Abstract
Riduzione del midollo spinale del flusso sanguigno (SCBF) (cioè, ischemia) svolge un ruolo chiave nel traumatico lesioni del midollo spinale (SCI), fisiopatologia e di conseguenza è un obiettivo importante per le terapie neuroprotettive. Anche se diverse tecniche sono state descritte per valutare SCBF, tutti hanno limitazioni significative. Per superare questi ultimi, si propone l'uso di immagini in tempo reale di contrasto ecografia (CEU). Qui si descrive l'applicazione di questa tecnica in un modello di ratto contusione SCI. Un catetere giugulare viene prima impiantato per l'iniezione ripetuta di mezzo di contrasto, una soluzione di cloruro di sodio di esafluoruro di zolfo microbolle incapsulate. La colonna vertebrale viene poi stabilizzato con un 3D-telaio su misura e il midollo spinale dura madre è esposta da una laminectomia a Thix-ThXII. La sonda ecografica viene quindi posizionato nel lato posteriore della dura madre (rivestito con gel ultrasuoni). Per valutare SCBF linea di base, una singola iniezione per via endovenosa (400 ml) di contraagente st viene applicato per registrare il suo passaggio attraverso l'intatto microcircolo del midollo spinale. Un dispositivo di peso-drop viene successivamente utilizzato per generare un modello riproducibile contusione sperimentale di SCI. Agente di contrasto è ri-iniettato 15 min dopo l'infortunio per valutare i cambiamenti post-SCI SCBF. CEU permette in tempo reale e in-vivo valutazione delle variazioni SCBF seguito SCI. Nel animale indenne, ecografia mostrava irregolare flusso di sangue lungo il midollo spinale intatto. Inoltre, 15 min post-SCI, c'era ischemia critica al livello dell'epicentro mentre SCBF rimasta conservata nelle zone più remote intatto. Nelle regioni adiacenti all'epicentro (sia rostrale e caudale), SCBF è stato notevolmente ridotto. Ciò corrisponde a quella precedentemente descritta "zona penombra ischemica". Questo strumento è di grande interesse per la valutazione degli effetti di terapie volte a limitare l'ischemia e la necrosi dei tessuti risultante a seguito SCI.
Introduction
Lesioni traumatiche del midollo spinale (SCI) è una condizione devastante che causa una forte compromissione motoria, sensoriale e funzioni autonome. Finora, nessuna terapia ha dimostrato la sua efficacia in pazienti. Per tale motivo, è importante individuare nuove tecniche in grado di migliorare la valutazione dei potenziali trattamenti e può chiarire ulteriormente lesioni pathiophysiology 1.
SCI è diviso in due fasi sequenziali, denominato lesioni primari e secondari. La lesione primaria corrisponde l'insulto meccanico iniziale. Considerando che i gruppi di lesioni secondarie una cascata di vari eventi biologici (come l'infiammazione, lo stress ossidativo e l'ipossia) che contribuiscono a seguito della progressiva espansione della lesione iniziale, danni ai tessuti e quindi neurologico deficit 2,3.
Nella fase acuta della SCI, terapie neuroprotettive hanno lo scopo di ridurre la patologia danno secondario e should di conseguenza migliorare i risultati neurologici. Tra i tanti eventi di lesioni secondarie, ischemia svolge un ruolo cruciale di 4,5. A livello dell'epicentro SCI, i microvasi parenchimali danneggiate ostacolano efficace midollo flusso ematico ombelicale (SCBF). Inoltre, SCBF è significativamente ridotta nella regione circostante l'epicentro lesioni, un'area particolare nota come "zona penombra ischemica". Se SCBF non può essere rapidamente ripristinata entro queste regioni, l'ischemia può portare alla necrosi parenchimale supplementare e danni ai tessuti ulteriormente nervoso. Come anche il mantenimento del tessuto minima può avere effetti sostanziali della funzione, è di grande interesse per sviluppare farmaci e terapie che possono ridurre l'ischemia post-SCI. Per evidenziare questo fenomeno, lavoro precedente ha dimostrato che la conservazione di solo il 10% degli assoni mielinizzati è stato sufficiente per consentire a piedi nei gatti post-SCI 6.
