על כפתור "צ'י Q" (בחירה). Sele גודלCT "הגדר החזר על ההשקעה" (כפתור) ולבחור את הצורה העגולה.
- בחר "צייר ROI" (כפתור) ולצייר שבעה אזורים מעגליים סמוכים של עניין (ROI) בחוט השדרה (איור 11). פתח את התפריט "התאמה" ולבחור את הפונקציה "ערך Curve". שים לב לתוכנה בו מוצגות כמה עקומות, כל מתאים לשינויים של ריכוז microbubbles בתוך החזר על השקעה.
הערה: לכל אחד יש עקומת פרופיל "זלוף-deperfusion". השלב הראשון של העקומה הוא שטוח ומתאים לתקופה שלפני הגעתו של microbubbles. בשלב השני, הריכוז של microbubbles מגדיל במהירות כתוצאה מהעירוי. בשלב השלישי, אשר מתחיל כאשר העירוי יושלם, הריכוז של microbubbles בהדרגה יורד ככל שהם disintegratse בזרם הדם. - מניחים את הקו האנכי הראשון בתחילת השלב השני של גurve ובחר "קבע". זה מודיע תוכנה מאיפה להתחיל ניתוח.
- מניחים את הקו האנכי השני בסוף ההקלטה ושוב בחר באפשרות "SET". זה מודיע התוכנה היכן לעצור ניתוח.
- תסתכל על תפריט "קורות חיים" ולהקליט את הערך "AUC", אשר תואם את "השטח מתחת לעקומה" ניתחה. ערך זה הוא פרופורציונאלי לSCBF בתוך ROI המקביל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם הפרוטוקול שתואר לעיל, ניתן למפות את SCBF לאורך קטע sagittal אורך חוט השדרה.
בחוט השדרה שלם, נראה שיש אי סדרים SCBF בתוך parenchyma (איור 12). זה יכול להיות מוסבר על ידי ההפצה המשתנה של עורקי radiculo-לשדי (RMA) מבעלי חיים אחד למשנהו. RMA מתייחס למגזריים עורקים המגיעים לעורק הקדמי השדרה (ASA), ולכן מספקים את אספקת דם לparenchyma חוט השדרה. לעומת זאת, את העורקים שָׁרשִׁיתִי מתאים למגזריים עורקים, שאינו מגיעים לאס"א ולכן לא מספק את אספקת דם בעמוד השדרה. לכן, במגזרי חוט השדרה שבי RMA anastomoses עם אס"א, יש יותר זרימת דם (כפי שמוצגת בתוצאות שלנו).
לאחר SCI, הדמיה CEU בזמן אמת תערוכות מחסור במחזור במוקד הפגיעה. המוקד נשאר (אין אות חומר ניגוד) כהה,כשם שאין זרימת דם פעילה. ניתוח מפורט יותר של זרימת הדם באמצעות כמה ROIs מציג שלוש זרימת דם שטחים ייחודיים. ראשית, ברמה של המוקד, זרימת הדם היא הנמוך ביותר עם ירידה ממוצעת של% על -90. שנית, בשטחים הסמוכים למוקד הרעש (שני מקורי ואת הזנב), SCBF גם ירד באופן משמעותי (החל -50% ל -80%). שלישית, באזורים המרוחקים ביותר המתאימים לרקמות שלמות, SCBF נשמר. האזור השני תואם את "אזור איסכמי הצללים", שאמורה להיות היעד של טיפולי נוירו פוטנציאליים. להיות מסוגל לדמיין בקלות ולכמת SCBF משנה פוסט-SCI הוא שימושי להערכת היעילות של טיפולים שמטרתה צמצום איסכמיה רקמות, ולכן מדגיש את החשיבות של טכניקה זו (איור 13).