Sebbene diverse tecniche sono state descritte per valutare SCBF, lay tutti hanno limitazioni significative. Ad esempio, l'uso di microsfere radioattive 7,8 e C14-iodopyrine autoradiografia 9 richiede una successiva sacrificio di animali e non può essere ripetuta in successivi punti temporali. La tecnica di depurazione idrogeno 10 dipende l'inserimento di elettrodi intraspinali, che potrebbero danneggiare ulteriormente il midollo spinale. Mentre Doppler laser, fotopletismografia 14,15 e in vivo luce microscopia 16 hanno una molto limitata profondità / superficie di misura 11-13.
La nostra squadra ha già dimostrato che un contrasto migliori ultrasuoni (CEU) di immagini può essere utilizzato per valutare in tempo reale e in vivo i cambiamenti SCBF nel parenchima midollo spinale di ratto 17. E 'importante notare che una tecnica simile è stata applicata da Huang et al. In un modello suino di SCI 18. CEU applica una specifica modalità di imaging ad ultrasuoni che permette di associare in scala di grigi im morfologicaetà (ottenuti per B-mode convenzionale) con distribuzione spaziale del flusso di sangue 19. Imaging SCBF e la quantificazione si basa su iniezione intravascolare di agenti di eco-contrasto. L'agente di contrasto è costituito da microbolle di esafluoruro di zolfo (diametro di media circa 2,5 micron e il 90% ha un diametro inferiore a 6 micron) stabilizzata da fosfolipidi. Le microbolle riflettono il fascio di ultrasuoni emesso dalla sonda migliorando così ecogenicità sangue ed il contrasto dei tessuti secondo il loro flusso sanguigno. È quindi possibile valutare il flusso di sangue in una data regione di interesse secondo l'intensità del segnale riflesso. Le microbolle sono anche sicuro e sono stati applicati clinicamente nell'uomo. L'esafluoruro di zolfo è rapidamente cancellata (media emivita terminale è di 12 min) e più del 80% del esafluoruro di zolfo somministrato viene recuperato nell'aria espirata entro 2 minuti dopo l'iniezione. Questo protocollo fornisce un modo semplice per utilizzare CEU iminvecchiamento per valutare i cambiamenti SCBF nel ratto.
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Protocol
NOTA: I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato di Bioetica della Facoltà di Medicina Lariboisière, Parigi, Francia (CEEALV / 2011-08-01).
1. Strumento Preparazione
- Preparare e pulire i seguenti strumenti per l'inserimento del catetere: micro pinze, micro-forbici, pinza micro-vascolare, grandi forbici, filo chirurgico (intrecciata nero di seta 4-0) e un catetere 14 G. Eparinizzare il catetere con una soluzione di eparina (5.000 U / ml).
- Preparare e pulire i seguenti strumenti per la laminectomia: grandi forbici, bisturi e un cutter osso. Eseguire laminectomia con un cutter osso misura progettato per ridurre il rischio di danneggiare il midollo spinale durante la laminectomia (Figura 1).
- Set-up 3D-telaio utilizzato per il posizionamento e la stabilizzazione dell'animale. Il telaio su misura è costruito con gli elementi di un fissatore esterno Hoffman 3 in collaborazione con pinze, which è stato curvato in modo da adattarsi alla colonna lombare dell'animale.
- Preparare il dispositivo peso-drop (urto) utilizzato per lesioni del midollo spinale biomeccanico.
NOTA: Il dispositivo di occlusione su misura è stato progettato con un software 3D e stampata in 3D. - Accendere la macchina ad ultrasuoni.
- Preparare il kit per la ricostituzione del mezzo di contrasto.
NOTA: Il kit comprende 1 flaconcino contenente 25 mg di polvere liofilizzata, siringa 1 pre-riempita contenente 5 ml di cloruro di sodio e un sistema di trasferimento mini-spike (Figura 2). I passi per la ricostituzione del mezzo di contrasto sono riportate di seguito (nella sezione 5).
2. Vena giugulare cateterizzazione (Figura 3)
- Anestetizzare l'animale con il 4% isoflurano. Posto l'animale in posizione supina. Verificare il corretto anestesia facendo in modo che l'animale non risponde quando le zampe sono schiacciati con una pinza. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre under anestesia.
- Radere al collo e pulire la pelle. Fare un'incisione sulla linea mediana del collo. Ritrarre il muscolo sternocleidomastoidian al fine di trovare la vena giugulare interna. Stringere una legatura nella parte rostrale della vena.
- Applicare un morsetto microvascolare sulla vena, 1 cm sotto la legatura. Far passare un altro filo intorno alla vena, appena sotto la fascetta con il nodo pronto per essere stringere quando il morsetto viene rilasciato.
- Aprire la parete della vena (venotomia) tra il morsetto e la legatura rostrale. Introdurre un catetere 14 G nel lume della vena e spingerlo verso il cuore.
- Quando si tratta contro il morsetto, rilasciare quest'ultimo e spingere il catetere. Fissare il catetere nella vena, stringendo troppo il nodo sulla vena con il catetere all'interno.
- Valutare pervietà del catetere prelevando una piccola quantità di sangue venoso nel catetere e successivamente poi risciacquo con soluzione salina eparinizzata. Questo impedisce l'ostruzione del catheter da un potenziale coagulo di sangue.
- Collegare il tubo flessibile per il catetere per l'ulteriore iniezione di mezzo di contrasto (microbolle). Keep it chiuso (sigillato) fino al momento dell'uso.
3. Accesso alla colonna vertebrale, Laminectomy e Rat Posizionamento (in 3D-frame)
- Posto l'animale in posizione orizzontale prona piatta. Shave e pulire la parte posteriore (regione toracica) dell'animale.
- Identificare l'ultima costola (XIII nel ratto) mediante palpazione (Figura 4). Questo permette di stimare la posizione della vertebra toracica XIII (ThXIII).
- Effettuare una incisione cutanea 4 centimetri sulla linea mediana, centrata sulla ThXIII. Aprire l'incisione cutanea, nonché la borsa sottostante. Osservare il aponeurosi dei muscoli della schiena, così come le punte dei processi colonna vertebrale vertebrali.
- Localizzare con attenzione il processo di colonna vertebrale ThXIII palpando le costole XIII.
NOTA: La nervatura XIII è collegato a ThXIII e rappresenta quindi un facile da locate punto di riferimento anatomico per l'identificazione di ThXIII. Questa fase consente la localizzazione del ThXII per Thix processo spinoso e L1 e L2 (primo e secondo vertebre lombari). - Tagliare il aponeurosi muscolare e staccare i muscoli su entrambi i lati per esporre i processi spinosi, le lamine e le faccette articolari da Thix a L2. Esporre gli aspetti laterali di L1 e L2 staccando muscoli dai processi trasversali.
- Agganciare incisivi dell'animale sul 3D-frame per fissare la posizione (figura 5). Bloccare le vertebre L1 e L2 con le pinze modificati. Collegare la pinza modificati al 3D-frame al fine di stabilizzare l'animale.
- Tirare delicatamente caudale le pinze che tengono la colonna lombare al fine di rafforzare l'intera colonna vertebrale e di elevare il torace dalla panchina.
NOTA: Con la disposizione descritta l'animale deve essere in grado di respirare. Inoltre, nonostante i movimenti respiratori della gabbia toracica, la colonna vertebrale e il midollocavo deve anche rimanere immobile. - Rimuovere il processess spinoso da Thix a ThXII. Inserire delicatamente la lama inferiore della taglierina osso sotto la lamina di sinistra ThXII e chiudere la taglierina osso al fine di tagliare la lamina (figura 6).
- Ripetere la stessa manovra per la lamina destra e successivamente rimuovere l'arco posteriore. Ripetere i passaggi precedenti per la ThXI vertebre a Thix al fine di ottenere una laminectomia a quattro livelli. Rimuovere entrambi faccette articolari per ogni vertebra.
NOTA: Nel corso della procedura, pulire il campo operatorio per emorragia locale. Per questo, utilizzare tamponi di cotone e di irrigazione con soluzione salina tiepida. Emostasi avviene sistematicamente in pochi minuti.
4. CEU Probe Posizionamento
- Coprire la dura madre con gel per ultrasuoni. Ciò permette la trasmissione effettiva degli ultrasuoni tra la sonda e il midollo spinale (Figura 7).
- Stabilizzare l'arguzia sonda ecograficamorsetto ha che può essere successivamente collegata al 3D-frame da un braccio articolato. Posizionare manualmente la sonda. Assicurarsi che la sonda è orientata ad ottenere un obliquo longitudinale fetta sagittale. In una posizione corretta, il midollo spinale è strettamente orizzontale sull'immagine e il canale centrale del midollo spinale è visibile lungo l'intero segmento del midollo spinale.
NOTA: posizionamento deve essere guidata dal immagine B-mode in tempo reale visualizzato sullo schermo della macchina ad ultrasuoni. La distanza focale della sonda ecografica deve essere allineato con il canale centrale del midollo spinale. A questo punto, la faccia posteriore del midollo spinale è accessibile che alla fine permettere il posizionamento del dispositivo di simulazione. - Quando ottimale, bloccare il braccio snodato per stabilizzare la posizione.