איור 2. ייצוג סכמטי של הערכה לכינון מחדש microbubbles וVueject ° המשאבה משמשת לעירוי microbubbles. המערכת מאפשרת ההעברה עבור המשלוח של microbubbles ומלוחה בין הבקבוקון והמזרק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. קטטר וריד הצוואר. הצנתר הוא להיות מוכנס בוריד הצוואר, ואז דחף לכיוון הלב ולבסוף להדק עם קשר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. שיטה לזיהוי נכון של רמות השדרה. בחולדה, הצלע האחרונה מחוברת לחולית XIIIth. ניתן למישוש האחרון דרך העור כנקודת ציון לחולית החזה האחרון, XIIIth. שרירים מנותקים משני צדי תהליכי spinous. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דף = "תמיד"> 
איור 5. ייצוב של החיה ב3D המסגרת. (1) השיניים החותכות מחוברות על המסגרת זמן שהחוליות הראשונות ושנייה המותני (L1 ו- L2) הם הידקו עם מלקחיים בהזמנה אישית. (2) בעמוד השדרה המותני הוא מעט הידק אשר מייצב את בעלי החיים ומרומם את בית החזה מהספסל, ובכך לאפשר תנועות נשימה חופשיות ללא תנועות עמוד השדרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. פרטים טכניים של laminectomy. ראשית, הלהב הדק של להב עצם מחוייט הוא עבר מתחת לlamina מבלי לפגוע בחוט השדרה. אז חותך העצם סגור, שגUTS ומסיר חלק מlamina. ההליך זה חזר על שני הצדדים ומThXII לTxIX על מנת להשיג laminectomy ארבע ברמה. לבסוף, מפרקי הפן יוסרו גם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. מיצוב של הבדיקה אולטרסאונד ומכשיר impaction. הבדיקה היא במקביל לחוט השדרה ואלכסוני מעט (20-30 מעלות), כך שהירידה במשקל impactor ניתן להציב נגד ההיבט האחורי של הדורה. חוט השדרה צריך להיות גלוי עם הווה התעלה המרכזי במגזר האמצע בהדמית אולטרסאונד "B-Mode". אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8. ההדמיה ניגודיות של חוט השדרה בשלמותה. הדמויות הרצופות במצב ניגודיות (תמונות בצבע כתומות) מראות כיצד חומר הניגוד (microbubbles) בהדרגה מופיע בעקבות העירוי, ובכך משפר את הניגודיות של חוט השדרה. עירוי בולוס נמשך כ -10 שניות ונתונים הניגוד נרשמו דקות 1. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9. שינויים בB-המצב הבא SCI הניסיוני. נגע hyperechoic מופיע בתוך parenchyma, מתאים לh parenchymal הראשוני emorrhage פוסט-SCI. היסטולוגיה (צביעת H & E): תוצאות הדימום מהפרעה טראומטית מסיבית של כלי דם קטנים המובילים לextravasation דם בparenchyma (בר = 2,000 מיקרומטר בקנה מידה צהובה). מכשיר impaction מוצג בצד הימין. החלוץ הוא שוחרר מגובה 10 סנטימטר ומתנגש עם impactor שלאחר מכן יוצר פגיעה בחוט השדרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 10. ההדמיה ניגודיות 15 דקות לאחר SCI. בדומה לאיור 8, microbubbles נראית כשהם עוברים דרך נימי הדם הזעיר בעמוד השדרה. במוקד (הכוכבית), זרימת הדם חסומה על ידי שיבוש כלי דם."Target =" _ 10large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור פרוטוקול 11. לכימות SCBF. עם תוכנת Ultra-להאריך, שבעה אזורים מעגליים וסמוכים של העניין (ROI) נמשכים על תמונת חוט השדרה האורך. ההחזר על ההשקעה הראשונה מושם על מוקד פגיעה. בכל החזר על השקעה, התוכנה יוצרת עקומת זלוף-deperfusion ומחשבת את השטח מתחת עקומה זו. ערך זה בקורלציה עם זרימת הדם באזור זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הטרוגניות 12. איור של זרימת הדם לאורךחוט השדרה. גרפים אלה להציג את ההטרוגניות של זרימת דם בעמוד השדרה, כמו גם את השונות בין בעלי החיים. זה יכול להיות מוסבר במידה רבה על ידי האנטומיה של כלי הדם של חוט השדרה. עם זאת, בשל ההטרוגניות ואנטומיה של כלי דם משתנה, יש להשתמש בזרימת דם המדידות (מכל ROI) לפני פציעה כבסיס. המדידות שנעשו בזמן הנקודות הבאות (פוסט-SCI) באות לידי ביטוי כשינוי באחוזים של קו הבסיס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 13. שינויים בזרימת דם בעמוד השדרה (SCBF) הנגרמת על ידי הפגיעה בחוט השדרה הניסיונית (SCI). 15 דקות לאחר SCI יש איסכמיה הקריטית ברמה של המוקד בעוד SCBF נשאר עמ 'שמורות באזורים המרוחקים יותר ללא פגע. באזורים הסמוכים למוקד הרעש (שני מקורי ואת הזנב), SCBF מצטמצם משמעותי. זה מתאים לתואר קודם לכן "אזור פנומברה איסכמית". לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שתארנו כיצד להשתמש CEU במודל חבלת עכברוש SCI, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להתאים את יעדי ניסוי אחרים או מודלים SCI. אנחנו בחרנו למדוד SCBF רק שתי נקודות בזמן (לפני פציעה ו -15 דקות לאחר SCI), עם זאת את מספר נקודות זמן, והעיכוב בין מדידות SCBF ניתן להתאימם לצורך של מחקרים אחרים. לדוגמא, בעבודה הקודמת שלנו 17, יש לנו למדוד SCBF בחמש נקודות רצופות לאורך זמן בשעה הראשונה שלאחר SCI. חשוב לציין כי בקבוצת הדמה (לא SCI), הופתענו לצפות ירידה הדרגתית בSCBF. בעוד שבתחילה חששנו כי עירוי microbubble חזר עלול לפגוע בכלי הדם בעמוד השדרה, ניסויים נוספים (נתונים שלא פורסמו) אישר כי שינויים אלה נגרמים על ידי שינויים הדרגתיים בתנאים פיסיולוגיים רקמה המקומית (טמפרטורה, לחות) הנגרמים על ידי laminectomy, כמו גם את ממושך אקספוזיציה של tהוא דורה ורקמות לאוויר הסביבה וג'ל אולטרסאונד. בעיות אלה נפוצות בכל הניסויים העוסקים בזרימת דם, כמו במחזור הוא מאוד רגיש לפרמטרים רבים, ולכן נוטה vascoconstriction או vasodilatation. לכן, אנו ממליצים כי התקופה שבה פצע הניתוח נותר פתוח היא קצרה ככל האפשר. אם מדידות SCBF מרובות נדרשות על פני תקופה ממושכת, עדיף לסגור את החתך בבעלי החיים בין הרכישות כדי לשחזר תנאים פיסיולוגיים סביב ובתוך חוט השדרה.