5. Preparazione di contrasto Agent - microbolle Ricostituzione
- Utilizzando il contenuto di un kit commerciale ricostituzione e collegare lo stantuffo fissandolo tightly nella siringa (in senso orario). Aprire la confezione del sistema di trasferimento e rimuovere il tappo dell'ago della siringa. Aprire il tappo del sistema di trasferimento e connettere la siringa al sistema di trasferimento (serrare ermeticamente).
- Rimuovere il disco protettivo dal flaconcino. Inserire il flaconcino nel manicotto trasparente del
- sistema di trasferimento e premere con decisione per bloccare il flaconcino nella sua sede.
- Svuotare il contenuto della siringa nel flaconcino spingendo lo stantuffo. Agitare energicamente per 20 secondi per miscelare tutto il contenuto nel flacone di ottenere un latte liquido omogeneo bianco.
- Capovolgere il sistema ed estrarre con attenzione l'agente di contrasto nella siringa. Svitare la siringa dal sistema di trasferimento. Dopo ricostituzione (come indicato), 1 ml della dispersione prodotta contiene 8 microlitri di esafluoruro di zolfo nelle microbolle. Tracciare la sospensione di microbolle in una siringa 100 ml. Inserire la siringa 100 ml nella pompa elettrica. Chiudere il coperchio.
- Avviare costante agitazione del remicrobolle costituite. Ottenuto agitazione costante per lenta rotazione della siringa, che mantiene la sospensione di microbolle. Collegare la pompa al catetere giugulare attraverso il tubo flessibile. Impostare la macchina ad ultrasuoni "Modo Armonico".
NOTA: Quest'ultimo corrisponde al modo in cui le microbolle possono essere specificamente rilevati e visualizzati. Questa modalità ha un basso indice meccanico, che non distrugge le microbolle in contrapposizione alla B-mode. - Eliminare il catetere infondendo una prima dose (400 ml) di mezzo di contrasto. Durante questa prima infusione, controllare che le microbolle appaiono sullo schermo ultrasuoni. Questo conferma che l'intero circuito (dalla siringa al sangue del ratto) è intatto e aperta.
- Impostare la macchina ultrasuoni per "B-mode" per visualizzare il parenchima del midollo spinale e la distruzione dei pochi microbolle rimanenti nel flusso sanguigno. L'alta frequenza del "B-Mode" tranalta energia smits alle microbolle, che permette loro di ripartizione.
- Lasciate che l'animale rimase immobile per circa 30 min. Questo periodo permette la stabilizzazione dei parametri emodinamici.
6. Valutazione SCBF nel midollo spinale Intact
- Impostare la macchina ad ultrasuoni per il "Modo Armonico". Avviare simultaneamente (1) infusione di mezzo di contrasto (400 microlitri) e (2) il cronometro.
NOTA: Durante l'infusione, la concentrazione di microbolle nel sangue aumenta, consentendo l'immaginazione contrasto del midollo spinale (Figura 8). Poiché le microbolle sono rapidamente distrutti, la concentrazione nel sangue di microbolle inizia a diminuire dopo l'iniezione è terminata che genera una progressiva diminuzione visualizzazione contrasto del midollo spinale. - Dopo 1 minuto, selezionare (premere) il pulsante "Store Clip" sulla macchina ad ultrasuoni. Ciò consentirà uno per salvare 1 min di raw dati ultrasuoni e la registrazione del video immagini (che precedentemente era visualizzata sullo schermo ultrasuoni).
- Impostare la macchina ad ultrasuoni di "B-Mode". Ciò elimina i rimanenti microbolle.
7. SCI sperimentale
- Utilizzando il micromanipolatore collegata al 3D-frame, posizionare il dispositivo peso goccia impaction modo che la punta del dispositivo di simulazione viene a contatto con la dura madre (sulla linea mediana del midollo spinale), alla giunzione tra THX e ThXI (Figura 9) .
NOTA: Questo livello dovrebbe corrispondere al centro del segmento del midollo spinale osservato con dispositivo ad ultrasuoni. L'attaccante e il corpo del dispositivo d'urto sono 8 mm di diametro. La punta del dispositivo di simulazione, che genererà la ferita, è di 3 mm di diametro. - Posizionare l'attaccante del dispositivo compressione in una posizione 10 centimetri alto. Indurre il SIC sperimentale rilasciando l'attaccante del dispositivo impatto. L'attaccante cade e rilascia the di simulazione, ferendo il midollo spinale. L'occlusione misura fornisce un effetto equivalente ad un peso di 10 g lasciata cadere da un'altezza di 10 cm.
8. Valutazione della SCBF 5 min post-SCI
- Ripetere i passaggi descritti nella sezione 6 (Valutazione della SCBF). Le microbolle saranno in grado di passare attraverso il microcircolo danneggiata e l'epicentro ferita rimarrà scuro (Figura 10).
9. sacrificio animale
- Euthanize l'animale con iniezione letale intraperitoneale di pentobarbital (100 mg).
10. La quantificazione di SCBF da Analysis Offline
- Avviare il software Ultra-Extend impiegati per la quantificazione (in macchina ad ultrasuoni). Selezionare "file" e quindi selezionare i dati grezzi precedentemente salvati e aprire i file associati. Attivare la "modalità di quantificazione" premendo (selezione) il tasto "Chi Q". Select "Set ROI" (pulsante) e scegliere la forma circolare.
- Selezionare "Draw ROI" (pulsante) e disegnare sette regioni circolari adiacenti di interesse (ROI) sul midollo spinale (Figura 11). Aprire il menu "Montaggio" e scegliere la funzione "Valore Curve". Osservare il software visualizzando diverse curve, ciascuna corrispondente alle variazioni di concentrazione microbolle all'interno di una ROI.
NOTA: Ogni curva ha un profilo "perfusione-deperfusion". La prima fase della curva è piatta e corrisponde al periodo prima dell'arrivo di microbolle. Nella seconda fase, la concentrazione di microbolle aumenta rapidamente a causa della infusione. Nella terza fase, che inizia quando l'infusione è completo, la concentrazione di microbolle diminuisce progressivamente quando queste disintegratse nel sangue. - Posizionare la prima linea verticale all'inizio della seconda fase del cUrve e selezionare "SET". Questo informa il software da dove cominciare l'analisi.
- Posizionare la seconda linea verticale alla fine della registrazione e selezionare nuovamente "SET". Questo informa il software dove fermarsi analisi.
- Guarda il menu "CV" e registrare il valore "AUC", che corrisponde al "Area sotto la Curva" analizzata. Questo valore è proporzionale alla SCBF all'interno della corrispondente ROI.
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Representative Results
Con il protocollo descritto sopra, è possibile mappare la SCBF lungo longitudinale midollo spinale segmento sagittale.
Nel midollo spinale intatto, sembra esserci irregolarità SCBF all'interno del parenchima (Figura 12). Questo può essere spiegato con la ripartizione variabile delle arterie radiculo midollare (RMA) da un animale all'altro. RMA si riferisce a segmentale arterie che raggiungono l'arteria spinale anteriore (ASA) e quindi fornire apporto di sangue al parenchima del midollo spinale. Al contrario, le arterie radicolari corrispondono segmentale arterie, che non raggiungono l'ASA e pertanto non offrono midollo spinale apporto di sangue. Pertanto, in segmenti del midollo spinale in cui la RMA anastomosi con l'ASA, non vi è più il flusso di sangue (come mostrato nei nostri risultati).
Dopo SCI, imaging CEU in tempo reale mostra un deficit in circolazione all'epicentro infortunio. L'epicentro rimane (nessun segnale di contrasto) scuro,in quanto non vi è alcun flusso di sangue attiva. Analisi più dettagliata del flusso sanguigno utilizzando diversi ROI mostra tre territori flusso sanguigno unici. Innanzitutto, a livello dell'epicentro, il flusso di sangue è il più basso con una riduzione media di circa -90%. In secondo luogo, nei territori adiacenti all'epicentro (sia rostrale e caudale), SCBF stato anche significativamente diminuito (da -50% a -80%). In terzo luogo, nelle zone più remote corrispondenti a tessuto intatto, SCBF è conservato. La seconda regione corrisponde alla "zona di penombra ischemica", che dovrebbe essere il bersaglio di potenziali terapie neuroprotettive. La possibilità di visualizzare facilmente e quantificare SCBF modifica post-SCI è utile per valutare l'efficienza di terapie volte a ridurre l'ischemia tissutale, e sottolinea quindi l'importanza di questa tecnica (Figura 13).