כמו כן ניתן לשנות את הצורה, גודל, מיקום ומספר ROIs לניתוח SCBF. אחד היתרונות הגדולים של CEU הוא שהמדידות יכולות להתבצע בכל עת לאחר השלמת ניסוי על ידי עיבוד מחובר הנתונים שנרשמו. אפשר גם לחזור על המדידות או לשנות את הגדרות מדידה / תקנים במידת צורך.
רזולוציה מרחבית של ההדמיה אולטרסאונד היא פרופורציונלית לתדירות של גלי אולטרסאונד. תדירות אולטרסאונד גבוה יותר, כך טוב יותר ברזולוציה מרחבית. יש לנו בשימוש גבוהבדיקה -frequency (12-14 MHz), המספקת תמונה עם פיקסלים ברזולוציה של 100 על מיקרומטר. עם מערכות ברזולוציה מאוד גבוהה, בתדירות מגבירה עד 55 מגה-הרץ וכל פיקסל הוא כ -20 מיקרומטר 20. גם מכשירים כאלה יכולים לשמש לCEU, המתארים הרבה יותר דווקא ההפצה של SCBF בparenchyma. עם זאת, המערכות ברזולוציה מאוד גבוהה הן הרבה יותר יקר.
כמה טכניקות אחרות הוצעו למדידת SCBF בSCI, אבל לכולם יש מגבלות ייחודיות. חלקם, כמו microspheres רדיואקטיבי 7,8 או autoradiography C14-iodo-antipyrine 9, דורשים הקרבת בעלי חיים. במקרים אלה, חוט השדרה חייב להיות שנקטפו לניתוח. מצד השני, טכניקת שחרור מימן 10, דורש החדרת אלקטרודה intraspinal אשר עשוי למעשה לשנות את SCBF. יתר על כן, המדידה יכולה להתבצע רק באזור מוגבל מאוד של parenchyma חוט השדרה. מיקרוסקופ אורדרך חלון השדרה גם מספקת דרך להעריך את זרימת דם, אך גישה זו יש עומק מאוד מוגבל של התבוננות. זה מאפשר רק לצפות בזרימה בעניין פיא השטחי ולא בתוך parenchyma 16.
בספרות, הערכות ב- vivo בזמן אמת של SCBF בדרך כלל מבוצעות על ידי ההדמיה דופלר לייזר 11-13. עם זאת, יש גם טכניקה זו מספר מגבלות. ראשית, מאז הלייזר הוא מ"מ פחות מ 1 בקוטר, ניתן להעריך SCBF רק בשטח מצומצם המקביל ללמחצה תחום של כ 1 מ"מ בקוטר. מאז חוט השדרה של החולדה הוא כ -3 מ"מ קוטר, השטח המצומצם של ניתוח הוא מגבלה עיקרית. יתר על כן, כפי שהראינו SCBF שבחוט השדרה בשלמות אינו הומוגנית, חשוב למדוד SCBF בשטח גדול יותר לייצוג הולם של זרימת דם לרקמות. שנית, יש לו את הלייזר לעומק מוגבל של Dete חדירה ולכןCTS SCBF השטחי. כתוצאה מכך, זה לא רק מודד SCBF parenchymal אלא גם זה של הקרום הרך (שמקיף את parenchyma). מאז מאטר פיא יש מערכת כלי דם ייחודית ואינו כפוף לאותו מנגנונים אוטומטי רגולציה ככלי parenchymal, מידע זה עשוי להיות מטעה. לבסוף, הלייזר-דופלר אינו מספק כל מידע המורפולוגי. CEU מתגבר על מגבלות אלה על ידי הצגת תמונות מורפולוגיים של החוט (B-מצב), תוך הצגת חומר הניגוד שניתן בבירור זיהה בתוך parenchyma ייחודי.