Figura 2. Rappresentazione schematica del kit per microbolle ricostituzione e la Vueject ° pompa utilizzata per microbolle infusione. Il sistema di trasferimento consente la consegna di microbolle e soluzione salina tra il flaconcino e la siringa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. giugulare catetere. Il catetere deve essere inserito nella vena giugulare, poi spinto verso il cuore e, infine, fissare con un nodo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Metodo per la corretta individuazione dei livelli vertebrali. Nel ratto, l'ultima costola è collegato alla vertebra XIII. Quest'ultimo può essere palpato attraverso la pelle come punto di riferimento per l'ultima vertebra toracica, la XIII. I muscoli sono staccati su entrambi i lati delle apofisi spinose. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Stabilizzazione dell'animale in 3D-fotogramma. (1) I denti incisivi sono agganciati sul telaio, mentre il primo e secondo vertebre lombari (L1 e L2) sono fissati con una pinza misura. (2) La colonna lombare è un po 'stretto che stabilizza l'animale ed eleva il torace dalla panchina, consentendo in tal modo i movimenti respiratori liberi senza movimenti della colonna vertebrale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Dettagli tecnici della laminectomia. In primo luogo, la sottile lama del cutter osso misura viene passato sotto la lamina senza danneggiare il midollo spinale. Poi la taglierina osso è chiuso, che cUTS e rimuove una parte della lamina. La procedura viene ripetuta su entrambi i lati e da ThXII al TxIX per ottenere un laminectomia quattro livelli. Infine, le faccette articolari sono anche rimossi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Posizionamento della sonda ecografica e il dispositivo di occlusione. La sonda è parallela al midollo spinale e leggermente obliqua (20-30 °), in modo che il dispositivo di simulazione del peso goccia può essere posta contro la faccia posteriore della dura. Il midollo spinale dovrebbe essere visibile con il canale centrale presente in tutto il segmento centrale del ecografica "B-Mode". Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Figura 8. Contrast Imaging del midollo spinale intatto. Le successive figure in modalità di contrasto (immagini colorate arancioni) mostrano come il mezzo di contrasto (microbolle) appare progressivamente dopo l'infusione, rafforzando in tal modo il contrasto del midollo spinale. Bolo infusione dura circa 10 secondi e il dato di contrasto è stata registrata per 1 min. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. Variazioni B-mode seguenti SCI sperimentale. Una lesione iperecogena appare all'interno del parenchima, corrispondente a quella iniziale parenchimale h emorrhage post-SCI. Istologia (colorazione H & E): I risultati emorragia massiva rottura traumatica dei piccoli vasi sanguigni che portano il sangue al stravaso nel parenchima (scala giallo bar = 2,000 micron). Il dispositivo occlusione è mostrato sulla destra. L'attaccante è rilasciato da una altezza 10 centimetri e si scontra con la simulazione che genera poi la lesione del midollo spinale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10. Imaging Contrast 15 min post-SCI. Simile alla figura 8, le microbolle sono visibili quando passano attraverso il microcircolo del midollo spinale. All'epicentro (asterisco), il flusso di sangue è ostruito dalla rottura microvascolare.10large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 11. Protocollo per SCBF quantificazione. Con software ultra-Extend, sette regioni circolari e adiacenti di interesse (ROI) sono disegnati l'immagine del midollo spinale longitudinale. Il primo ROI è posto sul epicentro lesioni. In ogni ROI, il software genera una curva perfusione-deperfusion e calcola l'area sotto la curva. Questo valore è correlato con il flusso di sangue in questa zona. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 12. L'eterogeneità del flusso sanguigno lungoil midollo spinale. Questi grafici visualizzare l'eterogeneità del midollo spinale flusso sanguigno e la variabilità tra animali. Questo può essere in gran parte spiegato con l'anatomia vascolare del midollo spinale. Tuttavia, a causa della eterogeneità e anatomia vascolare variabile, si deve utilizzare misurazioni del flusso sanguigno (da ogni ROI) prima di lesioni come riferimento. Le misurazioni effettuate nei seguenti punti temporali (post-SCI) sono espressi come percentuale cambiamento della linea di base. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 13. Variazioni midollo flusso ematico ombelicale (SCBF) indotta dalla lesione spinale sperimentale (SCI). 15 min dopo SCI c'è ischemia critica al livello dell'epicentro mentre SCBF rimasto priservato nelle aree intatte più remote. Nelle regioni adiacenti l'epicentro (sia rostrale e caudale), SCBF è significativamente ridotta. Ciò corrisponde a quella precedentemente descritta "zona di penombra ischemica". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se abbiamo descritto come utilizzare CEU in un ratto SCI modello di contusione, questo protocollo può essere modificato per adattarsi altri obiettivi sperimentali o modelli SCI. Abbiamo scelto di misurare SCBF a soli due punti di tempo (prima della ferita e 15 min post-SCI), tuttavia il numero di punti di tempo e il ritardo tra le misurazioni SCBF possono essere adattati per soddisfare le esigenze di altri studi. Ad esempio, nel nostro precedente lavoro 17, abbiamo misurato SCBF in cinque punti temporali successive durante la prima ora dopo SCI. E 'importante notare che nel gruppo sham (senza SIC), siamo rimasti sorpresi di osservare una progressiva diminuzione SCBF. Mentre inizialmente temuto che ripetuta infusione microbolle potrebbe danneggiare il sistema vascolare del midollo spinale, ulteriori sperimentazioni (dati non pubblicati) ha confermato che questi cambiamenti sono stati causati da alterazioni progressive in condizioni fisiologiche del tessuto locale (temperatura, idratazione) indotti dal laminectomia, così come la prolungata esposizione di tlui DURA e tessuti circostanti per l'aria ambiente e il gel per ultrasuoni. Questi problemi sono comuni in tutti gli esperimenti che trattano microcircolazione, come la circolazione è estremamente sensibile a molti parametri e quindi soggetta a vascoconstriction o vasodilatazione. Pertanto, si consiglia che il periodo durante il quale la ferita chirurgica rimane aperto sia il più breve possibile. Se sono necessarie più misurazioni SCBF per un periodo prolungato, sarebbe preferibile chiudere l'incisione, fra le acquisizioni al fine di ripristinare condizioni fisiologiche intorno e all'interno del midollo spinale.
È anche possibile modificare la forma, le dimensioni, la posizione e il numero di ROI per l'analisi SCBF. Uno dei principali vantaggi di CEU è che le misurazioni possono essere effettuate in qualsiasi momento dopo il completamento sperimentale elaborando i dati registrati offline. È anche possibile ripetere le misurazioni o modificare le impostazioni di misura / standard se necessario.
Risoluzione spaziale di ecografia è proporzionale alla frequenza delle onde ultrasoniche. Più alta è la frequenza ultrasonica, migliore è la risoluzione spaziale. Abbiamo utilizzato un elevatocon frequenza (12-14 MHz) sonda, che fornisce un'immagine con una risoluzione pixel di circa 100 micron. Con i sistemi ad altissima risoluzione, la frequenza aumenta fino a 55 MHz e ogni pixel è circa 20 micron 20. Tali dispositivi possono essere utilizzati anche per CEU, che raffigurano molto più precisamente la distribuzione del SCBF nel parenchima. Tuttavia, i sistemi ad altissima risoluzione sono molto più costosi.
Diverse altre tecniche sono state proposte per misurare SCBF a SCI, ma tutti hanno limitazioni unici. Alcuni, come microsfere radioattive 7,8 o autoradiografia C14-iodo-antipirina 9, richiedono sacrificio animale. In questi casi, il midollo spinale deve essere raccolto per l'analisi. D'altra parte, la tecnica di depurazione idrogeno 10, richiede inserimento dell'elettrodo intraspinale che può effettivamente modificare il SCBF. Inoltre, la misurazione può essere effettuata solo in una regione molto ristretta del parenchima del midollo spinale. La microscopia otticaattraverso una finestra vertebrale fornisce anche un modo per valutare la microcircolazione, ma questo approccio ha una profondità molto ristretta di osservazione. Esso consente solo di osservare la circolazione della sostanza superficiali pia e non all'interno del parenchima 16.
Nella letteratura, in tempo reale in vivo valutazioni SCBF sono di solito eseguite da laser Doppler Imaging 11-13. Tuttavia, anche questa tecnica ha diversi limiti. In primo luogo, dato che il laser è inferiore a 1 mm di diametro, SCBF può essere valutato solo in un'area molto ristretta corrispondente ad una semisfera di circa 1 mm di diametro. Poiché il midollo spinale del ratto è di circa 3 mm di diametro, la zona limitata di analisi è un vincolo importante. Inoltre, come abbiamo dimostrato che SCBF nel midollo spinale intatto non è omogenea, è importante misurare SCBF in un'area più grande per una corretta rappresentazione del microcircolo tissutale. In secondo luogo, il laser ha una limitata profondità di penetrazione e quindi deteCts SCBF superficiale. Come risultato, esso non solo misura parenchimale SCBF ma anche quella della pia madre (che circonda il parenchima). Poiché la pia ha un sistema vascolare unico e non è soggetta agli stessi meccanismi di autoregolazione come vasi parenchimali, queste informazioni possono essere fuorvianti. Infine, il laser-Doppler non fornisce alcuna informazione morfologica. CEU supera queste limitazioni visualizzando immagini morfologiche del cavo (B-mode), pur presentando univoco il mezzo di contrasto che può essere chiaramente identificato nel parenchima.