למרות יתרונות הרבים שלה לגישות אחרות, CEU יש גם כמה מגבלות שונות. מאז מדידות מבוצעות על פרוסת sagittal דו-ממדית (בדרך כלל במקביל לתעלה המרכזית), SCBF מאזורים אחרים של parenchyma אינם נגישים. יתר על כן, המידע שנוצר על ידי מגזר יחיד דו-ממדי sagittal חוט השדרה לא יכול להיות נציג של כל הכבל. Nevertheless, זה יכול להיות נשלט על ידי כמה אמצעי זהירות. ראשית, על ידי חזרה על מדידות באותו המיקום, המדידה הראשונה שנעשתה (חוט השדרה שלם) יכול לשמש כערך בסיסי. שנית, על ידי פציעה בקו האמצע בחוט השדרה (פגיעה דו-צדדית), שינויי SCBF צריכים להיות סימטריים בין השמאל לימין (נתונים שלא פורסמו). אמצעי זהירות אלה יסייעו להבטיח כי ניתוח של פרוסת sagittal היחידה הוא מספיק כדי לשקף את חלוקת האורך הגלובלית של SCBF.
העלות הגבוהה של מכונות אולטרסאונד היא מגבלה אחרת. עם זאת, קיימים מספר פתרונות למקד את הבעיה הזו. ראשית, כמה מעבדות יכולות לנהל משא ומתן הלוואה זמנית על ידי היצרן עבור הניסויים שלהם. כמכונות אולטרסאונד הן יבילים, הלוואות זמניות הן אפשריות. זו הייתה הגישה בשימוש על ידי המעבדה שלנו. לחלופין, קבוצה של מעבדות יכולה בריכת משאבים כדי לקנות את המכונה ולפצל את העלויות. אחרת, יש לי מוסדות אוניברסיטה רבים מתקני הדמיה ומכונה אולטרסאונדים יכול להיות מומלץ ככלים חיוניים. כך, יכול להיות מועברים בעלי חיים במתקן ההדמיה להערכת CEU ולאחר מכן החזירו לניסויים אחרים.
כדי להעריך שינויים בכלי הדם, חומר ניגוד (microbubbles) חייב להיות מוזרק לוריד. למרות שהצנתור של וריד הצוואר או הירך הוא חודרני ומסוכן, הוורידים נגישים בקלות ובצורה ברורה לזיהוי. לעומת זאת, הזרקה לוריד זנב הוא הרבה פחות פולשני, אבל הכלי הוא גרועים מכובד / גלוי לצנתור נכון. לכן, קיים סיכון שקצה המחט לא ממוקם כראוי בתוך הווריד או שהוא עשוי לעבור במהלך הזרקה, להתפשר הניסוי כולו. מסיבה כזו, אנחנו מעדיפים להשתמש בוריד הצוואר ולהציג את צנתר לעירוי microbubble עקבי.
עצמות חוליה מקיפות את חוט השדרה. כגלי אולטרסאונד משתקפים על ידי עצם ולא יכולים לעבור בlaminas חוט השדרה, ההדמיה דורשתהסרת עצם (laminectomy) כדי לפתוח חלון אקוסטי. הדרך הקלה ביותר כדי לפתוח את תעלת השדרה היא להסיר את הקשת האחורית של גוף החוליה דרך laminectomy. בפרוטוקול זה, אנו דורשים laminectomy ארבע רמה לדמיין קטע ארוך של חוט השדרה, כוללים המוקד, אזור הצללים ואזורים המרוחקים של חוט השדרה בשלמותה. למרות שרוב דגמי SCI ניסיוניים דורשים laminectomy (ליישום קליפ או חבלת impactor), אלה בדרך כלל מורכבים של הסרת 1-2 lamina. Laminectomy הנרחב ברמה 4 הוא מגבלה נוספת של המחקר שלנו. עם זאת, אם אחד צריך רק ללמוד את אזור מוקד הרעש והילה, laminectomy פחות נרחב יכול להתבצע ומומלץ.
לסיכום, למרות כמה מגבלות שתוארו לעיל, CEU הוא כלי שימושי להערכת שינויי SCBF ואת ההשפעה של טיפולים שונים (מטרות מחקר). בזמן אמת זה אמין,, ב- vivo הגישה אידיאלית למסתכל על טיפולים להפחתהאיסכמיה ונימק של רקמות לאחר הפוסט-SCI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C.
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H.
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