Nonostante i suoi molti vantaggi per altri approcci, CEU ha anche alcune limitazioni distinte. Poiché le misure sono effettuate su una fetta sagittale bidimensionale (generalmente parallela al canale centrale), SCBF da altre regioni del parenchima sono inaccessibili. Inoltre, le informazioni generate da un singolo segmento del midollo spinale sagittale bidimensionale può non essere rappresentativo dell'intero cavo. Nevertheless, questo può essere controllata da diversi precauzioni. Innanzitutto, ripetendo misurazioni nella stessa posizione, la prima misurazione effettuata (intatto midollo spinale) può essere usato come valore di base. In secondo luogo, ferendo alla linea mediana del midollo spinale (lesione bilaterale), i cambiamenti SCBF dovrebbero essere simmetrici tra destra e sinistra (dati non pubblicati). Queste precauzioni aiutano ad assicurare che l'analisi del singolo fetta sagittale è sufficiente per riflettere la distribuzione longitudinale globale di SCBF.
L'alto costo di macchine a ultrasuoni è un altro limite. Tuttavia, esistono diverse soluzioni per indirizzare questo problema. In primo luogo, alcuni laboratori possono negoziare un prestito temporaneo dal produttore per i loro esperimenti. Come macchine ad ultrasuoni sono trasportabili, prestiti temporanei sono possibili. Questo è stato l'approccio utilizzato dal nostro laboratorio. In alternativa, un gruppo di laboratori in grado di unire le risorse per acquistare la macchina e dividere i costi. In caso contrario, molte istituzioni universitarie dispongono di servizi di imaging e macchina ad ultrasuonis può essere raccomandato come strumenti essenziali. Così, gli animali possono essere trasportati la possibilità di imaging per la valutazione CEU e poi portato indietro per altri esperimenti.
Per valutare i cambiamenti vascolari, di contrasto (microbolle) deve essere iniettato per via endovenosa. Sebbene cateterizzazione della vena giugulare o femorale è invasivo e rischioso, le vene sono facilmente accessibili e chiaramente identificabile. Al contrario, l'iniezione coda vena è molto meno invasiva, ma la nave è poco distinto / visibile per una corretta cateterizzazione. Pertanto, vi è il rischio che l'ago non venga correttamente posizionata all'interno della vena o che possa muoversi durante l'iniezione, compromettendo l'intero esperimento. Per tale motivo, si preferisce usare la vena giugulare ed introdurre un catetere per infusione costante microbolle.
Vertebre circondano il midollo spinale. Come ultrasuoni vengono riflessi da osso e non possono passare attraverso le lamine del midollo spinale, imaging richiederimozione ossea (laminectomia) per aprire una finestra acustica. Il modo più semplice per aprire il canale vertebrale è quello di rimuovere l'arco posteriore della vertebra attraverso una laminectomia. In questo protocollo, abbiamo bisogno di un laminectomia quattro livelli per visualizzare un lungo segmento del midollo spinale, tra cui l'epicentro, la zona di penombra e zone remote del intatte midollo spinale. Sebbene la maggioranza dei modelli sperimentali SCI richiede una laminectomia (per l'applicazione clip o di simulazione contusione), questi di solito sono costituiti da rimuovere 1-2 lamina. L'ampio 4 livelli laminectomia è un altro limite del nostro studio. Tuttavia, se uno ha bisogno solo di studiare la zona dell'epicentro e penombra, una meno ampia laminectomia può essere fatto ed è consigliato.
In conclusione, nonostante le numerose limiti sopra descritti, CEU è un utile strumento per valutare i cambiamenti SCBF e l'effetto di varie terapie (scopi di ricerca). Questo affidabile, in tempo reale, in vivo approccio è ideale per guardare trattamenti per ridurreischemia e conseguente necrosi dei tessuti post-SCI.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
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